檢測自身免疫性腎病的免疫印跡試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測自身免疫性腎病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；包括：反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由C1q、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八種抗原中4～8種天然或重組抗原包被而成特定組合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50μL/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25μL/mL判斷指示帶，1條低濃度1~10μL/mL判斷指示帶；本發(fā)明克服單一自身抗體檢測靈敏度和特異性不足、數(shù)種疾病相關(guān)自身抗體逐一單獨(dú)檢測在操作上的繁瑣，大大提高檢測效率和結(jié)果判斷的準(zhǔn)確度。
【專利說明】
檢測自身免疫性腎病的免疫印跡試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測多種自身免疫性腎病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，還設(shè)及該 免疫印跡試劑盒的制備方法及使用方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體免疫系統(tǒng)的主要功能是識別和清除抗原性異物。正常情況下，機(jī)體對自身組 織成分一般不會產(chǎn)生免疫應(yīng)答，稱為免疫耐受。一旦運(yùn)種耐受被打破，就會發(fā)生自身免疫性 疾病。自身免疫性疾病突出表現(xiàn)為血清中多種自身抗體的形成及全身多臟器損傷，腎臟是 最常見、最重要的受累器官之一。在各種自身免疫性腎病中，部分自身抗體既是某類疾病的 標(biāo)志性抗體，同時也可能是直接的致病性抗體，與病情活動及預(yù)后密切相關(guān)。
[0003] 免疫性腎炎由各種病因引起的原發(fā)于腎臟的慢性腎小球疾病。又稱為原發(fā)性免疫 性腎炎與繼發(fā)性者相區(qū)別。臨床上將由全身性疾病如糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、痛風(fēng)等引起 的繼發(fā)性慢性腎臟損害，按其原發(fā)病命名，如糖尿病腎病、狼瘡性腎炎等。由于運(yùn)些病例的 診斷和治療主要依據(jù)全身性疾病（如糖尿病等），與原發(fā)性者有很大區(qū)別。在中國免疫性腎 炎的發(fā)病率仍很高，1981年人群發(fā)生率為0. 28~0. 89%，是引起慢性腎功能衰竭的最重要 病因之一（占60%)。不同病因引起的免疫性腎炎在癥狀上相似，治療上有共同之處，但預(yù)后 從輕到重各不相同。本病主要是通過免疫性反應(yīng)造成的腎損傷，不同的病因可W有相同的 腎損害。臨床表現(xiàn)有不同程度的蛋白尿、血尿、管型尿、水腫、高血壓及不同程度的腎功能損 害。起病可急可緩，但多數(shù)病例不是從急性腎炎演變而來。因此，對免疫性腎炎的理解，應(yīng) 為潛在病理改變的持續(xù)性或進(jìn)行性發(fā)展，使病情遷延，成為慢性，而不單純是急性腎炎的慢 性階段。早期診斷有助于自身免疫性疾病的臨床控制。
[0004] 許多自身抗體在相關(guān)疾病的發(fā)病前一段時間就可從血清中檢測到。幾十年來，免 疫學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)多數(shù)自身免疫性腎病患者血清中存在著特異性自身抗體，例如狼瘡性腎炎 化N)的抗Clq抗體、抗核小體（Nucleosome)抗體和抗雙鏈DNA (dsDNA)抗體，原發(fā)性壞死性 新月體性腎小球腎炎（NCGN)的抗髓過氧化物酶(MP0)抗體，由韋格拉肉芽腫?。╓G)誘發(fā)腎 炎的抗蛋白酶3抗體（PR3 )，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎的抗腎小球基底膜抗體（GBM)， 膜性腎病（MN)的抗憐脂酶A2受體（PLA2R)抗體和成人特發(fā)性膜性腎病的1型血小板反應(yīng) 蛋白7A (raSD7A)抗體，許多特異性自身抗體是自身免疫性腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)中重要的組成部 分。
[00化]Clq分子分為頭狀區(qū)和膠原區(qū)：頭狀區(qū)可與IgG的C肥結(jié)構(gòu)域結(jié)合；膠原樣區(qū)有6 個結(jié)合Clr和Cls的位點。
[0006] 抗Clq抗體與狼瘡性腎炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并可W預(yù)測狼瘡性腎炎病情的 復(fù)發(fā)，動物實驗表明，Clq和抗Clq抗體組成的免疫復(fù)合物可W沉積在腎臟，并引起補(bǔ)體激 活、白細(xì)胞浸潤、炎癥損傷和蛋白尿；體外實驗表明活動性狼瘡腎炎患者血清患者的血清 引起正常人淋己細(xì)胞調(diào)亡明顯高于非活性狼瘡腎炎患者和正常人，且調(diào)亡的細(xì)胞比例與 抗Clq抗體滴度密切相關(guān)。在狼瘡腎（lupus η巧虹itis，IN)患者中，存在著抗Clq抗體 的高表達(dá)，抗Clq抗體在IN疾病中起較為重要作用?？笴lq抗體是反映系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (system lupus eirthematosus，SLE)患者并發(fā)腎臟損傷的重要指標(biāo)，在IN診斷和判定其 活動性方面有重要作用，與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，能較好的反映 SLE病情的活動性 核小體是染色質(zhì)的基本單位，每個核小體由組蛋白八聚體和DNA構(gòu)成。調(diào)亡細(xì)胞是核 小體的重要來源，SLE中細(xì)胞調(diào)亡增多，導(dǎo)致核小體的過渡釋放。由于核小體與其他狼瘡自 身抗原聚集在調(diào)亡小體內(nèi)，由此推測SLE循環(huán)中持續(xù)存在的調(diào)亡細(xì)胞觸發(fā)了自身抗體的產(chǎn) 生。相同個體中抗組蛋白抗體與抗dsDNA抗體伴隨出現(xiàn)，說明運(yùn)兩種自身抗體有相同的祀 抗原，即由dsDNA和組蛋白構(gòu)成的核小體誘導(dǎo)產(chǎn)生。狼瘡病血清特異性的研究證明核小體 是狼瘡抗dsDNA抗體和抗組蛋白抗體的首要專一的祀抗原。
[0007] 抗核小體抗體家族在臨床上只出現(xiàn)于SLE、硬皮病和混合性結(jié)締組織病。高水平 的抗核小體IgG抗體幾乎是僅在SLE中出現(xiàn)。目前臨床實驗室診斷SLE的標(biāo)志性抗體為抗 dsDNA抗體，運(yùn)兩種抗體診斷SLE的特異性高，但敏感性差，SLE患者中抗dsDNA抗體陽性率 為30%~90%，特異性為90% ;抗核小體抗體陽性率為58%~66%，特異性為98%。 陽00引抗dsDNA是SLE患者的特征性抗體，抗體的滴度與疾病的活動程度有相關(guān)性?？?核小體抗體可出現(xiàn)在SLE活動期或非活動期，抗dsDNA抗體陰性的SLE患者抗核小體抗體 是一個敏感的指標(biāo)?？购诵◇w抗體效價與疾病活動性有密切關(guān)系，在SLE的診斷和疾病監(jiān) 測中有重要意義。
[0009] 抗蛋白酶3 (PR3)抗體屬于抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA)中的一種，是cANCA的 主要祀抗原，在間接免疫巧光法檢測用乙醇固定的中性粒細(xì)胞呈cANCA巧光模式，ANCA是 鑒別診斷血管炎的重要標(biāo)記物?？筆R3抗體是韋格拉肉芽腫病（WG)的特異性抗體。盡管 其發(fā)病機(jī)制不清，但是抗PR3抗體與韋格拉肉芽腫病發(fā)病機(jī)制具有一定的相關(guān)性。
[0010] cANCA診斷WG的特異性為90%，活動性WG患者在病變尚未影響到呼吸系統(tǒng)時 cANCA敏感性是65%，當(dāng)患者出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)、腎臟損害時其靈敏度達(dá)90% W上。
[0011] 髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MP0)又稱過氧化物酶，是一種重要的含鐵溶酶 體，存在于髓系細(xì)胞（主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞）的嗜苯胺藍(lán)顆粒中，是髓細(xì)胞的特異 性標(biāo)志，隨著對MP0研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)MP0基因多態(tài)性導(dǎo)致個體對一些疾病易感性的差 異，與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因此越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。
[0012] 抗髓過氧化酶抗體（myeloperoxidase~antineutro地il cy~toplasmic antibody, MPO~ANCA)是抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（ANCA)相關(guān)性血管炎（antineutro地il c}ftopasmic antibody associated vasculitis,AAV)的主要自身抗體之一，是我國 AAV 患 者血清中的最主要自身抗體。臨床研究報道，MP0~ANCA陽性母親可通過胎盤傳遞自身抗體， 導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)MP0~ANCA相關(guān)性血管炎（MP0~ANCA associated vasculitis,MP0~AAV)的 臨床表現(xiàn)腎小球腎炎和肺出血。
[0013] 抗MP0抗體主要見于原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、顯微鏡下多動 脈炎（MPA)和變應(yīng)性肉芽腫血管炎（CSS)，還見于結(jié)節(jié)性多動脈炎（PAN)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (SLE )、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)、干燥綜合性（SS )和系統(tǒng)性硬化?。⊿Sc )等疾病。MP0~ANCA抗 體的濃度與病情的活動性相關(guān)，可用于早期診斷、判斷療效、估計復(fù)發(fā)和指導(dǎo)臨床治療。
[0014] 腎小球基底膜是由腎小球毛細(xì)血管內(nèi)外透明層及中間致密層構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，W 糖蛋白為主體?？笹BM抗體就是血清中會"攻擊"基底膜的一種抗體。
[0015] 抗腎小球基底膜（GBM)抗體相關(guān)疾病是一組自身免疫性疾病，該病的致病因素為 血清存在抗GBM抗體。由于肺和腎小球的基底膜具有共同的抗原，因此主要的受累臟器是 肺和腎臟。腎臟受累多為新月體性腎炎，腎功能損害進(jìn)展迅速，少數(shù)為輕度系膜增生性腎 炎，可保持腎功能正常。
[0016] 抗GBM抗體陽性病人占自身免疫性腎炎的5%，在腎小球性腎炎、抗腎小球基底膜 (GBM)抗體相關(guān)疾病中有80%的陽性檢出率，半月體形成性腎小球腎炎患者中有20%~70% 的陽性檢出率，也可在增殖性腎炎中檢出。
[0017] 膜性腎?。╩embranous η巧虹opathy，MN)是成人腎病綜合征的主要病因之一。約 Ξ分之一的病人出現(xiàn)腎功能逐漸下降，并最后發(fā)展到終末期腎病。MN病因明確者為繼 發(fā)性膜性腎病（Secendary membranous η巧虹opathy，SMN)，病因未明者稱特發(fā)性膜性腎 病（Idiotpathic membranous η巧虹opathy，IMN)。國外報道IMN占原發(fā)性腎病綜合征的 309?^40%。迄今為止，MN診斷與鑒別診斷的金指標(biāo)仍是病理組織學(xué)，IMN往往有一些組織病 理學(xué)上的特點，可與SMN相鑒別，但有時即使是從腎臟病理組織學(xué)也很難將二者完全區(qū)別， 從而導(dǎo)致誤診及延誤治療。
[0018] 特發(fā)性膜性腎病（ΙΜΝ)是導(dǎo)致成人腎病綜合征（NS)的常見原因。2009年，人們發(fā) 現(xiàn)憐脂酶Α2的1型受體（PLA2R1)是參與成人ΙΜΝ致病主要抗體，70%ΙΜΝ患者體內(nèi)具有針 對PLA2R1的循環(huán)抗體。如今有部分學(xué)者認(rèn)為ΙΜΝ是一種自身免疫性疾病。其余30%ΙΜΝ的 患者中可能存在其它導(dǎo)致疾病的內(nèi)源性腎小球抗原，經(jīng)最新發(fā)現(xiàn)部分ΜΝ患者的血清中存 在針對1型血小板反應(yīng)蛋白7Α域（raSD7A)而非PLA2R1的循環(huán)抗體，并且證實THSD7A是 參與成人1麗發(fā)病的第二個抗原。W及針對THSD7A而非PLA2R1的循環(huán)抗體。結(jié)果提示 THSD7A是參與成人IMN發(fā)病的第二個抗原，抗THSD7A抗體陽性的患者代表了明顯不同的 一個1麗患者亞組。運(yùn)將有助于我們進(jìn)一步理解麗的發(fā)病機(jī)制，并進(jìn)一步將1麗從繼發(fā)性 麗中區(qū)別出來。
[0019] 狼瘡性腎炎、原發(fā)性壞死性新月體腎小球腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎、膜 性腎病等是常見的自身免疫性腎病，其臨床表現(xiàn)的特點往往被患者忽視，因此需要定期篩 查。本發(fā)明的自身免疫性腎臟病免疫印跡檢測試劑盒可針對多種腎病抗體進(jìn)行同時檢測， 從而使得我們該類患者的病況有了更快速、直觀、準(zhǔn)確、全面的判斷，利于對患者進(jìn)行及時 的診斷和正確的治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明的目的在于針對目前缺乏多種免疫性腎病實驗檢查乃至體格檢查專用的 免疫印跡法產(chǎn)品，W及現(xiàn)有的免疫印跡試劑存在的一些，采用8種抗原中的4~8種抗原 物質(zhì)，組合用于對腎病的篩查、鑒別診斷、預(yù)后判斷、療效評估，使之有了更明確具體的客 觀實驗指標(biāo)，從而提出的一種檢測自身免疫性腎病的免疫印跡試劑盒及其制備方法，檢測 自身免疫性腎病抗體的免疫印跡試劑盒，包括：反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底物、洗涂液、樣 本稀釋液和終止液，其特征在于：所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素 膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由Clq、MP0、PR3、GBM、 Nucleosome、dsDNA、PLA2R和Y服D7A八種抗原中4~8種天然或重組抗原包被而成特定組 合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50 μ L/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25 μ L/mL判 斷指示帶，1條低濃度1~10 μ L/mL判斷指示帶。
[0021] 進(jìn)一步的，所述的載體為雙面粘性的PVC板，正面與所述的硝酸纖維素膜或尼龍 膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板。
[0022] 進(jìn)一步的，所述的高濃度判斷指示帶、中濃度判斷指示帶、低濃度判斷指示帶由人 IgG，或抗鼠 IgG或羊IgG劃線而成。
[0023] 進(jìn)一步的，所述的酶免結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗人IgG ;所述的顯色底 物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗涂液為20XTris緩沖液；所述樣本稀釋液為含封閉劑的Tris 緩沖液；所述的終止液為0. 1 M/L硫酸。 W24] 進(jìn)一步的，在同一硝酸纖維素膜或尼龍膜上，同時包被Clq、MP0、PR3、GBM、 Nucleosome、dsDNA、PLA2R和Y服D7A八種抗原中的至少4天然或重組抗原，分別包被形成 的4~8條平行的檢測線，可同時、快捷的、準(zhǔn)確的對狼瘡性腎炎（LN)，原發(fā)性壞死性新月體 性腎小球腎炎（NCGN)，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎，膜性腎?。悾┖统扇颂匕l(fā)性膜性腎 病等多種腎病進(jìn)行檢測篩查。
[0025] 試劑盒的制備方法，包括有反應(yīng)膜條制備方法有兩種，包括貼膜法和劃線法，其特 征在于所述反應(yīng)膜條制備方法包括W下步驟： (1)貼膜法： 1) 配制點樣溶液：將 Clq、MP0、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 Y服D7A 抗原，及 人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2) 包被抗原：根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理 吸附和共價結(jié)合的方式，將1)中配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成 獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶； 3) 干燥：將包被好的膜片條放入37°C恒溫干燥2個小時； 4) 貼膜：將干燥好的NC膜平整貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用； 5) 切膜：將4)中貼好的膜片按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度的條帶； 6) 組裝：通過模具，將5)中的條帶按次序貼于透明的陽T底襯板上； 7) 切條：用切紙機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。
[0026] (2)劃線法： 1) 配制點樣溶液：將 Clq、MP0、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 dsDNA 抗原，及 人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2) 固定抗原：使用免疫印跡點樣器在一整張的硝酸纖維膜或尼龍膜上，通過物理吸附 和共價結(jié)合的方式，將1)中配置好的點樣溶液W-定的排列次序固定在膜片上，形成獨(dú)立 的檢測線和判斷指示帶； 3) 干燥：將包被好的膜片條放入37 °C恒溫干燥2個小時； 4) 切條：用切紙機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。
[0027] 進(jìn)一步的，在2)步完成點樣后，將膜片從免疫印跡點樣器取出室溫下放置1小時。 陽02引進(jìn)一步的，固定抗原和質(zhì)控的點樣量控制在lOng~30ng。
[0029] 進(jìn)一步的，判斷指示帶的寬度均為7 mm，抗原條帶的寬度均為5 mm。
[0030] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過一份臨床樣本和一次檢測反應(yīng)檢測多種自身抗體， 克服單一自身抗體檢測靈敏度和特異性不足、數(shù)種疾病相關(guān)自身抗體逐一單獨(dú)檢測在操作 上的繁瑣，大大提高檢測效率和結(jié)果判斷的準(zhǔn)確度。設(shè)及的自身免疫性腎病包括狼瘡性腎 炎、原發(fā)性壞死性新月體腎小球腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎、膜性腎病。另外還 有： 反應(yīng)膜條上包被的抗原為從動物組織中提取的天然抗原或采用昆蟲細(xì)胞或桿狀病毒 真核表達(dá)的方式獲得的重組蛋白，提高了自身免疫性疾病診斷的敏感性和特異性； 抗原包被采用全自動點樣儀，保證膜條上判斷指示帶及各抗原帶位置的準(zhǔn)確性，且可 根據(jù)檢查需求進(jìn)行合理排序，區(qū)別于傳統(tǒng)的SDS~PAGE技術(shù)按分子量大小將抗原依次分開 轉(zhuǎn)移至印跡膜上，同時保證了抗原決定簇構(gòu)象的完整性； 單人份膜條上同時包被有8種抗原，可實現(xiàn)一份臨床樣本一次實驗最多同時檢測8中 抗體，為多種自身抗體免疫性腎病的臨床診斷提供血清學(xué)依據(jù)； 具有高濃度判斷指示帶、中濃度判斷指示帶和低濃度判斷指示帶，使結(jié)果判斷更為直 觀準(zhǔn)確，為自身免疫性腎病的病程檢測及治療后提供全面指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原及判斷指示帶分布示意圖； 圖2為本發(fā)明所述的試劑盒中反應(yīng)膜條的PVC板、硝酸纖維素膜或尼龍膜和PET底襯 板的組合結(jié)構(gòu)圖； 圖3為本發(fā)明實施例1所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖4為本發(fā)明實施例2所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖5為本發(fā)明實施例3所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖6為本發(fā)明實施例4所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖7為本發(fā)明實施例5所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖8為本發(fā)明實施例6所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖9為本發(fā)明實施例7所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖10為本發(fā)明實施例8所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖11為本發(fā)明實施例9所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖12為本發(fā)明實施例10所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖13為本發(fā)明實施例11所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖14為本發(fā)明實施例12所述的試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原組合示意圖； 圖15為本發(fā)明實施例13所述的試劑盒中反應(yīng)膜條制備劃線法中其中一種組合示意 圖。
【具體實施方式】
[0032] W下結(jié)合附圖和優(yōu)選的具體實施例詳細(xì)說明：本發(fā)明公開了一種檢測多種自身免 疫性腎病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W借鑒本文內(nèi)容， 通過適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)而實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的的替換和改動對本領(lǐng)域技 術(shù)人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案之內(nèi)。本 發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施實例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā) 明技術(shù)，檢測自身免疫性腎病抗體的免疫印跡試劑盒，包括：反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底 物、洗涂液、樣本稀釋液和終止液，其特征在于：所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的 硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由Clq、MPO、 PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和Y服D7A八種抗原中4~8種天然或重組抗原包被 而成特定組合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50 μ L/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25 μ L/血判斷指示帶，1條低濃度1~10 μ L/血判斷指示帶。
[0033] 進(jìn)一步的，所述的載體為雙面粘性的PVC板，正面與所述的硝酸纖維素膜或尼龍 膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板。
[0034] 進(jìn)一步的，所述的高濃度判斷指示帶、中濃度判斷指示帶、低濃度判斷指示帶由人 IgG，或抗鼠 IgG或羊IgG劃線而成。
[0035] 進(jìn)一步的，所述的酶免結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗人IgG ;所述的顯色底 物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗涂液為20XTris緩沖液；所述樣本稀釋液為含封閉劑的Tris 緩沖液；所述的終止液為0. 1 M/L硫酸。 W36] 進(jìn)一步的，在同一硝酸纖維素膜或尼龍膜上，同時包被Clq、MP0、PR3、GBM、 Nucleosome、dsDNA、PLA2R和Y服D7A八種抗原中的至少4天然或重組抗原，分別包被形成 的4~8條平行的檢測線，可同時、快捷的、準(zhǔn)確的對狼瘡性腎炎（LN)，原發(fā)性壞死性新月體 性腎小球腎炎（NCGN)，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎，膜性腎?。悾┖统扇颂匕l(fā)性膜性腎 病等多種腎病進(jìn)行檢測篩查。
[0037] 所述試劑盒的制備方法，包括有反應(yīng)膜條制備方法有兩種，包括貼膜法和劃線法， 其特征在于所述反應(yīng)膜條制備方法包括W下步驟： (1)貼膜法： 1) 配制點樣溶液：將 Clq、MP0、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 Y服D7A 抗原，及 人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2) 包被抗原：根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理 吸附和共價結(jié)合的方式，將1)中配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成 獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶； 3) 干燥：將包被好的膜片條放入37°C恒溫干燥2個小時； 4) 貼膜：將干燥好的NC膜平整貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用； 5) 切膜：將4)中貼好的膜片按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度的條帶； 6) 組裝：通過模具，將5)中的條帶按次序貼于透明的陽T底襯板上； 7) 切條：用切紙機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。 陽03引 （2)劃線法： 1) 配制點樣溶液：將 Clq、MP0、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 dsDNA 抗原，及 人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2) 固定抗原：使用免疫印跡點樣器在一整張的硝酸纖維膜或尼龍膜上，通過物理吸附 和共價結(jié)合的方式，將1)中配置好的點樣溶液W-定的排列次序固定在膜片上，形成獨(dú)立 的檢測線和判斷指示帶； 3) 干燥：將包被好的膜片條放入37 °C恒溫干燥2個小時； 4)切條：用切紙機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。
[0039] 進(jìn)一步的，在2)步完成點樣后，將膜片從免疫印跡點樣器取出室溫下放置1小時。 W40] 進(jìn)一步的，固定抗原和質(zhì)控的點樣量控制在lOng~30ng。 陽041] 進(jìn)一步的，判斷指示帶的寬度均為7 mm，抗原條帶的寬度均為5 mm。
[0042] 所述貼膜法，參照圖1、圖2中所示，所述反應(yīng)膜條的載體為雙面粘性的PVC板13， 正面與形成檢測線和判斷指示帶之后的所述硝酸纖維素或尼龍膜14固定粘接，背面固定 粘接有透明的PET底襯板12。所述的高濃度判斷指示帶、中濃度判斷指示帶和低濃度判斷 指示帶由人IgG，或鼠 IgG或抗羊IgG劃線而成。所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠 抗人IgG ;所述的顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗涂液為20XTirs緩沖液；所述樣本 稀釋液為含封閉劑的Tirs緩沖液；所述的終止液為0. 1 M/L硫酸。所述劃線法中的反應(yīng)膜 條直接使用硝酸纖維素或尼龍膜14為抗原載體。
[0043] 為是本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，運(yùn)些實施例 僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0044] 實施例1 將 Clq、MP0、PR3、GBM、PLA2R、raSD7A、Nuclesome 和 dsDNA 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/mL 的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示 帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶 配制成相應(yīng)的包被濃度待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜 片，通過物理吸附和共價結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在 膜片上，形成獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37Γ恒溫烘箱中干燥2小 時后取出貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬 度條帶，其中判斷指示帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按 次序粘貼于透明的PET底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本 實施例制備的膜條可適用于狼瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、 抗腎小球基底膜型腎小球腎炎、韋格拉肉芽腫?。╓G)誘發(fā)的腎炎、膜性腎?。∕N)和成人特 發(fā)性膜性腎病的檢測。 W45] 實施例2 將 Clq、MP0、PR3、GBM、PLA2R、raSD7A 和 Nuclesome 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/mL 的濃度， 及人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度 范圍為12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相 應(yīng)的包被濃度待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物 理吸附和共價結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形 成獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼 于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其 中判斷指示帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于 透明的PET底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備 的膜條可適用于狼瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、韋格拉肉芽 腫?。╓G)誘發(fā)的腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎、膜性腎?。悾┖统扇颂匕l(fā)性膜性腎 病的檢測。
[0046] 實施例3 將 Clq、MP0、PR3、GBM、PLA2R、raSD7A 和 dsDNA 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/血的濃度，及人 IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為 12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包 被濃度待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附 和共價結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立 的檢測線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙 面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判 斷指示帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明 的PET底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜 條可適用于狼瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、韋格拉肉芽腫病 (WG)誘發(fā)的腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎、膜性腎病（麗）和成人特發(fā)性膜性腎病的 檢測。 W47] 實施例4 將 Clq、MP0、PR3、GBM、PLA2R、Nuclesome 和 dsDNA 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/mL 的濃度， 及人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度 范圍為12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為]-10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相 應(yīng)的包被濃度待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物 理吸附和共價結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形 成獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37Γ恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼 于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其 中判斷指示帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于 透明的PET底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備 的膜條可適用于狼瘡性腎炎（LN)、抗核小體（Nucleosome)抗體，原發(fā)性壞死性新月體性腎 小球腎炎（NCGN)，由韋格拉肉芽腫病（WG)誘發(fā)的腎炎，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎和膜 性腎病（麗）的檢測。 引實施例5 將 Clq、MP0、PR3、GBM、PLA2R、Nuclesome 和 dsDNA 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/mL 的濃度， 及人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度 范圍為12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相 應(yīng)的包被濃度待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物 理吸附和共價結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形 成獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼 于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其 中判斷指示帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于 透明的PET底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備 的膜條可適用于狼瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉 芽腫?。╓G)誘發(fā)腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎和成人特發(fā)性膜性腎病的檢測。 W例實施例6 將 Clq、MPO、PR3、GBM、PLA2R 和 dsDNA 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/mL 的濃度，及人 IgG、抗 鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包被濃度 待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜化通過物理吸附和共價 結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立的檢測 線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37Γ恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面粘性 的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷指示 帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的PET 底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條可適 用于狼瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫病（WG) 誘發(fā)的腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎和膜性腎?。∕N)的檢測。
[0050] 實施例7 將 Clq、MP0、PR3、GBM、raSD7A 和 Nuclesome 抗原按照 0. 05~0. 1 mg/血的濃度，及人 IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為 12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包 被濃度待用。根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附 和共價結(jié)合的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立 的檢測線和判斷指示帶。將包被好的膜片放入37Γ恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面 粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷 指示帶的寬度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的 PET底襯板上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條 可適用于狼瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫病 (WG)誘發(fā)的腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎和成人特發(fā)性膜性腎病的檢測。 陽0川 實施例8 將Clq、MP0、PR3、GBM和raSD7A抗原按照0. 05~0. 1 mg/血的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG 或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL 的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包被濃度待用。 根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附和共價結(jié)合 的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線和 判斷指示帶。將包被好的膜片放入37Γ恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面粘性的PVC 板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷指示帶的寬 度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的PET底襯板 上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條可適用于狼 瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫病（WG)、誘發(fā) 腎炎抗腎小球基底膜型腎小球腎炎和成人特發(fā)性膜性腎病的檢測。 陽0巧 實施例9 將Clq、MP0、PR3、GBM和PLA2R抗原按照0. 05~0. 1 mg/血的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG 或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL 的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包被濃度待用。 根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附和共價結(jié)合 的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線和 判斷指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面粘性的PVC 板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷指示帶的寬 度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的PET底襯板 上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條可適用于狼 瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫?。╓G)誘發(fā)的 腎炎、抗腎小球基底膜型腎小球腎炎和膜性腎病（MN)的檢測。 陽〇5引實施例10 將Clq、MPO、PR3、GBM和dsDNA抗原按照0. 05~0. 1 mg/mL的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG 或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL 的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包被濃度待用。 根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附和共價結(jié)合 的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線和 判斷指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面粘性的PVC 板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷指示帶的寬 度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的PET底襯板 上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條可適用于狼 瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫病（WG)誘發(fā)的 腎炎，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎的檢測。
[0054] 實施例11 將Clq、MP0、PR3、GBM和dsDNA抗原按照0. 05~0. 1 mg/mL的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG 或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL 的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包被濃度待用。 根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附和共價結(jié)合 的方式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線和 判斷指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面粘性的PVC 板的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷指示帶的寬 度為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的PET底襯板 上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條可適用于狼 瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫病（WG)誘發(fā)的 腎炎，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎的檢測。 陽0對實施例12 將Clq、MP0、PR3和GBM抗原按照0. 05~0. 1 mg/mL的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG或抗羊 IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL的中 濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶配制成相應(yīng)的包被濃度待用。根據(jù) 免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理吸附和共價結(jié)合的方 式，將上述配置好的點樣溶液W-定的排列次序包被在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線和判斷 指示帶。將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出貼于雙面粘性的PVC板 的正面，PVC板的背面待用，再按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度條帶，其中判斷指示帶的寬度 為7mm，抗原條帶寬度為5mm。通過模具將切好的各條帶按次序粘貼于透明的PET底襯板 上，再用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。本實施例制備的膜條可適用于狼 瘡性腎炎（LN)、原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)、由韋格拉肉芽腫?。╓G)誘發(fā)的 腎炎，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎的檢測。
[0056] 實施例13 將(：19、]\^0、？1?3、681、伽。16〇3〇1116、(130臟、？1^\21?和￥服074抗原按照0.05~0.1111邑/1^ 的濃度，及人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控按照濃度范圍為30~50 μ g/mL的高濃度指示 帶、濃度范圍為12~25 μ g/mL的中濃度指示帶、濃度范圍為1~10 μ g/mL的低濃度指示帶 配制成相應(yīng)的包被濃度待用。將配備好的點樣液通過免疫印跡點樣器在一整張硝酸纖維素 膜上按照指定的排列依次劃線，將包被好的膜片放入37°C恒溫烘箱中干燥2小時后取出， 使用滾切機(jī)將其切成寬度為2mm的單人份反應(yīng)膜條。
[0057] 膜條上包被抗原的組合方式如下表所示：
本發(fā)明試劑盒的使用方法 樣本要求：樣本為人血清。使用新鮮樣本或于~20°C凍存樣本，凍存樣本只能復(fù)溶一 次，勿使用熱滅活的樣本。避免使用嚴(yán)重脂血、黃痘、溶血及污染的樣本。。
[0058] 1、洗涂液配制：用19份蒸饋水稀釋1份20X的濃縮洗涂液，混勻，備用。
[0059] 2、檢測步驟 1)將檢測膜條放入解育盤中，有編碼的一面朝上。 W60] 2)用1血解育緩沖液潤濕檢測膜條，1分鐘后移棄緩沖液。 陽06U 3)加入1血已稀釋的樣本，室溫解育30分鐘遇搖床輕搖)。
[0062] 4)移棄已稀釋的樣本，不留殘液。
[0063] 5)用1. 5mL洗涂液洗涂檢測膜條，輕搖，每次5分鐘，洗涂完后棄除洗涂液，重復(fù)3 次。
[0064] 6)加入1血酶聯(lián)物溶液，室溫解育30分鐘(置搖床輕搖)。
[00化]7)移棄酶聯(lián)物溶液。
[0066] 8)重復(fù)步驟5。 9)加入ImL TMB底物溶液，室溫避光解育10分鐘(置搖床輕搖)。
[0067] 10)移棄底物溶液。
[0068] 11)用1. 5血蒸饋水洗涂，同時輕搖，1分鐘后移棄蒸饋水。 W例 12)加入1血終止液，室溫解育5分鐘。
[0070] 13)移棄終止液。
[0071] 14)用濾紙吸干檢測膜條上殘留的液體。
[0072] 3、結(jié)果判斷 完成后，可采用目測、手工黏貼到掃描儀掃描固定卡然后借助特定的判讀軟件或使用 全自動的判讀分析儀器對檢測結(jié)果進(jìn)行判讀，結(jié)果可判斷為陰性、弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽 性或輸出為量化的數(shù)值。
【主權(quán)項】
1. 檢測自身免疫性腎病抗體的免疫印跡試劑盒，包括：反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底 物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，其特征在于：所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的 硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有：分別由Clq、MPO、 PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R和YHSD7A八種抗原中4~8種天然或重組抗原包被 而成特定組合的平行的檢測線，1條高濃度為30~50 μ L/mL判斷指示帶，1條中濃度15~25 μ L/mL判斷指示帶，1條低濃度]-10 μ L/mL判斷指示帶。2. 根據(jù)專利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的載體為雙面粘性的PVC板，正面 與所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板。3. 根據(jù)專利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的高濃度判斷指示帶、中濃度判斷 指示帶、低濃度判斷指示帶由人IgG，或抗鼠 IgG或羊IgG劃線而成。4. 根據(jù)專利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的酶免結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo) 記的鼠抗人IgG ;所述的顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗滌液為20XTris緩沖液；所 述樣本稀釋液為含封閉劑的Tris緩沖液；所述的終止液為0. 1 M/L硫酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：在同一硝酸纖維素膜或尼龍膜上，同時 包被 Clq、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 YHSD7A 八種抗原中的至少 4 天然或 重組抗原，分別包被形成的4~8條平行的檢測線，可同時、快捷的、準(zhǔn)確的對狼瘡性腎炎 (LN)，原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN)，抗腎小球基底膜型腎小球腎炎，膜性腎病 (MN)和成人特發(fā)性膜性腎病等多種腎病進(jìn)行檢測篩查。6. 權(quán)利要求1~5任一項所述試劑盒的制備方法，包括有反應(yīng)膜條制備方法有兩種，包 括貼膜法和劃線法，其特征在于所述反應(yīng)膜條制備方法包括以下步驟： (1) 貼膜法： 1) 配制點樣溶液：將 Clq、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 YHSD7A 抗原，及 人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2) 包被抗原：根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜栽成膜片，通過物理 吸附和共價結(jié)合的方式，將1)中配置好的點樣溶液以一定的排列次序包被在膜片上，形成 獨(dú)立的檢測線和判斷指示帶； 3) 干燥：將包被好的膜片條放入37 °C恒溫干燥2個小時； 4) 貼膜：將干燥好的NC膜平整貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用； 5) 切膜：將4)中貼好的膜片按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度的條帶； 6) 組裝：通過模具，將5)中的條帶按次序貼于透明的PET底襯板上； 7) 切條：用切紙機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。 (2) 劃線法： 1) 配制點樣溶液：將 Clq、MPO、PR3、GBM、Nucleosome、dsDNA、PLA2R 和 dsDNA 抗原，及 人IgG、抗鼠 IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2) 固定抗原：使用免疫印跡點樣器在一整張的硝酸纖維膜或尼龍膜上，通過物理吸附 和共價結(jié)合的方式，將1)中配置好的點樣溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成獨(dú)立 的檢測線和判斷指示帶； 3) 干燥：將包被好的膜片條放入37 °C恒溫干燥2個小時； 4) 切條：用切紙機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：在2)步完成點樣后，將膜片從免疫 印跡點樣器取出室溫下放置1小時。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：固定抗原和質(zhì)控的點樣量控制在 10ng~30ng。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：判斷指示帶的寬度均為7 mm，抗原條 帶的寬度均為5 mm。
【文檔編號】G01N33/564GK105823873SQ201510386459
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年7月3日
【發(fā)明人】何林, 胡鹍輝, 劉清波, 陽輝
【申請人】深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司