一種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法及其應用，先在金納米顆粒上修飾mPEG?SH；然后高溫干燥介導mPEG?SH修飾的金納米顆粒在96孔板基底組裝；接著在組裝了金納米顆粒的基底上沉積金原子，形成均一的金基底；該方法可以用于ELISA檢測反應，具有簡單、快捷和試劑用量少的優(yōu)點，能夠有效避免檢測過程中的非特異性吸附，為環(huán)境監(jiān)測和疾病診斷提供新的平臺。
【專利說明】
一種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于分析檢測技術領域，具體涉及一種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法，及其在ELISA檢測技術上的應用。
【背景技術】
[0002]酶聯(lián)免疫吸附測定(EnzymeLinked Immunosorbent Assay，ELISA)是一種基于抗原抗體特異性相互作用的檢測反應。利用ELISA檢測靶標主要是通過雙抗體夾心的方法進行，即首先在基底上固定捕獲抗體，然后利用抗原抗體的特異性相互作用，在捕獲抗體上依次固定抗原和檢測抗體，最后通過檢測抗體上標記的酶分子催化底物顯色、發(fā)光或產氣測定靶標濃度。另外還有雙抗原夾心法等。目前，ELISA已經(jīng)被廣泛的應用于蛋白質、小分子、細胞、細菌等靶標的檢測，在環(huán)境監(jiān)測、食品安全和疾病診斷等領域占有重要地位。利用ELISA方法進行檢測有特異性好、穩(wěn)定和靈敏度高的優(yōu)點，然而，在ELISA檢測靶標時，需要在4°C孵育12h來完成基底上捕獲抗體的包被過程，因此十分耗時；并且，由于抗體與ELISA檢測常用的96孔板基底親和力弱，包被抗體時試劑消耗量大。與96孔板基底不同，金基底與抗體親和力強、結合速度快，利用金基底進行ELISA檢測能夠有效降低試劑的用量和縮短抗體包被所用的時間。然而，目前制備金基底的方法多是基于電鍍或真空蒸鍍的方法，該方法需要用到大型儀器，成本高且試劑消耗量大。
[0003]因此，發(fā)展簡單、快速、試劑消耗小且無需大型儀器的方法制備金基底，對于縮短ELISA包被抗體所用時間、降低試劑用量具有重大意義。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供了一種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法及其應用，具有簡單、快捷、廉價的優(yōu)點，也解決了現(xiàn)有ELISA技術中包被捕獲抗體耗時長、試劑用量大等不足。
[0005]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案之一是:
[0006]—種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法，包括:
[0007]I)將粒徑5?30nm的金納米顆粒用濃度為0.2?5μΜ、分子量為0.75?20kDa的mPEG-SH(甲氧基巰基修飾的聚乙二醇)修飾，得到mPEG-SH修飾的金納米顆粒；
[0008]2)在65?95°C下干燥，以介導濃度為I?25nM的上述mPEG-SH修飾的金納米顆粒在酶標板的聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或纖維素等高分子材料制成的基底上自組裝形成均勾的金納米顆粒層;mPEG-SH在修飾過程中能夠與金納米顆粒完全、充分地結合，并能夠在自組裝過程中促進金納米顆粒均勻分布;在65?95°C下干燥能夠在迅速除去水分的同時促進溶液流動，從而在加快速度的同時進一步保障形成均勻的金納米顆粒層；
[0009]3)利用還原劑還原濃度不低于0.31mM的氯金酸的方法在步驟2)得到的均勻的金納米顆粒層上沉積金原子，從而在酶標板內形成均一的金基底。所述還原劑可以是鹽酸羥胺、抗壞血酸、對苯二酚或檸檬酸鈉等，優(yōu)選鹽酸羥胺。通過還原劑與氯金酸的量可以調控生成的金基底的厚度。
[00?0] —實施例中:所述步驟I)中，金納米顆粒的粒徑為13?20nm。
[0011]一實施例中:所述步驟I)中，mPEG-SH的分子量為5kDa。
[0012]一實施例中:所述步驟I)中，mPEG-SH的終濃度為0.5?ΙμΜ。
[0013]一實施例中:所述步驟2)中，溫度為75?85°C
[0014]一實施例中:所述步驟2)中，mPEG-SH修飾的金納米顆粒濃度為2.5?ΙΟηΜ。
[0015]—實施例中:所述步驟3)中，所述還原劑為鹽酸羥胺，鹽酸羥胺的反應濃度為2?5 OmM ο
[0016]—實施例中:所述鹽酸羥胺的反應濃度為5?20mM。
[0017]一實施例中:所述步驟3)中，所述氯金酸的濃度為10?20mM。
[0018]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案之二是:
[0019]上述方法在ELISA檢測技術中的應用，所述ELISA檢測的靶標可以是細胞、蛋白質和小分子等，可以用于直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、競爭法等。
[0020]本技術方案與【背景技術】相比，它具有如下優(yōu)點:
[0021 ]首先，通過干燥介導自組裝的方法使mPEG-SH修飾的金納米顆粒吸附于96孔板基底，此法吸附金納米顆粒均一性好;其次，利用鹽酸羥胺還原氯金酸在基底上沉積金原子，簡單、廉價、試劑消耗小且形成金基底的厚度可控;再次，利用金基底與抗體的強吸附作用，進行ELISA檢測包被捕獲抗體時能夠減少試劑用量、縮短包被所用的時間；最后，此方法制備的金基底適用于蛋白質、小分子、細胞和細菌等多種靶標的ELISA檢測。基于此方法擁有簡單、快捷、廉價和試劑消耗量少的優(yōu)點，將進一步促進ELISA檢測方法的發(fā)展。
【附圖說明】
[0022]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0023]圖1為本發(fā)明干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底用于ELISA檢測的原理圖。
[0024]圖2為實施例1中不同濃度不同分子量mPEG-SH修飾金納米顆粒在96孔板基底組裝制備金基底的(A)實物照片和(B)在405nm的吸收。
[0025]圖3為實施例1中不同濃度氯金酸制備金基底的(A)實物照片和(B)基底在405nm的吸收。
[0026]圖4為實施例1中干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的掃描電鏡圖。
[0027]圖5為實施例2中l(wèi)yg/mL(A)HRP和(B)SA-HRP在金基底和96孔板基底上吸附的動力學過程。
[0028]圖6為實施例2中不同濃度(A)HRP和(B)SA-HRP在金基底和96孔板基底上孵育Ih能夠吸附的量。
[0029]圖7為實施例3中利用(A)金基底和(B)96孔板進行ELISA檢測不同濃度H5N1的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0030]下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內容:
[0031 ]實施例1:干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底
[0032]I)合成16nm金納米顆粒(AuNPs):在圓底燒瓶中加入10mL 0.01wt%氯金酸，在連續(xù)攪拌下煮沸回流，勾速加入ImL 3wt%梓檬酸鈉，繼續(xù)攪拌煮沸30min，合成粒徑為16nm的AuNPs。根據(jù)紫外可見吸收表征此方法合成金納米顆粒的濃度為2.5nM。
[0033]2)在96孔酶標板中加入10yL上述2.5nM 16nm AuNPs和5yL不同濃度不同分子量的mPEG-SH，混合均勻，得到mPEG-SH修飾的金納米顆粒；
[0034]3)在800C下干燥，以介導步驟2)得到的mPEG-SH修飾的金納米顆粒在96孔酶標板的基底上自組裝形成均勻的金納米顆粒層；
[0035]4)然后加入50yL不同濃度氯金酸和50yL 20mM鹽酸羥胺，25°C反應30min，利用鹽酸羥胺還原氯金酸的方法在步驟3)得到的均勻的金納米顆粒層上沉積金原子，從而在96孔酶標板內形成均一的金基底。用超純水洗滌3次，利用酶標儀測定不同樣品在405nm的吸收以對比不同條件下的效果;利用掃描電鏡表征金基底的形貌，結果如圖4所示。
[0036]酶標儀測定結果如圖2和圖3所示，mPEG-SH的分子量以5kDa為佳，濃度以0.5?ΙμΜ為佳;氯金酸的濃度以I OmM為佳。
[0037]實施例2:金基底吸附蛋白的動力學過程表征
[0038]在實施例1得到的具有金基底的96孔酶標板內加入10yL不同濃度HRP(過氧化物酶)或SA-HRP(鏈霉親和素/過氧化物酶)，室溫孵育不同時間，然后用PBS洗滌3次。再加入10yL商品化的TMB底物，室溫反應20min，加入50yL 2M H2SO4終止反應，利用酶標儀測定不同樣品在450nm的吸收。對照組采用常規(guī)的96孔酶標板，操作同上。
[0039]結果如圖5和圖6所示，金基底吸附蛋白的速度和吸附量遠遠大于常規(guī)96孔酶標板，利用金基底進行ELISA檢測能夠有效降低試劑的用量和縮短抗體包被所用的時間。
[0040]實施例3:本發(fā)明在ELISA檢測技術中的應用[0041 ]利用本發(fā)明的方法檢測H5N1:
[0042]在實施例1得到的具有金基底的96孔酶標板內加入10yL 2yg/mL捕獲抗體，4°C孵育 30min，300yL Wash Buffer (含有0.Iwt % Tween 20PBS 溶液)洗滌三遍。隨后，加入300yL2wt %BSA/PBS溶液，37°C孵育Ih，300yL Wash Buf f er洗滌三遍。加入10yL待測樣品，25°C孵育lh，300yL Wash Buffer洗滌三遍。然后加入10yL 0.5yg/mL生物素標記的檢測抗體，25°C孵育lh，300yL Wash Buffer洗滌兩遍。然后加入10yL 1: 200稀釋的商品化SA_HRP，25°C孵育Ih，300yL Wash Buffer洗滌兩遍。加入10yL商品化的TMB底物，室溫反應20min，加A50yL 2M H2SO4終止反應，利用酶標儀測定不同樣品在450nm的吸收。對照組采用常規(guī)的96孔酶標板，操作同上。
[0043]結果如圖7所示，采用本發(fā)明組裝金基底后的酶標板進行檢測，與常規(guī)的96孔酶標板檢測相比，二者線性良好，結果無顯著性差異。
[0044]以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。
【主權項】
1.一種干燥介導金納米顆粒自組裝制備金基底的方法，其特征在于:包括: 1)將粒徑5?30nm的金納米顆粒用濃度為0.2?5μΜ、分子量為0.75?20kDa的mPEG-SH修飾，得到mPEG-SH修飾的金納米顆粒； 2)在65?950C下干燥，以介導濃度為I?25nM的上述mPEG-SH修飾的金納米顆粒在酶標板基底上自組裝形成均勻的金納米顆粒層； 3)利用還原劑還原濃度不低于0.31mM的氯金酸的方法在步驟2)得到的均勻的金納米顆粒層上沉積金原子，從而在酶標板內形成均一的金基底。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，金納米顆粒的粒徑為13?20nmo3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，mPEG-SH的分子量為5kDa。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，mPEG-SH的終濃度為0.5?IμΜο5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中，溫度為75?85°C。6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中，mPEG-SH修飾的金納米顆粒濃度為2.5?ΙΟηΜ。7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述還原劑為鹽酸羥胺，鹽酸羥胺的反應濃度為2?50mM。8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:所述鹽酸羥胺的反應濃度為5?20mM。9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述氯金酸的濃度為10?2OmM ο10.根據(jù)權利要求1至9中任一項所述的方法在ELISA檢測技術中的應用。
【文檔編號】G01N33/544GK105925963SQ201610347942
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】楊朝勇, 李久興, 劉芳, 何夢逸, 朱志
【申請人】廈門大學