一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒及其制備方法，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分：試劑R1：緩沖液、表面活性劑、螯合劑、加速劑、防腐劑、穩(wěn)定劑，試劑R2：緩沖液、防腐劑、穩(wěn)定劑、膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體，制備方法為：按照組分含量配制好試劑；將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)；用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值；根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的髓過(guò)氧化物酶的濃度。本發(fā)明具有操作方便、檢測(cè)準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)是一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑 盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 髓過(guò)氧化物酶(MP0 )是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些組織的巨噬細(xì)胞分泌的含血 紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過(guò)氧化物酶超家族成員之一，髓過(guò)氧化物酶(MP0)每個(gè)酶 分子有兩個(gè)鐵素基團(tuán)，順磁共振波譜表明血紅素中的鐵是在甲?；t素部分，髓過(guò)氧化物 酶(MP0)的合成是粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并貯存于嗜天青顆粒內(nèi)，外界刺激可導(dǎo)致 中性粒細(xì)胞聚集，釋放髓過(guò)氧化物酶(MP0)，在成熟的粒細(xì)胞中，MP0是含量最豐富的糖蛋白，約 占外周血多形核中性粒細(xì)胞(PMNs)內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的5%，血液中95%的MP0來(lái)源于PMNs，MP0的相 對(duì)分子質(zhì)量為150 X 103，是由2個(gè)亞單位聚合而成的二聚體，每個(gè)亞單位又由一條重鏈(a鏈，相 對(duì)分子質(zhì)量約60 X 103)和一條輕鏈(0鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約15 X 103)所構(gòu)成，2個(gè)亞單位在a鏈處由 1個(gè)二硫鍵相連，重鏈具有亞鐵卟啉基團(tuán)，說(shuō)明髓過(guò)氧化物酶(MP0)是鐵依賴性的，MP0以3種亞形 存在于髓系細(xì)胞中，分別為mpoi、n、m，3種亞型主要是重鏈有差異，輕鏈的差異較小，導(dǎo)致它們 在相對(duì)分子質(zhì)量及疏水性等方面不同，3種亞型在功能上的差異還不明確，有待進(jìn)一步研究。
[0003] 冠心病是心血管系統(tǒng)中最常見(jiàn)的疾病，而動(dòng)脈粥樣硬化(AS)又是形成冠心病的重 要病理基礎(chǔ)，AS發(fā)病過(guò)程中通常出現(xiàn)氧化低密度脂蛋白，進(jìn)而巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變成泡沫 細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的形成在AS的發(fā)生機(jī)制中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)髓過(guò)氧化物酶(MP0)有促進(jìn) AS病變形成的作用，髓過(guò)氧化物酶(MP0)通過(guò)產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì)，促進(jìn)斑塊形成 和不穩(wěn)定性增加，加速AS進(jìn)展，進(jìn)而引起多種并發(fā)癥如急性冠脈綜合征(ACS)，研究發(fā)現(xiàn)， MP0缺陷的個(gè)體罹患心血管疾病的危險(xiǎn)性明顯下降，髓過(guò)氧化物酶(MP0)水平的升高不僅與 患冠狀動(dòng)脈疾病易感性相關(guān)，還可以預(yù)測(cè)早期患心肌梗死的危險(xiǎn)性。
[0004] 髓過(guò)氧化物酶(MP0)促進(jìn)急性冠脈綜合征(ACS)病變形成，并影響粥樣斑塊的穩(wěn)定 性，通過(guò)增大氧化應(yīng)激而引起急性冠脈綜合征(ACS)，研究表明，髓過(guò)氧化物酶(MP0)是預(yù)測(cè) 急性冠脈綜合征(ACS)患者發(fā)生不良心血管事件的一個(gè)新的預(yù)測(cè)因子，特別是在肌鈣蛋白T (TnT)水平較低的患者，MP0能夠識(shí)別那些將來(lái)發(fā)生心血管事件危險(xiǎn)性較高的患者。 在肺部受微生物侵襲、職業(yè)暴露以及吸煙時(shí)，髓過(guò)氧化物酶(MP0)會(huì)隨中性粒細(xì)胞的聚 集釋放到炎癥部位，髓過(guò)氧化物酶(MP0)可代謝激活多種與肺癌有關(guān)的環(huán)境致癌物，能將前 致癌物如多環(huán)芳烴類的苯并芘(BaP)轉(zhuǎn)化成具有高度反應(yīng)性和致癌性的活性產(chǎn)物二醇環(huán)氧 化苯并芘(BroE)，BH)E能與DNA形成加合物并導(dǎo)致姐妹染色體互換，從而導(dǎo)致肺癌。 目前，檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(MP0)的常用方法有酶聯(lián)免疫吸附法、雙抗體夾心激光化學(xué)發(fā) 光免疫檢測(cè)法以及酶法，酶聯(lián)免疫吸附法操作繁瑣，對(duì)操作人員有專業(yè)的技能要求，且耗時(shí) 長(zhǎng);雙抗體夾心激光化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法需要用到特殊的儀器，且檢測(cè)成本較高;酶法的穩(wěn) 定性和特異性均較差，而且測(cè)定準(zhǔn)確度低，需要進(jìn)行改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)操作復(fù)雜、污染環(huán)境以及測(cè)定準(zhǔn) 確度低的缺陷，而提供一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題提供的技術(shù)方案是:本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定髓過(guò)氧化物 酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 60~180 mmol/L 表面活性劑 10~40 mmol/L 螯合劑 20~100 mmol/L 加速劑 5~15 g/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體1~8 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 作為優(yōu)選，本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑 R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 120 mmol/L 表面活性劑 25 mmol/L 整合劑 60 mmol/L 加速劑 1〇 g/L 防腐劑 0.7 g/L 穩(wěn)定劑 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L 防腐劑 0.7 g/L 穩(wěn)定劑 20 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體4g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩 沖液中的一種或多種的組合，所述的表面活性劑采用吐溫-20、吐溫-80、曲拉通X-100中的 一種或多種的組合，所述的螯合劑為EDTA ? 2Na、氨基三乙酸中的一種，所述的加速劑采用 聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采 用苯酚、疊氮鈉、咪唑烷基脲中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩 沖液中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、疊氮鈉、咪唑烷基脲中的一種或多種 的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體的制備方法如下： 用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為80-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙 烯微球的質(zhì)量濃度為1%_5%的溶液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基 胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在20°C_37°C的條件下反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完成后加入2,2'_硫代 雙鎳，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L 的MES緩沖液稀釋，使用超聲分散儀進(jìn)行超聲分散，再使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速 下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，直至溶液中的聚苯乙烯微球 的質(zhì)量濃度為〇.5%-3%為止，然后邊攪拌邊加入抗髓過(guò)氧化物酶抗體，直至聚苯乙烯微球的 質(zhì)量濃度為0.5-2.0%，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度為20 g/L為止， 然后在4°C條件下封閉8-12小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體。
[0011] 作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開(kāi)了上述測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒的制備方法和使用方 法，包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 60~180 mmol/L 表面活性劑 10~40 mmol/L 螯合劑 20~100 mmol/L 加速劑 5~15 g/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體1~8 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的髓過(guò)氧化物酶的濃度。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。
[0013]作為優(yōu)選，步驟(b)中，所述的待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1: 5到1:30之間。
[0014]本發(fā)明的檢測(cè)原理是:本發(fā)明主要利用的是抗原抗體反應(yīng)的原理，樣本中的髓過(guò) 氧化物酶(MPO)與包被膠乳顆粒的特異的抗MPO-抗體結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，其濁度 水平與樣本中的MP0濃度成比例，對(duì)照6-點(diǎn)定標(biāo)曲線可以計(jì)算出樣本中的MP0濃度。
[00彳5] 樣本中髓過(guò)氧化物酶(MP0)的活性
式中：A At以空白管吸光度作對(duì)照的樣品管吸光度值 A As以空白管吸光度作對(duì)照的校準(zhǔn)管吸光度值 Cs校準(zhǔn)液中MP0的濃度。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過(guò)在試劑R2中添加助懸劑 和表面活性劑，使膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體可以均勻懸浮于試劑R2液中，在表面活性 劑和加速劑的作用下，可迅速發(fā)生反應(yīng)，在較低的樣本濃度下也可發(fā)生靈敏的反應(yīng)，因此檢 測(cè)的準(zhǔn)確度比較高，而且不會(huì)污染環(huán)境，另外操作也比較方便。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
[0018] 實(shí)施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 120 mmol/L 吐溫_20 25 mmol/L 氨基三乙酸 60 mmol/L 聚乙二醇-8000 10 g/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體4g/L 其溶劑為純化水。
[0019]作為優(yōu)選，所述的試劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩 沖液中的一種或多種的組合，所述的表面活性劑采用吐溫-20、吐溫-80、曲拉通X-100中的 一種或多種的組合，所述的螯合劑為EDTA ? 2Na、氨基三乙酸中的一種，所述的加速劑采用 聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采 用苯酚、疊氮鈉、咪唑烷基脲中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白。
[0020] 作為優(yōu)選，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩 沖液中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、疊氮鈉、咪唑烷基脲中的一種或多種 的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白。
[0021] 實(shí)施例2 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: MES緩沖液 60 mmol/L 吐溫_20 40 mmol/L 氨基三乙酸 20 mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮 15 g/L 咪唑烷基脲 0.5 g/L 牛血清白蛋白 30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MES緩沖液 50 mmol/L 咪唑烷基脲 1.0 g/L 牛血清白蛋白 l〇g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體8 g/L 其溶劑為純化水。 實(shí)施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的 聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升溶液中加 入1.0 mg的1-乙基_3_(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在26°C的條件下反應(yīng)1小時(shí)， 反應(yīng)完成后加入2，2'_硫代雙鎳，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，使用超聲分散儀進(jìn)行超聲分散，再使用離心 機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋， 直至溶液中的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%為止，然后邊攪拌邊加入抗髓過(guò)氧化物酶抗 體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度 為20 g/L為止，然后在4°C條件下封閉10小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: Tris緩沖液 120 mmol/L 吐溫_20 25 mmol/L 氨基三乙酸 60 mmol/L 聚乙二醇-8000 10 g/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 疊氮鈉 0.7 g/L 牛血清白蛋白 20 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體4g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長(zhǎng):主波長(zhǎng)600nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測(cè)步驟 (a) 取180ul試劑R1與15yl待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入60yl試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性 （ng/mL)計(jì)算出樣本 中的髓過(guò)氧化物酶的濃度。
[0022] 實(shí)施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體的制備：用50 mmol/L的MES緩沖液將粒徑為120nm的 聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%的溶液，然后每毫升溶液中加 入1.0 mg的1-乙基_3_(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在26°C的條件下反應(yīng)1小時(shí)， 反應(yīng)完成后加入2，2'_硫代雙鎳，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上 清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，使用超聲分散儀進(jìn)行超聲分散，再使用離心 機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋， 直至溶液中的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為3%為止，然后邊攪拌邊加入抗髓過(guò)氧化物酶抗 體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%，然后加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度 為20 g/L為止，然后在4°C條件下封閉10小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體； 2、 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: MES緩沖液 60 mmol/L 吐溫_20 40 mmol/L 氨基三乙酸 20 mmol/L 聚乙烯吡咯烷酮 15 g/L 咪唑烷基脲 0.5 g/L 牛血清白蛋白 30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: MES緩沖液 50 mmol/L 咪唑烷基脲 1.0 g/L 牛血清白蛋白 l〇g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體8 g/L 其溶劑為純化水； 3、 全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置 (a) 檢測(cè)溫度:37°C; (b) 檢測(cè)波長(zhǎng):主波長(zhǎng)600nm; (c) 反應(yīng)時(shí)間：10min，其中，孵育時(shí)間5min，加入試劑R2后立即測(cè)定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)； 4、 檢測(cè)步驟 (a) 取180ul試劑R1與15yl待測(cè)樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min;
(c) 加入60yl試劑R2,立即測(cè)定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計(jì)算吸光度變化 AA = A2-A1; (d) 根據(jù)樣本中髓過(guò)氧化物酶(MP0)的活性 （ng/mL)計(jì)算出樣本 中的髓過(guò)氧化物酶的濃度。
[0023] 表1為實(shí)施例1所制得的測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測(cè)定髓 過(guò)氧化物酶的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品1進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品1中的髓過(guò)氧化物酶的濃 度為105 ng/mL，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1:
由表1可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒對(duì)質(zhì)控品1的測(cè)定結(jié)果偏差較 小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0024] 表2為實(shí)施例1所制得的測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒以及實(shí)施例2所制得的測(cè)定髓過(guò)氧 化物酶的試劑盒分別對(duì)質(zhì)控品2進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，其中質(zhì)控品2中的髓過(guò)氧化物酶的濃度為 710 ng/mL，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2:
由表2可知，本發(fā)明所制得的測(cè)定全髓過(guò)氧化物酶的試劑盒對(duì)質(zhì)控品2的測(cè)定結(jié)果偏差 較小，因此測(cè)定準(zhǔn)確度高，而且實(shí)施例1為最優(yōu)的選擇。
[0025] 表3為實(shí)施例3所制得的測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多次 反復(fù)測(cè)定以及實(shí)施例4所制得的測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行的多次反 復(fù)測(cè)定，對(duì)所得的結(jié)果進(jìn)行SD和CV的計(jì)算，結(jié)果如下：
由表3可知本發(fā)明所制得的測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒的精密度比較好，而且由表3可 知，實(shí)施例3為最優(yōu)的選擇。
[0026]上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙 液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 60~180 mmol/L 表面活性劑 10~40 mmol/L 螯合劑 20~100 mmol/L 加速劑 5~15 g/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體1~8 g/L 其溶劑為純化水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨(dú)立 的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為： 試劑R1: 緩沖液 120 mmol/L 表面活性劑 25 mmol/L 整合劑 60 mmol/L 加速劑 1〇 g/L 防腐劑 0.7 g/L 穩(wěn)定劑 20 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L 防腐劑 0.7 g/L 穩(wěn)定劑 20 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體4g/L 其溶劑為純化水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒，其特征在于:所述的試 劑R1中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或多種的組合， 所述的表面活性劑采用吐溫-20、吐溫-80、曲拉通X-100中的一種或多種的組合，所述的螯 合劑為EDTA · 2Na、氨基三乙酸中的一種，所述的加速劑采用聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一種或多種的組合，所述的防腐劑采用苯酚、疊氮鈉、咪唑烷基 脲中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛血清白蛋白。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒，其特征在于:所述的試 劑R2中，所述的緩沖液采用Tris緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或多種的組合， 所述的防腐劑采用苯酚、疊氮鈉、咪唑烷基脲中的一種或多種的組合，所述的穩(wěn)定劑采用牛 血清白蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒，其特征在于:所述的試 劑R2中，所述的膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體的制備方法如下：用50 mmol/L的MES緩沖液 將粒徑為80-500nm的聚苯乙烯微球稀釋成為所含的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為1%-5%的溶 液，然后每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽，在 20 °C_37 °C的條件下反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完成后加入2，2 硫代雙鎳，使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，再將沉淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，使用超聲 分散儀進(jìn)行超聲分散，再使用離心機(jī)，在25000 rpm/min的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉 淀用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋，直至溶液中的聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為0.5%-3%為止， 然后邊攪拌邊加入抗髓過(guò)氧化物酶抗體，直至聚苯乙烯微球的質(zhì)量濃度為0.5-2.0%，然后 加入牛血清白蛋白，使得牛血清白蛋白最終濃度為20 g/L為止，然后在4°C條件下封閉8-12 小時(shí)，即可制備得到膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒的制備方法和使用方法， 其特征在于:包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 60~180 mmol/L 表面活性劑 10~40 mmol/L 螯合劑 20~100 mmol/L 加速劑 5~15 g/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 50~150 mmol/L 防腐劑 0.5~1.0 g/L 穩(wěn)定劑 10~30 g/L 膠乳包被抗髓過(guò)氧化物酶抗體1~8 g/L 其溶劑為純化水； (b) 將待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)； (c) 用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定反應(yīng)后的吸光度差值； (d) 根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的髓過(guò)氧化物酶的濃度。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒的制備方法和使用方法，其 特征在于:步驟(b)中，所述的試劑R1和試劑R2的體積比為3:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種測(cè)定髓過(guò)氧化物酶的試劑盒的制備方法和使用方法，其 特征在于:步驟(b)中，所述的待測(cè)樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:5到1:30 之間。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK106053365SQ201610358113
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運(yùn)
【申請(qǐng)人】安徽伊普諾康生物技術(shù)股份有限公司