一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其包括以下質(zhì)量分數(shù)或摩爾濃度的各組分：聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為0.1％?0.4％；核糖的濃度為10?100mM；檸檬酸的質(zhì)量分數(shù)為0.1?0.5％；乙二酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.2?0.6％；高硼酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.01?0.05％；TMB的質(zhì)量分數(shù)為0.01?0.05％。本發(fā)明是一種單組份TMB顯色液，使用時無需再單獨配制，操作更加方便，可以避免人為操作帶來的誤差，更客觀地反應(yīng)真實的數(shù)據(jù)。因該發(fā)明中加入高分子聚合物(PVA)和一種單糖分子(核糖)，只有兩者同時存在時，才能保證本發(fā)明的TMB顯色液能夠長時間的保存，而不影響其靈敏度，能夠增加TMB的溶解性和穩(wěn)定性，保證了TMB長時間的保存，保持單相溶液的存在。
【專利說明】
-種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶聯(lián)免疫吸附測定化nzyme-linked immunosorbent assay)，簡稱EILISA，是一種 在免疫學反應(yīng)基礎(chǔ)上，將抗原-抗體的專一性反應(yīng)和酶對底物高效催化作用相結(jié)合發(fā)展起 來的一種高效簡便的定性和定量的檢測方法。由于化SIA檢測方法簡單、靈敏度高、快速等 優(yōu)點，自發(fā)明W來使其技術(shù)得到迅速發(fā)展，已被廣泛地應(yīng)用于各種生命科學和醫(yī)藥科學的 許多領(lǐng)域。ELISA最終的檢驗方法有多種，但最常見的都是通過酶結(jié)合物和顯色液進行反應(yīng) 來判定的。辣根過氧化物酶是化SIA實驗中應(yīng)用最廣泛的，其偶聯(lián)在抗體上，能通過反應(yīng)底 物過氧化物(如過氧化氨)和顯色劑發(fā)生化學反應(yīng)。目前該顯色劑系統(tǒng)中有多種，但最常見 的是3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
[0003] TMB是一種新型安全的過氧化物酶底物，其含有脂溶性較強的基團，易形成多聚 體，和HRP活性部位反應(yīng)，可產(chǎn)生一種可溶性的藍色產(chǎn)物，目視對比明顯。TMB性質(zhì)穩(wěn)定，在過 氧化物做底物時和HRP反應(yīng)后，應(yīng)用HC1或者也S〇4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，在比色計 中可定量，最佳吸收波長為450nm，通過測定吸光值，我們可W定量地判斷免疫反應(yīng)強度。
[0004] 目前國內(nèi)市場上的化ISA試劑盒還多采用雙組份TMB顯色液底物，分為A液和B液，A 液中主要成為ΤΜΒ,Β液組要成為是過氧化物，使用前需將A液和B液等體積混勻。還有部分 TMB顯色液由多種組分組成，要現(xiàn)配現(xiàn)用才可。運些使用過程中有許多明顯的缺點：操作比 較繁瑣，使用不方便;每次配制都會有差異發(fā)生，從而導致批次差異大，影響準確的結(jié)果；因 為多種成分分開存在，在包裝運輸?shù)确矫娑紩黾映杀镜取Ｄ壳笆袌錾嫌行S家生產(chǎn)的單 組份TMB顯色液，因 TMB顯色液如果沒有穩(wěn)定劑等存在，長時間保存會導致穩(wěn)定性不高，保存 時間較短，靈敏度低，顯色背景高，而且進口的TMB顯色液價格貴等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種單一組分的，且高效 穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液(TMB顯色液)及其制備方法，能夠顯著提高TMB顯色液的長期 保存時間。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其包括W下各組分：
[000引聚乙締醇的質(zhì)量分數(shù)為0.!%-0.4%;核糖的濃度為lO-lOOmM;巧樣酸的質(zhì)量分數(shù) 為0.1 -0.5 % ;乙二酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.2-0.6 % ;高棚酸鋼的質(zhì)量分數(shù)為0.0Ι? ο. 05 %; TMB 的質(zhì)量分數(shù)為 0.01-0.05 %。
[0009] 進一步地，包括W下各組分：
[0010] 聚乙締醇的質(zhì)量分數(shù)為0.1%;核糖的濃度為lOmM;巧樣酸的質(zhì)量分數(shù)為0.1%;乙 二酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.2% ;高棚酸鋼的質(zhì)量分數(shù)為0.01% ;TMB的質(zhì)量分數(shù)為0.01%。
[0011] 進一步地，包括W下各組分：
[0012] 聚乙締醇的質(zhì)量分數(shù)為0.4% ;核糖的濃度為lOOmM;巧樣酸的質(zhì)量分數(shù)為0.5% ; 乙二酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.6 % ;高棚酸鋼的質(zhì)量分數(shù)為0.0 5 % ; T Μ B的質(zhì)量分數(shù)為 0.05%。
[0013] 進一步地，包括W下各組分：
[0014] 聚乙締醇的質(zhì)量分數(shù)為0.25% ;核糖的濃度為75mM;巧樣酸的質(zhì)量分數(shù)為0.21 % ; 乙二酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.42% ;高棚酸鋼的質(zhì)量分數(shù)為0.03% ; TMB的質(zhì)量分數(shù)為 0.025%。
[0015] 本發(fā)明的另一個方面公開了一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的制備方法， 具體包括W下步驟：
[0016] (1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 0. lg-0.5g的TMB，在磁力攬拌器上攬拌均勻使其充分溶解；
[0017] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入l-4g的聚乙締醇，加入核糖 lO-lOOmM，加入巧樣酸l-5g;加入乙二酸四乙酸2-6g，加入高棚酸鋼0.1-0.5g，攬拌使其充 分溶解。
[001引（3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分攬拌均勻，定 容至1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C環(huán)境下。
[0019] 本發(fā)明的另一個方面公開了一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的使用方法， 具體包括W下步驟：
[0020] (1)待ELISA實驗加入皿P結(jié)合物后，且溫育一段時間，清洗3次ELISA板之后，每孔 加入lOOul上述TMB顯色液；
[0021] (2)根據(jù)反應(yīng)體系避光解育5-30分鐘；
[0022] (3)每孔加入50ul反應(yīng)終止液(2M出S〇4或1N肥1)終止
[0023] (4)在波長450nm測定吸光度。
[0024] 聚乙締醇外觀為白色粉末，是一種廣泛應(yīng)用的水溶性高分子聚合物，具有極高的 安全性的有機物，對人體無毒，無副作用。在本發(fā)明中加入了聚乙締醇，能提高TMB的溶解度 和增強穩(wěn)定性。核糖是一種五碳醒糖，一般常見的型態(tài)為D-核糖，加入核糖能夠和聚乙締醇 協(xié)同增強TMB顯色液的穩(wěn)定性。巧樣酸能夠為TMB顯色液提供一個酸性環(huán)境，使其抑值維持 在4.0-6.0之間。邸TA具有馨合的作用，使得TMB顯色液更加穩(wěn)定。本發(fā)明中所使用的過氧化 物底物為高棚酸鋼，比過氧化氨更穩(wěn)定，更好的氧化性，該物質(zhì)的底物的酶是辣根過氧化物 酶化RP)"TMB外觀是白色結(jié)晶粉末，難溶于水，因此需要N-甲基化咯燒酬、二甲基亞諷、二甲 基甲酯胺等有機溶劑溶解。
[0025] 本發(fā)明所達到的有益效果是：
[0026] 本發(fā)明是一種單組份TMB顯色液，使用時無需再單獨配制，操作更加方便，可W避 免人為操作帶來的誤差，更客觀地反應(yīng)真實的數(shù)據(jù)。因該發(fā)明中加入高分子聚合物(PVA)和 一種單糖分子(核糖），只有兩者同時存在時，才能保證本發(fā)明的TMB顯色液能夠長時間的保 存，而不影響其靈敏度，能夠增加 TMB的溶解性和穩(wěn)定性，保證了 TMB長時間的保存，保持單 相溶液的存在。
【附圖說明】
[0027] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：
[0028] 圖1是本發(fā)明實施例1與對照顯色液穩(wěn)定性實驗的曲線圖。
【具體實施方式】
[0029] W下結(jié)合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當理解，此處所描述的優(yōu)選實 施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0030] 實施例1
[0031 ] (1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 0.25g的TMB，攬拌均勻使其充分溶解。
[0032] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入2.5g的聚乙締醇，加入核糖 7.5g，加入巧樣酸2. Ig;加入乙二酸四乙酸4.2g，加入高棚酸鋼0.3g，攬拌使其充分溶解。
[0033] (3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分攬拌均勻，定 容至1000ml。經(jīng)0.45um的濾膜過濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C。
[0034] 實施例2
[003引（1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 O.lg的TMB，在磁力攬拌器上攬拌均勻使其充分溶解；
[0036] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入Ig的聚乙締醇，加入核糖 0.0 lmol，加入巧樣酸Ig;加入乙二酸四乙酸2g，加入高棚酸鋼0.1 g，攬拌使其充分溶解。
[0037] (3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分攬拌均勻，定 容至1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C環(huán)境下。
[003引實施例3
[0039] (1)制備含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液:取20ml N-甲基化咯燒酬為溶劑，緩慢加入 0.5g的TMB，在磁力攬拌器上攬拌均勻使其充分溶解；
[0040] (2)在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入4g的聚乙締醇，加入核糖 0.1mol，加入巧樣酸5g;加入乙二酸四乙酸6g，加入高棚酸鋼0.5g，攬拌使其充分溶解。
[0041 ] (3)將含TMB的N-甲基化咯燒酬溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分攬拌均勻，定 容至1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過濾，獲得均一的溶液，保存在棟色的塑料瓶中，密封避光保 存在2-8°C環(huán)境下。
[0042]( - )使用實施例1~3的制備方法獲得的TMB顯色液與現(xiàn)有技術(shù)中某公司商品化的 TMB顯色液經(jīng)行比較(簡稱:對照顯色液），WPD-1化uman化LISA Kit為例經(jīng)行測試。顯色時 間為20分鐘，在吸光值為450nm處測得0D值如下表：
[0043]
[0044] 從表1中可W得出：實施案例1~3中的TMB顯色液要比對照顯色液靈敏度要高的 多;此外實施案例1~3中的顯色液在PD-Uhuman)濃度為l.OOng/ul時的信噪比是0.28414/ 0.05958 = 4.77左右，而對照顯色液在PD- U human)濃度為1. OOng/u 1時的信噪比是 0.25519/0.06489 = 3.93，實施案例1~3中的TMB顯色液顯著優(yōu)于對照TMB顯色液。
[0045] (二)穩(wěn)定性試驗:分別將使用實施案例1制備的TMB顯色液和現(xiàn)有技術(shù)中某公司商 品化的TMB顯色液(簡稱:對照顯色液)避光放置37°C溫箱中，分別在1、5、10、15、20天后取出 觀察物理變化，并WPD-UHumar〇ELISA Kit為例，測試PD-Uhuman)抗原的標準品（濃度為 4ng/ml)，經(jīng)行靈敏度檢測。對比結(jié)果如圖1所示。
[0046] 由圖1可知，相對于市場上商品化的某公司TMB顯色液，本發(fā)明單組份TMB顯色液更 加穩(wěn)定，在溫度加速試驗可W看出，本發(fā)明的TMB顯色液可W長期穩(wěn)定存在，且不影響其靈 敏度。
[0047] 最后應(yīng)說明的是：W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 W對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為0.1 %-〇 . 4% ;核糖的濃度為10-100mM;檸檬酸的質(zhì)量分數(shù)為 0.1-0.5% ;乙二酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.2-0.6% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.01-0.05% ; TMB的質(zhì)量分數(shù)為0.01-0.05%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各 組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為0.1 % ;核糖的濃度為10mM;檸檬酸的質(zhì)量分數(shù)為0.1 % ;乙二酸 四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.2% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.01 % ;TMB的質(zhì)量分數(shù)為0.01 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各 組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為0.4 % ;核糖的濃度為100mM;檸檬酸的質(zhì)量分數(shù)為0.5 % ;乙二 酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.6% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.05% ;TMB的質(zhì)量分數(shù)為0.05%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液，其特征在于，包括以下各 組分： 聚乙烯醇的質(zhì)量分數(shù)為0.25% ;核糖的濃度為75mM;檸檬酸的質(zhì)量分數(shù)為0.21 % ;乙二 酸四乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0.42% ;高硼酸鈉的質(zhì)量分數(shù)為0.03% ;TMB的質(zhì)量分數(shù)為0.025%。5. -種權(quán)利要求1~4任一所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的制備方法，具體 包括以下步驟： (1) 制備含TMB的N-甲基吡咯烷酮溶液：取2 0 m 1 N-甲基吡咯烷酮為溶劑，緩慢加入 0. lg-0.5g的TMB，在磁力攪拌器上攪拌均勻使其充分溶解； (2) 在1000ml的燒杯中，加入800ml雙蒸水，緩慢加入l-4g的聚乙烯醇，加入核糖10-100mM，加入檸檬酸l-5g;加入乙二酸四乙酸2-6g，加入高硼酸鈉0.1-0.5g，攪拌使其充分溶 解。 (3) 將含TMB的N-甲基吡咯烷酮溶液加入到上述1000ml燒杯中，充分攪拌均勻，定容至 1000ml;經(jīng)0.45um的濾膜過濾，獲得均一的溶液，保存在棕色的塑料瓶中，密封避光保存在 2-8 °C環(huán)境下。6. -種權(quán)利要求1~4任一所述的高效穩(wěn)定的單組份酶聯(lián)免疫顯色液的使用方法，具體 包括以下步驟： (1) 待ELISA實驗加入HRP結(jié)合物后，且溫育一段時間，清洗3次ELISA板之后，每孔加入 100ul上述TMB顯色液； (2) 根據(jù)反應(yīng)體系避光孵育5-30分鐘； (3) 每孔加入50u 1反應(yīng)終止液終止 (4) 在波長450nm測定吸光度。
【文檔編號】G01N33/535GK105823871SQ201610239243
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】楊勇, 劉永雙
【申請人】蘇州新賽美生物科技有限公司