苯乙酰谷氨酰胺作為健康性老化的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】使用基于NMR/MS的代謝組學(xué)和靶向脂質(zhì)組學(xué)方法，本發(fā)明人在包括百歲老人、較年長者和年輕成年人的群組中研究了老化和長壽的代謝表型。本發(fā)明人鑒定了針對降低的老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生風(fēng)險的生物標(biāo)志物，提出使用苯乙酰谷氨酰胺(PAG)作為生物標(biāo)志物診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的體外方法。
【專利說明】苯乙酰谷氨酰胺作為健康性老化的生物標(biāo)志物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一般涉及健康生活方式和年齡相關(guān)慢性病癥的預(yù)防。特別地，本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物及其在檢測生活方式的改善中的應(yīng)用。由此，本發(fā)明提供例如苯乙酰谷氨酰胺(PAG)作為生物標(biāo)志物，還提供使用該生物標(biāo)志物苯乙酰谷氨酰胺診斷生活方式的方法，其中所述生活方式允許延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥。

【背景技術(shù)】
[0002]老化被定義為:時間依賴性的功能性能力(funct1nal capacity)和壓力抵抗(stress resistance)的下降,與增加的發(fā)病和死亡風(fēng)險相關(guān)。此外，人類的老化表型具有非常大的異質(zhì)性，可以描述為因各種各樣環(huán)境的、隨機的和遺傳-后生的變量的相互作用引起的復(fù)雜鑲嵌(complex mosaic)。幾十年的老化研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與老化過程相關(guān)的數(shù)百個基因和許多生物學(xué)過程，但是同時，許多基本問題仍未回答、或是激烈爭議的對象。
[0003]這些問題常常不能通過檢查單個基因或單個途徑來解決，但是可以在系統(tǒng)水平得到較好的解決，體現(xiàn)了老化是一個復(fù)雜的多因素過程。此外，老化可以伴有慢性的低度炎性狀態(tài)，該狀態(tài)因促炎和抗炎過程之間的失衡引起，是一種致病性狀況，已經(jīng)被揭示在主要的年齡相關(guān)慢性疾病如動脈粥樣硬化、2型糖尿病和神經(jīng)變性的發(fā)病中具有關(guān)鍵性。
[0004]在此看法中，后天獲得的健康老化和長壽可能不僅反映了較低的炎性反應(yīng)累積傾向，也反映了有效的抗炎網(wǎng)絡(luò)發(fā)育。此外，越來越多地意識到腸道微生物群(miCTob1ta)的變化因其對宿主哺乳動物系統(tǒng)的影響而具有重要性，腸道微生物群已經(jīng)在幾種疾病如胰島素抗性、克羅恩氏病、腸易激惹綜合征、肥胖和心血管疾病的病因?qū)W中展示了直接的影響。
[0005]代謝組學(xué)(Metabonomics)現(xiàn)今被認(rèn)為是表征代謝表型的一種成熟系統(tǒng)方法，代謝表型由針對各種內(nèi)在和外在參數(shù)的協(xié)同生理學(xué)反應(yīng)引起，所述參數(shù)包括環(huán)境、藥物、飲食模式、生活方式、遺傳和微生物組(mic1b1me)。與基因表達(dá)和蛋白組數(shù)據(jù)指示生理學(xué)改變的可能性不同，代謝物及其濃度在細(xì)胞、組織和器官中的動力學(xué)變化是生理調(diào)節(jié)過程的真正終點。
[0006]代謝物組學(xué)(Metabolomics)已經(jīng)成功地應(yīng)用于小鼠、狗和非人靈長類動物中研究營養(yǎng)干預(yù)后老化過程的調(diào)節(jié)(包括卡路里限制誘導(dǎo)的代謝變化)。特別地，在犬群中腸道微生物群(miCTob1ta)代謝的顯著改變與老化相關(guān)。盡管有這些發(fā)現(xiàn)，但是對影響老化過程的分子機制的全面描繪尚未見報道。此外，仍然缺少對長壽的代謝表型研究。
[0007]因此，本發(fā)明的目的是，向本領(lǐng)域提供可以非侵入式地進行檢測且允許對如下生活方式作出診斷的生物標(biāo)志物，所述生活方式可能允許健康性老化，且尤其允許延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過獨立權(quán)利要求的主題，他們能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的。從屬權(quán)利要求進一步拓展本發(fā)明的構(gòu)思。
[0009]在尿中使用組合的整體1H核磁共振(NMR)光譜學(xué)，在血清中使用靶向質(zhì)譜(MS)和脂質(zhì)組學(xué)(Iipidomic)方法，本發(fā)明人可以在包括百歲老人、較年長者和年輕成年人的一個明確限定的老化群組中檢測代謝譜的改變。
[0010]所選的老化組是意大利北部的一個限制性地理區(qū)域中的均質(zhì)群體，包括年輕成年人(平均31歲)、較年長者(70歲)和百歲老人(100歲)。在這三個老化組中，百歲老人是公認(rèn)的健康性老化和長壽的模型[Sansoni P,等，Exp Gerontol.2008 ；43:61-65 ；Franceschi C，等，Mech Ageing Dev.2007 ; 128:92-105 ;Cevenini E,等，Expert OpinB1l Ther.2008 ;8:1393-1405]。他們后天獲得的成功老化似乎是由促炎力和抗炎力之間的最佳平衡驅(qū)動的[Franceschi C，等，Mech Ageing Dev.2007 ; 128:92-105]。
[0011]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在較年長者和百歲老人的表型之間存在顯著差異，其中腸道微生物群和宿主之間相互作用的動力學(xué)以及中性平衡的炎癥反應(yīng)在長壽表型中要顯著得多。
[0012]本發(fā)明人通過使用互補的NMR-MS代謝物組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)(Iipidomic)方法，在尿和血清兩者中表征了老化和長壽的代謝表型(代謝型，metabotype)。
[0013]因為獨特的延遲疾病和傷殘進入其生命后期歲月的能力，百歲老人達(dá)到人類壽命的最極限。經(jīng)典臨床參數(shù)(表I)顯示，百歲老人具有非常低的胰島素抗性發(fā)生率，具有對于其年齡而言最佳的人體測量值(BMI)、代謝值(膽固醇、LDL-C、HDL-C、甘油三酯)。此外，使用簡易精神狀態(tài)檢查表(MMSE)測量了他們的認(rèn)知功能，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重認(rèn)知衰退的低發(fā)生率。
[0014]特別地，百歲老人表現(xiàn)出獨特的代謝表型。尿的代謝譜分析揭示了，長壽表型受到腸道微生物組的高度影響，表現(xiàn)出更高的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和對甲酚硫酸(PCS)排泄。本發(fā)明人提出，腸道微生物群大量代謝蛋白質(zhì)和芳族氨基酸，包括苯丙氨酸和酪氨酸，以形成苯乙酰谷氨酰胺和對甲酚硫酸。
[0015]基于MS的靶向代謝組學(xué)綜合分析揭示了血清中與長壽和健康性老化相關(guān)的重要生物學(xué)改變。此外，三個年齡組之間，百歲老人是具吸引力的用于表征的長壽模型，因為獨特的延遲疾病和傷殘進入其生命后期歲月的能力，他們達(dá)到人類壽命的最極限。在老化進程中，本發(fā)明人觀察到溶血磷脂酰膽堿(LPC 18:2, LPC 20:4)的降低，其濃度在百歲老人中降低更多。尤其是，LPC 18:0的減少看上去是百歲老人所特有的。盡管有必要注意到LPC基于脂肪酸鏈長和飽和度具有不同種類，其生理學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)不同，但是磷脂類通常是促炎性的[Aiyar N,等，Mol Cell B1chem.2007 ;295:113-120]，具有導(dǎo)致動脈粥樣硬化的性質(zhì)[Schmitz G,等，Atherosclerosis.2010 ;208:10-18],常常在2型糖尿病患者中見到其水平增加[Rabini RA,等，Diabetes.1994;43:915-919]。
[0016]相對于較年長者，百歲老人表現(xiàn)出幾種?；裀C濃度的平衡改變，其中三種PC，即PC-O 34:3,PC-O 36:4和PC-O 40:1的含量顯著降低，而兩種醚PC，S卩PC-O 32:1和PC-O34:1顯著更高。盡管對醚磷脂的生理學(xué)作用了解較少，但是含有連接sn-Ι脂族鏈至甘油主鏈的乙烯基醚鍵的縮醛磷脂是豐度最大的醚磷脂。在此，酰基醚磷脂酰膽堿類分子的水平差異可能由處理氧化損傷方面的差異造成。
[0017]在年齡進程中，觀察到鞘磷脂(SM)類分子的增加，其中SM 24:1和51116:0明顯地增加。但是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在百歲老人中SM24:0和SM-0H22:1濃度的特異性降低。SM類分子是重要的細(xì)胞膜組成成分，在構(gòu)建、代謝和運輸中與膽固醇緊密結(jié)合，富集在脂筏中。SM的生理學(xué)作用仍不清楚，先前的研究顯示了升高的SM水平和動脈粥樣硬化之間的關(guān)系[Kummerow FA,等，J Nutr B1chem.2001 ; 12:602-607],而其它研究顯不血衆(zhòng)鞘憐脂水平與增加的CVD事件風(fēng)險無關(guān)。最后，盡管大多數(shù)二?；字Ｄ憠A類分子(PC-O)的水平?jīng)]有顯著改變，但百歲老人表現(xiàn)出單獨PC-O 36:2水平的改變。
[0018]PC和PC-O含量的變化影響花生四烯酸代謝物合成(前列腺素、血栓素、白三烯)的活性，這些代謝物是宿主生理反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)和調(diào)節(jié)劑，參與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和免疫及炎癥功能的調(diào)節(jié)。事實上，百歲老人還顯示出具有抗炎和促炎性質(zhì)的脂質(zhì)介質(zhì)的獨特平衡網(wǎng)絡(luò)。
[0019]與較年長者相比，觀察到更高濃度的白三烯類分子LTB-4和LTE-4。百歲老人展示出更高水平的15-羥基-二十碳四烯酸(15-HETE)——15-脂加氧酶(15-L0X)的主要產(chǎn)物。15-HETE抑制5-脂加氧酶形成，減少白三烯B4和12-HETE的產(chǎn)生，抑制免疫反應(yīng)。與較年長者相比，在百歲老人中還觀察到CYP途徑活化的增加，其中8，9-EpETrE產(chǎn)生增加而11，12-DiHETrE的濃度降低。EpETrE是心臟和心外組織中許多細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要成分。研究已經(jīng)證實，EpETrEs通過抑制核因子(NF) - κ B介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的激活而表現(xiàn)出抗炎作用。此外，它們還在血管系統(tǒng)中顯示出溶血栓和血管發(fā)生性質(zhì)。EpETrEs可以被可溶性環(huán)氧化物水解酶(sEH)進一步代謝為二羥基-二十碳三烯酸(DiHETrE)。
[0020]一般，當(dāng)EpETrE被sEH代謝為DiHETrEs時，它們的生物學(xué)活性將變得較不顯著，因此，在此11，12-DHET濃度的降低可能揭示了減少的sHl對其前體11，12-EpETrE的作用。
[0021]百歲老人顯示出9_H0DE(—種生物學(xué)活性分子，脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物)和9_氧代-HODE(亞油酸的穩(wěn)定氧化產(chǎn)物，當(dāng)氧化應(yīng)激增加時，其產(chǎn)生增加)的明顯降低。大多數(shù)亞油酸以PC和膽固醇亞油酸脂的酯化形式存在，兩者均是LDL的主要成分，并持續(xù)暴露于許多類型氧化應(yīng)激以產(chǎn)生氫氧(hydroxy)和過氧氫(hydroperoxy)類分子。
[0022]增加水平的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，例如9-氧代-ODE先前曾在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化的患者血漿樣品中被檢測到。
[0023]此外，與較年長者相比，百歲老人顯示出二十碳五烯酸(EPA)的耗竭。盡管在人體中EPA可以從α -亞油酸合成、或以更大的量直接從含油魚或魚油補充物獲得，但是EPA可以轉(zhuǎn)化為η-3類二十烷酸，其具有多種多樣的功能。EPA的耗竭可能反映了 η-3類二十烷酸的生物合成增加。
[0024]因此，本發(fā)明部分地涉及診斷生活方式的方法，所述生活方式允許延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性疾病，所述方法包括:
[0025]_從受:試者獲得尿樣品；
[0026]-確定樣品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的水平，和
[0027]-將受試者的PAG水平與預(yù)定參考值比較，
[0028]其中預(yù)定參考值以對照群體中的平均尿PAG水平為基礎(chǔ)，其中相比于該預(yù)定參考值，樣品中升高的尿PAG水平指示延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥的可能性增加。
[0029]本方法具有例如其為非侵入式的優(yōu)點?？梢栽隗w外尿樣品中實施該方法。
[0030]樣品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)水平可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式進行檢測和定量。例如，可以使用質(zhì)譜如UPLC-ES1-MS/MS或NMR譜如1H-NMR譜。兩種方法都在實施例中給出。其它方法，例如其它光譜方法、色譜方法、標(biāo)記技術(shù)、或定量化學(xué)方法也可以使用。
[0031]預(yù)定參考值以對照群體中平均尿PAG水平為基礎(chǔ)。對照群體可以是至少3個，優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少50個具有相似遺傳背景、年齡和平均健康狀況的人組成的群體。
[0032]對照群體也可以是相同個體，由此預(yù)定參考值為先前從相同受試者獲得的值。這將例如允許直接比較目前的生活方式和先前的生活方式，可以直接評估生活方式的改善。
[0033]典型的老化相關(guān)慢性炎性病癥是本領(lǐng)域熟知的。大部分的老化表型可以通過炎性和抗炎網(wǎng)絡(luò)之間的失衡來解釋，該失衡導(dǎo)致老化的低度慢性促炎狀態(tài)，〃inflamm-ageing〃(Candore G.,等,B1gerontology.20100ct ；11 (5):565-73)。
[0034]典型的老化相關(guān)炎性病癥有:例如,動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、癡呆、2型糖尿病、骨質(zhì)疏松和心血管疾病。例如，對于這些病癥，炎癥被視為是連接老化和年齡相關(guān)病理過程的分子改變的可能潛在基礎(chǔ)(Chung 等，ANT1XIDANTS&REDOX SIGNALING, Volume 8, Numbers3&4, 2006, 572-581)。
[0035]對于本發(fā)明的目的，苯乙酰谷氨酰胺(PAG)可以作為唯一標(biāo)志物使用。
[0036]盡管對于本發(fā)明診斷方法而言苯乙酰谷氨酰胺(PAG)作為唯一標(biāo)志物是有效工具，但是如果診斷依賴于一個以上標(biāo)志物，則可以提高所述診斷的質(zhì)量和/或預(yù)測力。
[0037]因此，可以與苯乙酰谷氨酰胺(PAG)組合使用一種或多種用于延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥的可能性的其它標(biāo)志物。
[0038]本發(fā)明人驚奇地觀察到，也可以使用對甲酚硫酸(PCS)作為標(biāo)志物檢測延遲和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥的可能性。
[0039]因此，本發(fā)明方法可以進一步包括確定樣品中對甲酚硫酸(PCS)的水平，并將受試者的PCS水平與預(yù)定參考值比較。該預(yù)定參考值可以基于對照群體中的平均尿PCS水平。相對于預(yù)定參考值，樣品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示，延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性增加。
[0040]如果尿PCS和PAG兩者的水平都升高，則強烈指示延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性增加。
[0041]本發(fā)明方法可以另外地或備選地用于診斷允許健康和/或更健康的老化的生活方式。
[0042]可以通過將實際的PAG和/或PCS水平與先前從相同個體獲得的預(yù)定參考值比較，診斷更健康的老化。因此，在將相同受試者用作對照群體的情況下，可以直接觀察生活方式的改善，從而消除了在其它平均對照群體中由稍微不同的條件而引起的不確定性。
[0043]本發(fā)明方法還可以用于診斷長壽；和/或長壽的可能性。這具有優(yōu)點——可以直接檢測更健康生活方式的后果，可以監(jiān)測健康生活方式的維持，以及可以在不健康的生活方式的第一次臨床表現(xiàn)出現(xiàn)前糾正不健康的生活方式。
[0044]本發(fā)明方法還可以備選地和/或另外地用于診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。腸道微生物組對宿主發(fā)揮著多種重要的生物化學(xué)功能，微生物組的紊亂與許多且多樣的人類疾病過程相關(guān)(Kinross等，Genome Medicine 2011，3:14)。不利的腸道微生物菌群-宿主相互作用可以具有許多臨床表現(xiàn)，例如系統(tǒng)疾病狀態(tài)，如肥胖和心血管疾??；或腸道狀況，如炎癥性腸病。
[0045]可以在任何受試者中診斷腸道微生物菌群-宿主相互作用，但是可能尤其重要的是在成年人或較年長者中監(jiān)測健康的微生物菌群-宿主相互作用。
[0046]因此，可以在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0047]如果受試者超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前二分之一，優(yōu)選地其超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前三分之二，更優(yōu)選地其超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前四分之三，最優(yōu)選地其超過其來源國的平均預(yù)期壽命的前五分之四，則該受試者被視為一較年長者Il。
[0048]例如，如果受試者是人，則本發(fā)明方法可以在至少45歲，至少60歲，或至少75歲的成年人上實施。
[0049]待使用本發(fā)明方法檢查的受試者可以是人或動物，尤其是例如哺乳動物。典型的動物可以是例如陪伴動物如貓或狗或農(nóng)場動物。
[0050]本發(fā)明方法可以另外地或備選地用于檢測生活方式改變的結(jié)果。在此，可能有利的是，將PAG和/或PCS水平與先前(例如在生活方式改變之前或生活方式改變的較早期)獲自受試者的PAG和/或PCS水平進行比較。
[0051]因此，本發(fā)明方法可以診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值基于從生活方式改變前的受試者獲得的尿PAG和/或PCS水平。
[0052]生活方式改變可以是任何改變，例如不同的工作、更多的睡眠、較少的飲酒、更多的挑戰(zhàn)、較少的壓力、較少的吸煙、更多的運動、不同的工作和/或生活環(huán)境，等等。
[0053]生活方式的改變還可以是飲食的變化。
[0054]飲食變化可以是例如使用先前未用過的或以不同量使用的至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品。
[0055]由此，本發(fā)明方法可以用于檢查新營養(yǎng)方案、營養(yǎng)產(chǎn)品和/或藥物的有效性。
[0056]營養(yǎng)產(chǎn)品可以是例如聲稱對健康性老化和/或避免老化相關(guān)的慢性炎性病癥有作用的產(chǎn)品。
[0057]典型地，營養(yǎng)產(chǎn)品可以是食品、飲品、寵物食品、食物增補物、營養(yǎng)藥、食物添加劑、
或營養(yǎng)配方產(chǎn)品。
[0058]樣品中生物標(biāo)志物的水平例如PAG和/或PCS的水平可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式檢測和定量。例如，可以使用質(zhì)譜如UPLC-ES1-MS/MS，或NMR光譜如1H-NMR光譜。
[0059]其它方法，例如其它光譜方法、色譜方法、標(biāo)記技術(shù)或定量化學(xué)方法也可以使用。
[0060]本發(fā)明方法包括將測試的受試者的PAG和/或PCS的水平與預(yù)定參考值比較，所述預(yù)定參考值可以源自可比對照受試者尿中的PAG和/或PCS水平。
[0061]其PAG和/或PCS水平高于對照值或在參考值的較高范圍中的測試受試者具有增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0062]此外，受試者的PAG和/或PCS水平與對照值之間的差異程度也可以用于表征風(fēng)險程度，并由此確定哪些受試者將最為得益于某些治療。
[0063]參考值優(yōu)選使用如下單位度量，所述單位與表征從測試的受試者獲得的PAG和/或PCS的水平時使用的單位相同。因此，如果PAG和/或PCS的水平是絕對值，例如PAG和/或PCS的單位(μ mol/mol肌酐)，則參考值也基于一般群體或選擇的對照受試者群體中個體的PAG和/或PCS單位(μ mol/mol肌酐)。
[0064]此外，參考值可以是單個截斷值，例如中值或平均值。在獲得的尿樣品中PAG和/或PCS的參考值，例如平均水平、中值水平或一截斷II水平，可以通過分析一般群體或所選群體中的大樣本個體，使用統(tǒng)計學(xué)模型而建立，例如預(yù)測值方法用于選擇陽性標(biāo)準(zhǔn)，或受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic curve)定義最佳特異性(最高的真陰性率)和靈敏度(最高的真陽性率)，描述見并入此處作為參考的Knapp，R.G.和 Miller, M.C.(1992).Clinical Epidem1logy and B1statistics.William andWilkins, Harual Publishing C0.Malvern, Pa.。
[0065]本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何分派正確的參考值，其將隨著性別、種族、基因遺傳、健康狀況或年齡等而變。
[0066]例如，尿中，預(yù)定的參考值對于PCS可以是63 μ mol/mmol肌酐，對于PAG可以是81 μ mol/mmol肌酐。更高的值指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0067]評估越多的生物標(biāo)志物，本發(fā)明診斷方法將具有越大的預(yù)測力。
[0068]本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)在血清中用于診斷生活方式的其它生物標(biāo)志物，其中所述生活方式允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥。
[0069]由此，本發(fā)明人鑒定到，增加血清濃度的
[0070]1-0-烷基-2-?；视土姿崮憠A(PC-O) 32:1,
[0071]1-0-烷基-2-?；视土姿崮憠A(PC-O) 34:1,
[0072]15-羥基-二十碳四烯酸(15-HpETE)，
[0073]白三烯E4(LTE4)，
[0074]白三烯B4(4LTB)，和 / 或
[0075]8, 9-環(huán)氧二十碳三烯酸(8，9EpETre)
[0076]允許診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式，
[0077]而降低血清濃度的
[0078]羥基-鞘磷脂(SM-OH)22:1,
[0079]溶血磷脂酰膽堿(LPC) 18:0
[0080]鞘磷脂(SM)24:0，
[0081 ] 1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸膽堿(PC-O) 34: 3，
[0082]1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸膽堿(PC-O) 36: 4，
[0083]1-0-烷基-2-?；视土姿崮憠A(PC-O) 40:1,
[0084]磷脂酰膽堿(PC) 36:2，
[0085]羥基十八碳二烯酸(9-H0DE)，
[0086]9-氧代-十八碳二烯酸(9-氧代-H0DE)
[0087]和/ 或
[0088]11，12-環(huán)氧二十碳三烯酸(11，12-DiHETre)
[0089]允許診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式。
[0090]各類脂質(zhì)分子按如下進行注釋:
[0091][脂質(zhì)類型][碳原子總數(shù)]:[雙鍵總數(shù)]。例如，PC34:1反映包含34個碳原子和I個雙鍵的磷脂酰膽堿類分子。
[0092]因此，在本發(fā)明的方法中，可以通過也評估，相對于先前獲得的參考值，血清中一種或多種下述生物標(biāo)志物的濃度是否增加=PC-O 32:1, PC-034:1, 15-HpETE，LTE4，LTB4, 8，9EpETre和/或血清中一種或多種下述生物標(biāo)志物的濃度是否降低:SM-OH22:1，LPC 18:0，SM 24:0，PC-0 34:3, PC-O 36:4, PC-O 40:1，PC 36: 2，9-H0DE，9-氧代-H0DE，11，12-DiHETre,以提高診斷的準(zhǔn)確性。
[0093]本發(fā)明也延及新生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，所述新生物標(biāo)志物可以用于診斷允許延遲和/或避免老化慢性炎性病癥的生活方式。
[0094]因此，本發(fā)明包括用于診斷允許延遲和/或避免老化慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。
[0095]該生物標(biāo)志物可以在尿中檢測，其具有待測樣品能夠非侵入地獲得的優(yōu)點。
[0096]本領(lǐng)域技術(shù)人員也將理解，盡管在文中將生物標(biāo)志物及其在診斷方法中的應(yīng)用描述為
[0097]-診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式，
[0098]-診斷允許健康老化的生活方式，
[0099]-診斷長壽，和/或
[0100]-診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，
[0101 ] 但是所述生物標(biāo)志物同樣也可以應(yīng)用于方法中以
[0102]-診斷促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，
[0103]-診斷可能防止健康老化的生活方式，
[0104]-診斷壽命縮短的風(fēng)險，和/或
[0105]-診斷較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0106]在其它方面，本發(fā)明提供方法用于:
[0107]-延遲、避免和/或防止老化相關(guān)慢性炎性病癥的發(fā)生，
[0108]-促進健康老化，
[0109]-促進長壽，
[0110]-降低壽命縮短的風(fēng)險，
[0111]-促進更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，和/或
[0112]-防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0113]典型地這些方法包括步驟:對受試者實施本文描述的診斷方法；和基于其結(jié)果，改變受試者的生活方式。例如，該方法可以包括:如果診斷步驟的結(jié)果指示:在受試者中
[0114]-增加的發(fā)生老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性，
[0115]-可能防止健康老化的生活方式，
[0116]-壽命縮短的風(fēng)險，和/或
[0117]-較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用；
[0118]則改變受試者的生活方式。
[0119]受試者生活方式的改變可以是本文所述的任何改變，例如飲食變化、不同工作、更多睡眠、較少飲酒、更多挑戰(zhàn)、較少壓力、較少吸煙、更多運動、不同的工作和/或生活環(huán)境，
坐坐寸寸ο
[0120]優(yōu)選地，所述改變是使用先前未用過或以不同量用過的至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品，例如對健康老化和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥有作用的營養(yǎng)產(chǎn)品(包括食品、飲料、寵物食品、食物補充物、營養(yǎng)藥、食物添加劑或營養(yǎng)配方產(chǎn)品)。
[0121]改變受試者生活方式也包括指明受試者需要改變他/她的生活方式，例如向受試者開處方、推薦和/或建議如上所述的生活方式改變。例如，該方法可以包括步驟:向受試者施用或提供至少一種上述營養(yǎng)產(chǎn)品。
[0122]本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，他們可以自由地組合本文描述的所有本發(fā)明特征，而不偏離所公開的本發(fā)明范圍。尤其是，針對本發(fā)明方法描述的特征可以應(yīng)用于本發(fā)明的生物標(biāo)志物，反之亦然。
[0123]從下面的表格、實施例和附圖，本發(fā)明的其它優(yōu)點和特點將是明顯的。
[0124]表I顯示募集的老化群組的人口統(tǒng)計學(xué)和臨床特征。數(shù)值表示為平均值(iSD)，括號中顯示范圍。1BMI =身體質(zhì)量指數(shù)，2糖尿病:糖尿病史、空腹血漿葡萄糖> 126mg/dl,3HDL=高密度脂蛋白，4LDL=低密度脂蛋白，5MMSE=使用簡易精神狀態(tài)檢查表(MMSE)的認(rèn)知功能量度。分析中使用的分值對于老年人通過年齡和受教育年數(shù)進行校正。對于較年長者的認(rèn)知損傷，MMSE分級為重度(分值0-17)、輕度(分值18-23)、或不存在(分值24-30)。對于百歲老人，MMSE ^ 20不存在嚴(yán)重認(rèn)知下降；〈12存在嚴(yán)重認(rèn)知下降。6CRP = C反應(yīng)蛋白-Jk-Skk =血清淀粉樣蛋白A(SAA)蛋白質(zhì)。
[0125]表2展示所選老化群之間的辨別模型的特征和模型總結(jié)。
[0126]表3顯示通過1H-NMR檢測到的3個年齡組在尿中的所有被顯著調(diào)節(jié)的代謝物。為了獲得半定量信息，針對所述三個代謝物，進行原始光譜中的峰面積的積分，通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的差異，并標(biāo)記如下:*ρ〈0.05.，**ρ〈0.01，***ρ〈0.0Olo
[0127]表4展示通過LC-MS檢測到的3個年齡組在血清中的所有被顯著調(diào)節(jié)的代謝物。數(shù)值表示為平均值土 SD，并標(biāo)記如下:*ρ〈0.05.，#ρ〈0.01, #*ρ〈0.001。
[0128]表5展示通過UPLC-ES1-MS/MS分析的3個年齡組在血清中的炎性標(biāo)志物的濃度水平(ng/100 μ I),并標(biāo)記如下:*ρ〈0.05.，**ρ〈0.01，***ρ〈0.001。
[0129]圖1為來自老化群組的典型尿600Mhz譜，顯示由主要低分子量分子引起的峰，所述主要低分子量分子為例如酮體、有機酸、氨基酸、以及源自哺乳動物和腸道微生物代謝的代謝物(PAG和PCS)。
[0130]圖2顯示(A)來自較年長者和百歲老人及(B)來自年輕成年人和百歲老人的尿1H-NMR 譜的 OPLS-DA 分值。
[0131]圖3顯示自較年長者和百歲老人的尿1H-NMR譜產(chǎn)生的系數(shù)圖。
[0132]圖4顯示有關(guān)半定量信息的盒式圖，源自原始光譜中PAG和PCS的峰面積(曲線下面積)。統(tǒng)計學(xué)顯著性通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證。
[0133]圖5a和5b顯示通過靶向UPLC_ESI_MS/MS代謝組學(xué)分析測量的、三個老化時間點之間脂質(zhì)組譜(平均脂質(zhì)濃度)的差異。盒式圖反映變化，從左到右指示百歲老人、較年長者和年輕個體。濃度為μΜ。平均值土SD來自三個老化組的靶向MS，統(tǒng)計學(xué)顯著性通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證并列于表4中。僅顯不顯著差異，并通過Mann-Whitney U檢驗進行了評估。
[0134]圖6顯示通過靶向UPLC-ES1-MS/MS代謝組學(xué)分析測量的、三個老化時間點之間脂質(zhì)組譜的差異(結(jié)果表示為ng/100 μ 1，代表平均脂質(zhì)濃度)。盒式圖反映變化，從左到右指示百歲老人、較年長者和年輕個體。平均值土SD來自三個老化組的靶向MS，統(tǒng)計學(xué)顯著性通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證并列于表5中。僅顯不顯著差異，并通過Mann-WhitneyU檢驗進行了評估。
實施例:
[0135]受試者和研究組別
[0136]對于要進行的研究，每個個體和他們的家庭均給出了知情同意書?？偣玻谝獯罄辈?包括博洛尼亞、佛羅倫薩、帕爾馬、米蘭)，入選了屬于不同年齡組的541名受試者用于本研究。百歲老人組由156名個體(125名女性和31名男性)組成，較年長者組由363名個體(205名女性和158名男性)組成，年輕成年人組由22名個體(10名女性和12名男性)組成。
[0137]研究方案得到Sant 1rsola-Malpighi大學(xué)醫(yī)學(xué)院(Bologna, Italy)的倫理委員會批準(zhǔn)。得到的生物學(xué)樣品(血清和尿)在代謝組學(xué)分析前儲存在_80°C。
[0138]臨床化學(xué)
[0139]使用Roche Diagnostics的相應(yīng)酶學(xué)試劑盒，采用自動分析儀(RocheDiagnostics Hitachi 917, Hitachi Ltd, Tokyo, Japan),測量了血清總的、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)和甘油三酯濃度。使用Friedewald的公式(Friedewald WT等，ClinicalChemistryl8(6):499 - 502)，計算了低密度脂蛋白膽固醇(LDL)濃度。細(xì)胞因子，包括小鼠干擾素Y (INFy)、白介素1β (IL-Ιβ)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL_10)、白介素12p70(IL-12p70)、角質(zhì)細(xì)胞來源的趨化因子(KC)和腫瘤壞死因子(TNF)，使用小鼠促炎多重試劑盒(Meso Scale Discoveries, Gaithersburg, Maryland, USA)測量。根據(jù)制造商的手冊，進行測定試驗。高靈敏C反應(yīng)蛋白(CRP)使用靈敏的雙重抗體夾心ELISA以兔抗人CRP和過氧化物酶綴合的兔抗人CRP測量。
[0140]用于1H NMR光譜的樣品準(zhǔn)備。來自三個老化組的Iml尿樣品在凍干設(shè)備(Freeze-Dryer Fisher Scientific)中干燥，并使用含有ImM 3_(三甲基甲娃燒基)-[2，2，3，3-2H4J-1-丙酸鈉(TSP)的580 μ L磷酸鹽緩沖溶液(ΚΗ2Ρ04,終濃度0.2Μ)調(diào)整至pH 6.8,并放入5_ NMR管。在配備反向5mm低溫探頭的Bruker Avance III600MHz 光譜儀上以 300K(Bruker B1spin, Rheinstetten, Germany)測量代謝譜。對于每個尿樣品，使用脈沖序列(包括標(biāo)準(zhǔn)IH檢測，帶水峰壓制)，記錄IH NMR譜。該標(biāo)準(zhǔn)譜采用4s的馳豫延遲和10ms的混合時間tm獲取。獲取的IH NMR譜采用Topspin軟件包(2.1版；Bruker B1spin, Rheinstetten,德國)處理，并參照在δ = 0.0的標(biāo)準(zhǔn)(TSP)。使用內(nèi)部化合物文庫和文獻(xiàn)，給峰分派特定代謝物，并通過在選定的樣品上的標(biāo)準(zhǔn)二維NMR譜(JRES，T0CSY，HSQC，HMBC)驗證。對于統(tǒng)計學(xué)分析，將所有NMR譜轉(zhuǎn)化為在δ 0.4-10.0 范圍上的 12Κ數(shù)據(jù)點，并輸入MATLAB 軟件(7.11.0 版(R2010b) ；The MathfforksInc.，Natick, MA)，排除水殘基(水δ = 4.7120-4.84)。該譜相對于規(guī)定范圍內(nèi)的所有強度的總和進行標(biāo)化。
[0141]用于B1crates Life Sciences絕對IDQTM試劑盒分析的樣品準(zhǔn)備
[0142]如先前公布的(Romisch-Margl,w.，c.Prehn, R.Bogumil, c.Rohriiig,
K.Suhre, J.Adamski,用于高通量靶向代謝物組學(xué)的組織樣品準(zhǔn)備和代謝物提取的程序(Procedure for tissue sample preparat1n and metabolite extract1n forhigh-throughput targeted metabolomics), Metabolomics, 2011,首先網(wǎng)上公布)，在來自所選老化群組的血清樣品上使用B1crates Life Sciences絕對IDQTM試劑盒。根據(jù)制造商的說明，進行孔板準(zhǔn)備和樣品施用及提取。將10μ I終體積的血清上樣至所提供的96孔板上,板包含同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。在D1nex Ultimate 3000超高壓液體色譜(UHPLC)系統(tǒng)(D1nex AG, Olten, Switzerland)上進行液相色譜,其中所述色譜系統(tǒng)與安裝有TurboV離子源以電噴霧離子化(ESI)模式運行的3200Q TRAP質(zhì)譜儀(AB Sciex ；Foster City, CA, USA)偶聯(lián)。使用梯度流速 0-2.4min: 30 μ 1/min, 2.4-2.8min: 200 μ I/min, 2.9-3min: 30 μ 1/min，通過直接輸注，注射樣品提取物(20 μ I)兩次(以正和負(fù)ESI模式)。MS源參數(shù)設(shè)置為:脫溶劑溫度(TEM):200°C，高電壓:-4500V(ES1-),5500V(ESI+),氣簾(CUR)和霧化器(GSl和GS2)氣體；氮氣;20，40，和50psi ;分別地，氮氣碰撞氣壓:5mTorr。以計劃的反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)進行MS/MS獲取，其中對于本測定試驗中篩選的163種代謝物具有優(yōu)化的去簇電位值(potential values)。將原始數(shù)據(jù)文件(Analyst軟件，版本1.5.1 ；AB Sciex, Foster City, CA, USA)輸入提供的分析軟件MetIQ,以計算代謝物濃度。所有可檢測代謝物的列表可從B1crates Life Sciences, Austria (http://b1crates, com)獲得。
[0143]使用同位素稀釋技術(shù)通過UPLC-ES1-MS/MS進行樣品準(zhǔn)備和炎癥標(biāo)志物定量。
[0144]基于先前公布的工作(Naga等，PROG.LIPID RESEARCH, 2001, 40, 199-299)，內(nèi)部開發(fā)了測量一組63個炎癥標(biāo)志物的方法。來自三個年齡組(η = 15個百歲老人，η = 30個較年長者，η = 50個年輕成年人)的剩余可獲得的生物材料的300 μ I血清樣品，使用
FastPrep? 24系統(tǒng)，以10 μ I BHT緩沖液(丁基化羥基甲苯；79.2mg/ml PBS)勻漿。對于每個樣品，總共50 μ I血清與5 μ I內(nèi)標(biāo)溶液(0.1ng/ μ I)混合。添加15 μ I朽1檬酸(IN)酸化混合物。為了沉淀蛋白質(zhì)，加入550μ I體積的甲醇/乙醇(1:1，v:v)，4°C混合樣品15分鐘，之后離心(3500rpm，lOmin，4°C )。在恒定氮氣流下蒸發(fā)有機相至干，殘余物用80 μ I水溶解，之后加入20 μ I乙腈，然后4°C 3500rpm離心lmin。將上清液轉(zhuǎn)移至LC-MS小瓶中，然后分析。通過與串聯(lián)質(zhì)譜偶聯(lián)的液相色譜(LC-MS/MS),進行分析。LC在D1nex Ultimate3000超高壓液相色譜(UPLC)系統(tǒng)(D1nex AG, Olten, Switzerland)上進行。MS檢測在以ESI 模式運行的 5500Q TRAP 質(zhì)譜儀(AB Sciex ；Foster City, CA, USA)上進行。在 AcquityBEH C18 柱(2.1x 150mm, 1.7 μ m ；ffaters, Milford, USA)上，進行梯度色譜分離。注射體積5μ I,柱子維持在50°C。流動相由含有I %乙酸(洗脫劑A)和乙腈(洗脫劑B)的水組成，設(shè)定在450 μ 1/min的恒定流速。梯度洗脫開始于20% B，線性增加，在6分鐘至50% B，在13分鐘從50%至95% B，在95% B保持3分鐘，之后在16.1分鐘返回到20% B，重新平衡柱子另外 11 分鐘。分析物以 Analyst 軟件(版本 1.5.1 ；AB Sciex, Foster City, CA, USA)中提供的計劃選擇反應(yīng)監(jiān)測(scheduled SRM)模式監(jiān)測。所有質(zhì)量變遷(mass transit1n)和MS源參數(shù)在補充數(shù)據(jù)中提供。SRM檢查窗時間設(shè)置為120sec，靶掃描時間0.5sec。使用氮氣作為氣簾和脫溶劑氣，壓力分別為⑶R =20, GSl: 70，GS2:20 (任意單位)。Block源溫度維持在600°C，電壓分別為:ISV:-4000V，EP:-10V，CXP:-5V。在樣品分析前，通過測量不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(O-1Ong)，繪出15點的校準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)處理使用Analyst軟件(版本1.5.1 ;AB Sciex, Foster City, CA, USA)進行。計算每個分析物相對于其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)或替代標(biāo)志物的峰面積比。值得提及的是，血清樣品中PGJ2，PGF2a, PGE2, PGEI, 15-氧代-HETE, 15-脫氧- Λ 12，14-PGJ2，6-酮基PGFla,和5-氧代-ETE低于其檢測限，因此在統(tǒng)計學(xué)分析中未加考慮。
[0145]多變量數(shù)據(jù)分析(MVA)
[0146]在幾種軟件環(huán)境中進行MVA。因此，對于IH NMR和靶向MS數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)輸入和預(yù)處理步驟使用寫在 MATLAB (版本 7.11.0，The Mathworks Inc., Natick, MA, USA)中的一內(nèi)部 Il
程序完成。在NMR數(shù)據(jù)分析中，使用SMCA-P+軟件(版本12.0，Umetrics AB, Umea,
Sweden),實施 0PLS-DA 模型。通過隨機森林(Random Forests),使用 ‘randomForest ‘包(A.Liaw and M.Wiener(2002).Classificat1n and Regress1n by randomForest.RNews2 (3), 18—22.),在 R 環(huán)境中運行(R Development Core Team (2011).R:A languageand environment for statistical computing.R Foundat1n for StatisticalComputing, Vienna, Austria.1SBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.0rg/.),分析靶向MS數(shù)據(jù)。最后，用于驗證的單變量顯著性檢驗也在R中進行。
[0147]老化群組的臨床特征
[0148]表I顯示老化群組的身體和生物化學(xué)特征。與較年長者相比，BMI (p〈0.001)，穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA) (p<0.001),總膽固醇(P = 0.001)，甘油三酯(p = 0.004), HDL(p=0.001),和LDL(p = 0.04)在百歲老人中較低，而血清淀粉樣蛋白A(A-SAA)蛋白質(zhì)(p<0.001)和C反應(yīng)蛋白(CRP) (p〈0.001)在百歲老人中較高。與年輕個體相比，較年長者表現(xiàn)出較高的BMI (ρ〈0.001)，總膽固醇(ρ<0.001),甘油三酯(ρ〈0.001)，LDL (ρ〈0.05)，和CRP (ρ<0.001)。
[0149]來自三個老化組(92名百歲老人，283名較年長者，和21名年輕成年人)的可得樣品的尿600MHz 1H-NMR,用于代謝譜分析。為了探索三個年齡組之間年齡誘導(dǎo)的改變和代謝差異以及最小化無關(guān)代謝物變異性的任何影響，在來自三個時間點的全分辨率NMR數(shù)據(jù)集合上應(yīng)用尿NMR譜的監(jiān)督式化學(xué)計量分析。隱變量正交投影-辨別分析(OPLS-DA)在單位方差尺度歸一化數(shù)據(jù)(unit variance scaled data)上進行(圖2)。百歲老人和年輕成年人組之間的辨別模型，通過使用13.7%的光譜方差(spectral variance, R2X),提供了 1.0的分類詞驗證錯誤(表達(dá)為ROC曲線下面積，AuROC (Fawcett, T., An introduct1nto ROC analysis, Pattern Recogn.Lett.，2006，27:861-874))(表 2)。同樣地，再次使用
13.7%的總X方差，百歲老人和較年長者組之間的模型產(chǎn)生了具有0.93的AuROC驗證錯誤的模型(表2)。為了確定與年齡組之間差異相關(guān)的代謝物標(biāo)簽，使用了 OPLS-DA模型的第一性預(yù)測成分的加載值(loadings)，根據(jù)變量的相關(guān)系數(shù)進行顏色編碼(圖3)。由此，百歲老人和較年長者個體之間的尿辨別模型展示相對較高量的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、對甲酚硫酸(PCS)。為了獲得半定量信息，針對這三種代謝物，對原始光譜上的峰面積進行積分，通過使用Wilcoxon秩和檢驗驗證了具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的差異(圖4，表3)?？傊?，這些結(jié)果顯示，腸道微生物高度參與長壽過程。
[0150]靶向的和定量的LC-MS代謝組學(xué)展示了血清中與老化相關(guān)的代謝改變。
[0151]為了確定血清中年齡相關(guān)的代謝差異，在三個老化組(143名百歲老人，90名較年長者和20名年輕成年人)的可得生物樣品上應(yīng)用靶向LC-MS/MS代謝組學(xué)方法。使用隨機森林(RF?) (Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 2001, 45:5-32),在 160種代謝物的預(yù)處理半定量數(shù)據(jù)上，進行多變量數(shù)據(jù)分析，其中所述代謝物包括氨基酸、糖、?；?肉毒堿、鞘脂類和甘油磷脂類。使用在RF?中實行的變量重要性特征，可以確定更好地區(qū)分三個老化組的代謝物標(biāo)簽。為了評價標(biāo)簽的每個組分的各自辨別能力，在這些年齡組中進行Wilcoxon秩和檢驗(表4中列出了所有顯著調(diào)節(jié)的代謝物)。盡管甘油磷脂類和鞘脂類的總體濃度隨著脂肪酸組成而增加和減少，但三種一致傾向是明顯的:隨著年齡增加或減少(統(tǒng)計學(xué)有效)的化合物集合，例如減少濃度的溶血磷脂酰膽堿(LPC18:2，1^20:4)，增加水平的？032:0和增加濃度的鞘磷脂(SM 24:1, SM 16:0) ;(ii)僅特異于百歲老人的化合物集合，在較年長者和年輕個體之間無統(tǒng)計學(xué)改變，如鞘磷脂和特定甘油磷酸脂類(SM-0H 22:1，LPC 18:0，SM 24:0，PC_034:3, PC-O 36:4，PC-0 40:1，PC 36:2)的減少和特定甘油磷酸脂類(PC-032:l，PC-0 34:1)的增加。
[0152]此外，在3個老化組的剩余可得血清樣品(12名百歲老人，37名較年長者和18名年輕成年人)上，使用靶向LC-MS/MS方法，以調(diào)查類二十烷酸合成的濃度改變。在此，在定量數(shù)據(jù)上的RF?顯示三個年齡組之間的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)改變(圖6)。通過Wilcoxon秩和檢驗評價年齡組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性(增補表5中列出了所有顯著調(diào)節(jié)的代謝物)。百歲老人展示出較低濃度的11，12-二羥基-二十碳三烯酸(11，12-DiHETrE)、9-羥基-十八碳二烯酸(9-H0DE)和9-氧代-十八碳二烯酸(9-氧代-H0DE)，以及同時增加濃度的15-羥基-二十碳四烯酸(15-HETE)和白三烯E4(LTE4)。與較年長者相比，百歲老人中二十碳五烯酸(EPA)的水平降低。此外，在百歲老人和較年長者之間進行成對MRC分析以最大化兩個年齡組中的變化，展示出在百歲老人中增加血清濃度水平的8，9-環(huán)氧二十碳三烯酸(8，9-EET)和白三烯 B4 (LTB4)。
[0153]本發(fā)明還提供下述編號段落中公開的其它實施方案:
[0154]1.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的方法，包括
[0155]_從受:試者獲得血清樣品，
[0156]-確定樣品中9_氧代-HODE的水平，和
[0157]-比較受試者的9-氧代-HODE水平與預(yù)定參考值，
[0158]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均血清9-氧代-HODE水平，且
[0159]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中降低的血清9-氧代-HODE水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0160]2.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的方法，包括
[0161]_從受:試者獲得血清樣品，
[0162]_確定樣品中PC-O 40:1的水平，和
[0163]-比較受試者的PC-O40:1水平與預(yù)定參考值，
[0164]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均血清PC-O 40:1水平，且
[0165]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中降低的血清PC-O 40:1水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0166]3.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的方法，包括
[0167]_從受:試者獲得血清樣品，
[0168]-確定樣品中SM-OH22:1的水平，和
[0169]-比較受試者的SM-OH22:1水平與預(yù)定參考值，
[0170]其中預(yù)定參考值基于對照群體中平均血清SM-OH 22:1水平，且
[0171]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低血清SM-OH 22:1水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0172]4.段落I至3之任一的方法，還包括
[0173]-確定PC-O 40:1，SM-OH 22:1，LPC 18:0，SM 24:0, PC-O 34:1，9-H0DE, 9-氧代-H0DE，或LTE4中的至少一種在樣品中的水平，和
[0174]-將受試者中PC-O 40:1，SM-OH 22:1，LPC 18:0，SM24:0, PC-034:1，9-H0DE, 9-氧代-H0DE，或LTE4之至少一種的水平與預(yù)定參考值比較，
[0175]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均血清PC-O 40:1, SM-OH 22:1, LPC18:0，SM 24:0，PC-O 34:1，9-H0DE, 9-氧代-HODE 或 LTE4 水平，且
[0176]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中降低的血清PC-O 40:1, SM-OH 22:1，LPC 18:0, SM24:0, PC-O 40:1, 9-H0DE,和/或9-氧代-HODE水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性，和/或
[0177]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中增加的血清LTE4和/或PC-O 34:1水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0178]5.段落I至4之一的方法，其中還通過與先已獲得的參考值比較，評價生物標(biāo)志物PC-O 32:1, 15-HpETE, LTB4, 8，9EpETre中的一個或多個在血清中是否增加，和/或生物標(biāo)志物PC-O 34:3, PC-O 36:4, PC 36:2，11，12-DiHETre中的一個或多個在血清中是否降低，以增加診斷的準(zhǔn)確性。
[0179]6.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的非侵入式方法，包括
[0180]_從受:試者獲得尿樣品，
[0181]-確定樣品中對甲酚硫酸(PCS)的水平，和
[0182]-比較受試者的對甲酚硫酸(PCS)水平與預(yù)定參考值，
[0183]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PCS水平，且
[0184]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0185]7.段落6的方法，還包括
[0186]-確定樣品中PAG的水平，和
[0187]-比較受試者PAG水平與預(yù)定參考值，
[0188]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PAG水平，且
[0189]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PAG和PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0190]8.段落I至7之一的方法，用于診斷允許健康老化的生活方式。
[0191]9.段落I至8之一的方法，用于診斷長壽。
[0192]10.段落I至9之一的方法，用于診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0193]11.段落10的方法，其中在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0194]12.段落I至11之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值基于從生活方式改變前的受試者獲得的血清或尿水平。
[0195]13.段落12的方法，其中生活方式的改變是飲食的改變。
[0196]14.段落13的方法，其中飲食的改變是使用先前未用過的或以不同量用過的至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品。
[0197]15.段落13或14的方法，用于檢查新的營養(yǎng)方案的有效性。
[0198]16.段落I至15之一的方法，其中通過1H-NMR和/或質(zhì)譜在樣品中及在參照中確定生物標(biāo)志物的水平。
[0199]17.段落I至16之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考平均值為
[0200]2 μ M的1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸膽堿(PC-O) 32:1,
[0201]7.80 μ M的1-0-烷基_2_?；视土姿崮憠A(PC-0) 34:1,
[0202]1.25 μ g/100 μ I 血清的 15-羥基-二十碳四烯酸(15-ΗρΕΤΕ)，
[0203]0.013 μ g/100 μ I 血清的白三烯 Ε4 (LTE4)，
[0204]0.020 μ g/100 μ I 血清的白三烯 Β4 (4LTB)，和 / 或
[0205]0.070 μ g/100 μ I 血清的 8，9_ 環(huán)氧二十碳三烯酸(8，9EpETre)
[0206]16.07 μ M 的羥基-鞘磷脂(SM-0H) 22:1,
[0207]52.00 μ M的溶血磷脂酰膽堿(LPC) 18:0,
[0208]25.00 μ M 的鞘磷脂(SM) 24:0,
[0209]5.07 μ M的1-0-烷基_2_?；视土姿崮憠A(PC-0) 34: 3，
[0210]14.30 μ M的1-0-烷基_2_酰基甘油磷酸膽堿(PC-0) 36:4,
[0211]1.41 μ M的1-0-烷基-2-?；视土姿崮憠A(PC_0)40:1，
[0212]10.00 μ M 的磷脂酰膽堿(PC) 36: 2，
[0213]0.34 μ g/100 μ I血清的羥基十八碳二烯酸(9-H0DE)，
[0214]0.043 μ g/100 μ I的9_氧代-十八碳二烯酸(9_氧代-H0DE)，和/或
[0215]0.017 μ g/100 μ I 血清的 11，12-環(huán)氧二十碳三烯酸(11, 12-DiHETre).
[0216]18.段落I至17之任何的方法，還包括:
[0217]-從受試者獲得尿樣品，
[0218]-確定樣品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和/或?qū)追恿蛩?PCS)的水平，和
[0219]-比較受試者的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)和/或PCS水平與預(yù)定參考值，
[0220]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PAG和/或PCS水平，且其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PAG和/或PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
[0221]19.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是9-氧代-HODE。
[0222]20.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是PC-O 40:1ο
[0223]21.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是SM-OH 22:1.
[0224]22.段落19至21之任一的生物標(biāo)志物，其中在血清中檢測所述生物標(biāo)志物。
[0225]23.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是對甲酚硫酸(PCS)。
[0226]24.段落23的生物標(biāo)志物，其中在尿中檢測所述生物標(biāo)志物。
[0227]25.用于診斷(i)促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括
[0228]_從受:試者獲得血清樣品，
[0229]-確定樣品中9-氧代-HODE,PC-O 40:1和/或SM-OH 22:1的水平，和
[0230]-比較受試者的9-氧代-H0DE、PC-040:1和/或SM-0H 22:1水平與預(yù)定參考值，[0231 ] 其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均血清9-氧代-HODE、PC-040:1和/或SM-OH 22:1 水平，且
[0232]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中增加的血清9-氧代-H0DE、PC-O 40:1和/或SM-OH 22:1水平指示(i)促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0233]26.用于診斷(i)促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括
[0234]-從受:試者獲得尿樣品，
[0235]-確定樣品中PCS的水平，和
[0236]-比較受試者的PCS水平和預(yù)定參考值，
[0237]其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PCS水平，且
[0238]其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低的尿PCS水平指示⑴促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
[0239]27.用于(i)延遲、避免和/或防止老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生，(ii)促進健康老化，(iii)促進長壽，(iv)降低壽命縮短的風(fēng)險，(V)促進更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，和/或(Vi)防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括:
[0240](a)實施段落25或26所述的診斷方法；和
[0241](b)如果受試者具有(i)增加的老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的可能性，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的微生物菌群-宿主相互作用，則改變受試者的生活方式。
[0242]28.段落27的方法，其中受試者的生活方式改變包括飲食改變。
[0243]29.段落28的方法，其中飲食的改變包括向受試者施用至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述營養(yǎng)產(chǎn)品對健康老化和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥有作用。
[0244]表1:
[0245] 因素百歲老人較年長者年輕人人口統(tǒng)計孛性別，男性 / 女性31/125158/20512/10
年齡，歲100.9^(99-111)70.4? (55-88)30.6*5 (25-40)
臨床
BMI1s kg/m223.8+3.7(13.3-34.1)26.9^4.6(16.7-547)21.92*2.1 (18.3.23.6)
HOMA1.90*2.8(0.20-23)33*3.1 (0,20-28.9)n/a
糖尿病2, η836論
膽目醇 mg/d]188.2*38.1 (110-318)201.0*38.8 (5-335)162.3*28.4(123-207)
甘油三酉I (mgM119.6^5.4(50-535)125.5=63.1 (41-550)71.1*32.1 (28-143)
HDL3, mg/dl47.C13.1 (20-99)55.8+2LI (20-212)51.3=8.7 (38-66)
LDL4 mgM116.2?.! (27-248)120^1.7(12-248)96.8^0.1 (49-144)
MMSEs20.3^.4(1.3-30.8)27^1.9(1.3-31.0)a/a
CRP6 mg/L5.8?.1 (0.28-28.2)2.8士3.7 (0.11-25.7)0.7^0.4 (0.28-2.03)
心力衰竭，η444O
心律不齊，η33460.心絞痛，Ji2512O
—540S01'158.2^.01'航
代謝物組學(xué)
& iFTNMR18/74128/15511/10
性? _100.9*2(99-111)70.1? (55-88)30.9? (24-40)
年齡，歲
血清-1e 向 MS30/11334/5611/9
性別，男性/女性100.9*2(99-111)69.6? (56-86)30.6? (24-40)
年齡，歲
脂質(zhì)組學(xué)
血清-1fc向 MS2/1021/169/9
性別，男性/女性101*2(99-104)70*6 (59-78)31.2*5 (25-40)
_年餘，歲______
[0246]表2:
[0247]

【權(quán)利要求】
1.診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的非侵入式方法，包括 -從受試者獲得尿樣品， -確定樣品中苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的水平，和 -比較受試者的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)水平與預(yù)定參考值， 其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PAG水平，且 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PAG水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括 -確定樣品中對甲酚硫酸(PCS)的水平，和 -比較受試者的PCS水平與預(yù)定參考值， 其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PCS水平，且 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中升高的尿PAG和PCS水平指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
3.前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷允許健康老化的生活方式。
4.前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷長壽。
5.前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
6.權(quán)利要求4的方法，其中在較年長者中診斷更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
7.前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值基于從生活方式改變前的受試者獲得的尿PAG和/或PCS水平。
8.權(quán)利要求7的方法，其中生活方式的改變是飲食的改變。
9.權(quán)利要求8的方法，其中飲食的改變是使用先前未用過的或以不同量用過的至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求8或9的方法，用于檢查新的營養(yǎng)方案的有效性。
11.前述權(quán)利要求之一的方法，其中通過1H-NMR和/或質(zhì)譜在樣品中及在參照中確定PAG和/或PCS的水平。
12.前述權(quán)利要求之一的方法，用于診斷更健康的生活方式，其中預(yù)定參考值對于PCS為尿中63 μ mol/mmol肌酐,對于PAG為尿中81 μ mol/mmol肌酐,更高的值指示增加的延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的可能性。
13.前述權(quán)利要求之一的方法，其中還通過與先已獲得的參考值比較，評價生物標(biāo)志物 PC-O 32:1, PC-O 34:1，15-HpETE, LTE4, LTB4, 8, 9EpETre 中的一個或多個在血清中是否增加，和 / 或生物標(biāo)志物 SM-OH 22:1，LPC 18:0，SM 24:0，PC-0 34:3, PC-O 36:4，PC-040:1, PC 36:2，9-H0DE，9-氧代-H0DE，11，12-DiHETre中的一個或多個在血清中是否降低，以增加診斷的準(zhǔn)確性。
14.用于診斷允許延遲和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥的生活方式的生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。
15.權(quán)利要求14的生物標(biāo)志物，其中在尿中檢測所述生物標(biāo)志物。
16.用于診斷(i)促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括 -從受試者獲得尿樣品， _確定樣品中PAG的水平，和 -比較受試者的PAG水平與預(yù)定參考值， 其中預(yù)定參考值基于對照群體中的平均尿PAG水平，且 其中與預(yù)定參考值相比，樣品中較低的尿PAG水平指示(i)促進老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的生活方式，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用。
17.用于(i)延遲、避免和/或防止老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生，(ii)促進健康老化，(iii)促進長壽，(iv)降低壽命縮短的風(fēng)險，(V)促進更健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，和/或(vi)防止較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用的方法，包括: (a)實施權(quán)利要求16所述的診斷方法；和 (b)如果受試者具有(i)增加的老化相關(guān)慢性炎性病癥發(fā)生的可能性，(ii)可能防止健康老化的生活方式，(iii)增加的壽命縮短的風(fēng)險，和/或(iv)較不健康的腸道微生物菌群-宿主相互作用，則改變受試者的生活方式。
18.權(quán)利要求17的方法，其中受試者的生活方式改變包括飲食改變。
19.權(quán)利要求18的方法，其中飲食的改變包括向受試者施用至少一種營養(yǎng)產(chǎn)品，其中所述營養(yǎng)產(chǎn)品對健康老化和/或避免老化相關(guān)慢性炎性病癥有作用。
【文檔編號】G01N33/68GK104204810SQ201380015752
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日
【發(fā)明者】S·科里諾, I·蒙托柳魯拉, F-P·馬丁, P·A·蓋, S·A·D·萊茲 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司