L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]色氨酸又名α-氨基-β-吲哚丙酸，它有D-型和L-型兩種異構(gòu)體，天然存在的只有L-色氨酸。L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸，學(xué)名吲哚基丙氨酸；英文名Tryptophan，分子式C11H12N2O2,相對(duì)分子量204.21，熔點(diǎn)289°C。L-色氨酸為白色或微黃色結(jié)晶或結(jié)晶性粉體，無(wú)臭味微苦。在水中微溶，在乙醇中極微溶解。它廣泛存在于天然蛋白質(zhì)中。L-色氨酸對(duì)人體和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起著重要作用，被廣泛用于醫(yī)藥和食品、飼料等領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著色氨酸在醫(yī)藥、食品和飼料等方面的應(yīng)用，其市場(chǎng)需求量在不斷增加。
[0003]L-色氨酸的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)水解法、酶促轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。由于化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解法需要大量的有機(jī)溶劑，存在原料來(lái)源和環(huán)境污染等問(wèn)題，在生產(chǎn)中極少使用。酶促轉(zhuǎn)化法成本較高，污染量大。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸具有產(chǎn)率高、周期短、控制容易等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)酵法大體可以分為直接發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化法和酶法。近年來(lái)還出現(xiàn)直接發(fā)酵法與轉(zhuǎn)化法相結(jié)合生產(chǎn)色氨酸的相關(guān)報(bào)道。另外，重組DNA技術(shù)在微生物育種和工業(yè)上的應(yīng)用極大地推動(dòng)了直接發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)色氨酸的工業(yè)化進(jìn)程。
[0004]隨著L-色氨酸市場(chǎng)需求激增，越來(lái)越多的研究者和科研機(jī)構(gòu)開(kāi)始對(duì)L-色氨酸發(fā)酵進(jìn)行全面的研究。然而，隨著糧食價(jià)格的普遍上漲和國(guó)家對(duì)用糧食作物用于規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行調(diào)控，使之成為影響L-色氨酸發(fā)酵的主要因素，因此尋求糧食替代品，從而降低生產(chǎn)成本成為新的研究目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種以木薯為原料發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法，是以保藏編號(hào)為CICC 10303的大腸桿菌基因工程菌(Escherichia coli)作為發(fā)酵菌株，通過(guò)補(bǔ)料批式發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源以及補(bǔ)料時(shí)流加的糖液是以木薯為原料制備的葡萄糖液。
[0007]前述的方法，以木薯為原料制備葡萄糖液包括以下步驟:
[0008]I)將木薯進(jìn)行篩選后(去除發(fā)霉變色的原料)，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)20-40目(優(yōu)選30目)篩去除大顆粒后，加水溶解成乳漿；其中，木薯與水的重量比為1:2-2.5(優(yōu)選 1:2.3)；
[0009]2)向乳漿中加入高溫淀粉酶，在65-72°C保溫20-40min (優(yōu)選保溫30min)，再糊化升溫至95-98°(:保溫4-81^11(優(yōu)選保溫51^11)，得木薯液化液；其中，每升乳漿中添加高溫淀粉酶的量為0.2ml，其中淀粉酶的酶活為94731U/ml ;
[0010]3)用板框壓濾機(jī)壓濾木薯液化液，所得濾液即為葡萄糖液；其中，壓濾溫度為75-85°C，壓濾機(jī)壓力為 0.15-0.3MPa。
[0011]具體地，本發(fā)明提供的L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法包括以下步驟:
[0012]i)種子液的制備:按0.1 % -0.2% (v/v)的接種量將OD6qq為0.7-1.0 (優(yōu)選OD 600=0.8)的菌液接種到種子罐培養(yǎng)基中，在30-33°C、0.03-0.1MPa、通風(fēng)比1:0.2-0.4v/V.min、轉(zhuǎn)速 250-300rpm、ρΗ6.8-7.2 的條件下培養(yǎng) 14_18h，得 OD600為 0.7-1.0 (優(yōu)選 OD 600=0.8)的種子液；
[0013]ii)按10% -15% (v/v)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30_33°C、0.03-0.1MPa、通風(fēng)比 1: 0.2-0.8v/v.min、轉(zhuǎn)速 250_350rpm、ρΗ6.8-7.2 的條件下發(fā)酵38-40h，并以流加方式添加制備的葡萄糖液，使葡萄糖液的濃度始終保持在3.5% -4.5%。
[0014]其中，種子罐培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖5%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，水94.1%, pH6.8-7.2，使用前經(jīng)121°C蒸氣滅菌25min ;發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖15%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，葡萄糖液3.5% -4.5%，余量為水，pH6.8-7.2，使用前經(jīng)115°C蒸氣滅菌20min。
[0015]前述的方法，步驟i)和ii)中通入的空氣為經(jīng)過(guò)0.25-0.3MPa壓縮、過(guò)濾后的無(wú)菌空氣。無(wú)菌空氣壓縮、過(guò)濾所用設(shè)備為通用的空氣壓縮機(jī)和空氣凈化系統(tǒng)。
[0016]前述的方法，步驟ii)中流加的葡萄糖液經(jīng)過(guò)115°C蒸氣滅菌20min后加入。
[0017]本發(fā)明中涉及的保藏編號(hào)為CICC 10303的大腸桿菌基因工程菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0018]本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“ ，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指10mL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
[0019]本發(fā)明利用保藏編號(hào)為CICC 10303的大腸桿菌基因工程菌作為發(fā)酵菌株，以木薯為原料制得的葡萄糖液作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源以及補(bǔ)料時(shí)流加的糖液，在一定條件下進(jìn)行補(bǔ)料批式發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。本發(fā)明通過(guò)控制培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件，使色氨酸產(chǎn)量達(dá)到了 40g/L，利用木薯制備葡萄糖液，大大降低了生產(chǎn)成本，通過(guò)連續(xù)流加葡萄糖液，使培養(yǎng)基中葡萄糖含量基本保持恒定，從而提高發(fā)酵產(chǎn)酸水平和糖酸轉(zhuǎn)化率，適合于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0021]以下實(shí)施例中使用的種子罐培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖5%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1%，水94.7%，PH6.8-7.2，使用前經(jīng)121°C蒸氣滅菌25min。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖15%，磷酸氫二鉀0.2%，硫酸鎂0.1 %，葡萄糖液3.5% -4.5%，余量為水，pH6.8-7.2，使用前經(jīng)115°C蒸氣滅菌20min。
[0022]實(shí)施例1 L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
[0023]1、以木薯為原料制備葡萄糖液
[0024](I)將木薯進(jìn)行篩選后(去除發(fā)霉變色的原料)，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)30目篩去除大顆粒后，加水溶解成乳漿；其中，木薯與水的重量比為1:2.3。
[0025](2)向乳漿中加入高溫淀粉酶，在70°C保溫30min，再糊化升溫至97°C保溫5min，得木薯液化液，30min碘試合格；其中，每升乳漿中添加高溫淀粉酶的量為0.2ml，其中淀粉酶的酶活為94731U/ml。
[0026](3)用板框壓濾機(jī)壓濾木薯液化液，所得濾液即為葡萄糖液；其中，壓濾溫度為80°C，壓濾機(jī)壓力為0.25MPa，得濃度為330g/L純葡萄糖液，葡萄糖液經(jīng)脫水濃縮用于下一步發(fā)酵生產(chǎn)中的流加糖。
[0027]2、制備保藏編號(hào)為CICC 10303的大腸桿菌基因工程菌種子液
[0028]①在初級(jí)菌種培養(yǎng)基中接入大腸桿菌基因工程菌菌種，32 °C靜置培養(yǎng)24h后獲得OD600= 0.8的初級(jí)菌種。
[0029]②按0.15% (v/v)的接種量將初級(jí)菌種接種到種子罐培養(yǎng)基中，在33 °C、0.05MPa、通風(fēng)比1:0.3v/v.min、轉(zhuǎn)速250rpm、pH6.9的條件下，在往復(fù)式搖床上培養(yǎng)16h即得種子液。經(jīng)鏡檢，菌體均勻，粗壯，無(wú)污染，用752分光光度計(jì)測(cè)量(量程:10mm，波長(zhǎng):600mm)的 OD 值為 0.8。
[0030]3、補(bǔ)料批式發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸
[0031]按15% (v/v)的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在33°C、0.05MPa、通風(fēng)比1:0.3v/v.min、轉(zhuǎn)速250rpm、pH6.9的條件下發(fā)酵39h，并以流加方式添加制備的葡萄糖液(600g/L)，使葡萄糖液的濃度始終保持在3.5% -4.5%。發(fā)酵后期停止流加，待葡萄糖液濃度穩(wěn)步降到0-0.5g/L，發(fā)酵停止。L-色氨酸產(chǎn)量達(dá)到38.6g/L，轉(zhuǎn)化率為18.2%。
[0032]實(shí)施例2 L-色氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法
[0033]1、以木薯為原料制備葡萄糖液
[0034](I)將木薯進(jìn)行篩選后(去除發(fā)霉變色的原料)，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過(guò)20目篩去除大顆粒后，加水溶解成乳漿；其中，木薯與水的重量比為1:2。
[0035](2)向乳漿中加入高溫淀粉酶，在65°C保溫20min，再糊化升溫至95°C保溫4min，得木薯液化液，30min碘試合格；其中，每升乳漿中添加高溫淀粉酶的量為0.2ml，其中淀粉酶的酶活為94731U/ml。
[0036](3)用板框壓濾機(jī)壓濾木薯液化液，所得濾液即為葡萄糖液；其中，壓濾溫度為75°C，壓濾機(jī)壓力為0.15