一種端粒長度測量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料制備及生物分子檢測技術(shù)，尤其涉及一種單細(xì)胞內(nèi)高靈敏度的端粒長度測量方法，借助表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的高靈敏度以及光譜信息豐富的特點，通過原位雜交技術(shù)實現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)的端粒長度測量，該方法也可稱為原位雜交表面增強(qiáng)拉曼散射法。
【背景技術(shù)】
[0002]端粒是位于真核細(xì)胞線性染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，其作用是保護(hù)染色體DNA的末端，避免染色體DNA的降解、末端融合以及非正常重組等。在哺乳動物細(xì)胞中，端粒DNA由TTAGGG序列重復(fù)串聯(lián)組成。由于DNA的末端復(fù)制問題，細(xì)胞的每次分裂都伴隨著端粒DNA —小段序列的丟失。細(xì)胞的每次分裂都會伴隨著染色體末端端粒的縮短，細(xì)胞也因此逐漸老化、直至喪失增殖能力而死亡。端粒長度的變化與多種疾病密切相關(guān)，如癌癥、早衰綜合征等。因此測量端粒長度能提供與疾病相關(guān)的重要信息。
[0003]目前已有的端粒長度測量方法包括=Southern印跡法、雜交保護(hù)法(HPA)、實時熒光定量PCR法(qPCR)和熒光原位雜交(FISH)法。用Southern印跡法分析的DNA是沒有被打碎和純度較高的，但該方法得到的數(shù)據(jù)還包括了部分亞端粒區(qū)長度，因此Southern印跡法不能提供端粒的實際長度。HPA法中，直接將基因組DNA與端粒特異性的吖啶酯探針雜交，通過化學(xué)發(fā)光法測定端粒長度。該方法中不需要用到放射性同位素，大大降低了對實驗操作人員的傷害，同時對基因組完整性和純度沒有苛刻要求。但HPA法沒有給出詳細(xì)的細(xì)胞或染色體水平的端粒信息，也不能直接測定端粒長度。PCR法使用PCR擴(kuò)增的方式，有效降低了細(xì)胞基因組DNA的用量。FISH法利用端粒特異性肽核酸熒光探針，結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)，能實現(xiàn)單細(xì)胞水平的端粒長度分析。盡管這些方法在端粒研究中做出了重要的貢獻(xiàn)，但它們或多或少具有一些不足，比如靈敏度低、程序復(fù)雜、成本高等，因此，目前仍需設(shè)計出靈敏度高、準(zhǔn)確性好、適用性廣泛、可操作性強(qiáng)的端粒長度測量技術(shù)。
[0004]在生物研究中，除傳統(tǒng)生物學(xué)檢測方法外，光學(xué)檢測技術(shù)以其簡單、可靠的特點獲得了較為廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有的光學(xué)測試方法以熒光技術(shù)為主流獲得了較為廣泛的應(yīng)用。作為另一種光譜技術(shù)，拉曼光譜攜帶有被測分子的結(jié)構(gòu)“指紋”信息，因而具有更重要的生物學(xué)應(yīng)用價值。但由于其光譜信號強(qiáng)度太弱，限制了它的應(yīng)用。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)徹底解決了這個問題，從而使得它成為一種強(qiáng)有力的技術(shù)分析手段。SERS —方面繼承了拉曼光譜的諸多優(yōu)點，如對生物組織損傷小、光譜信息豐富等；另一方面，它彌補(bǔ)了傳統(tǒng)拉曼散射信號強(qiáng)度弱、不利于檢測的缺點。其巨大的增強(qiáng)作用使得基于SERS的光譜檢測具有超高的靈敏度，甚至可實現(xiàn)單分子水平的分析研究。SERS光譜的“指紋”特性使人們能在復(fù)雜的生物環(huán)境中跟蹤、檢測目標(biāo)分子。SERS效應(yīng)產(chǎn)生在納米尺度粗糙的金屬表面，納米技術(shù)的飛速發(fā)展為構(gòu)筑多功能化的SERS納米探針/基底提供了豐富的技術(shù)途徑。這些基于SERS光譜技術(shù)的納米探針/基底在生物成像、核酸或蛋白檢測、腫瘤識別、藥物輸運(yùn)等諸多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出了優(yōu)異的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:為解決目前端粒長度測量方法靈敏度不高、操作復(fù)雜、成本高的問題，，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞端粒長度測量的原位雜交SERS法，借助SERS的高靈敏度以及光譜信息豐富的特點，通過原位雜交技術(shù)實現(xiàn)單細(xì)胞內(nèi)的端粒長度測量。
[0006]技術(shù)方案:為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種端粒長度測量方法，使用端粒SERS探針粒子與著絲粒SERS探針粒子分別標(biāo)記待測細(xì)胞的端粒與著絲粒，并使用端粒SERS探針粒子與著絲粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度之比RT/e表征待測細(xì)胞的端粒長度，即使用長度保持不變的端粒序列作為內(nèi)部參照，消除SERS探針、染色體或細(xì)胞的濃度的影響；該方法具體為:將端粒SERS探針粒子和著絲粒SERS探針粒子加入到用固定劑固定好的待測細(xì)胞上，使端粒SERS探針粒子和著絲粒SERS探針粒子分別通過它們表面修飾的DNA序列雜交到待測細(xì)胞的端粒和著絲粒上，利用端粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度與著絲粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度之比RT/C表征待測細(xì)胞的端粒長度，RtA；越小表示待測細(xì)胞的端粒長度越短；所述端粒SERS探針粒子是一種能與細(xì)胞的端粒序列雜交的SERS探針粒子，所述著絲粒SERS探針粒子是一種能與細(xì)胞的著絲粒序列雜交的SERS探針粒子。
[0008]上述方法具體包括如下步驟:
[0009]步驟一:制備球形金納米粒子A ;
[0010]步驟二:在粒子A表面修飾與細(xì)胞的端粒互補(bǔ)的DNA序列5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’，得到能與細(xì)胞的端粒序列雜交的金納米粒子B1;在粒子A表面修飾與細(xì)胞的著絲?；パa(bǔ)的DNA序列5’ -SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’，得到能與細(xì)胞的著絲粒序列雜交的金納米粒子B2;
[0011]步驟三:在粒子B1表面的空位上修飾拉曼報告分子，得到能產(chǎn)生SERS信號且能與細(xì)胞的端粒序列雜交的金納米粒子C1;在粒子B 2表面的空位上修飾拉曼報告分子，得到能產(chǎn)生SERS信號且能與細(xì)胞的著絲粒序列雜交的金納米粒子C2;要求在粒子B:和粒子B 2表面修飾的拉曼報告分子不同，使得粒子C1和粒子C2產(chǎn)生的SERS信號不同；
[0012]步驟四:在粒子C1表面包覆一層銀殼形成端粒SERS探針粒子D1，銀殼將粒子D1上的拉曼報告分子和富T堿基的一段DNA序列(即SH(CH2) 6TTTTTTTTTTT)包埋在內(nèi)，而用于雜交的一段DNA序列(即CCCTAACCCTAACCCTAA)仍舊暴露在銀殼外；在粒子C2表面包覆一層銀殼形成著絲粒SERS探針粒子D2,銀殼將粒子隊上的拉曼報告分子和富T堿基的一段DNA序列(即SH(CH2)6ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ)包埋在內(nèi)，而用于雜交的一段DNA序列(即AGCTTCTGTCTAGTTT)仍舊暴露在銀殼外；銀殼的厚度為2?3nm(厚度不可超過3.4nm)，通過銀殼進(jìn)一步增強(qiáng)SERS信號，但同時又不影響DNA序列的雜交功能；
[0013]步驟五:用固定劑固定好待測的細(xì)胞；
[0014]步驟六:將粒子D1和粒子D 2同時加入到用固定劑固定好的待測細(xì)胞中，使粒子D I和粒子D2分別通過它們表面修飾的DNA序列雜交到待測細(xì)胞的端粒和著絲粒上；
[0015]步驟七:洗去待測細(xì)胞上多余的粒子D1和粒子D 2；
[0016]步驟八:利用共焦拉曼顯微鏡分析待測細(xì)胞上的SERS光譜信號，進(jìn)行SERS光譜和圖像的采集；
[0017]步驟九:利用端粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度與著絲粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度之比RT/e表征待測細(xì)胞的端粒長度，R τ/ε越小表示待測細(xì)胞的端粒長度越短。
[0018]所述步驟二中，DNA 序列 5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’ 和 DNA 序列 5’ -SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’ 的 5’ 端均修飾了巰基，以使得兩種 DNA序列能夠通過金硫鍵牢固地、共價地連接到粒子A的表面。
[0019]所述步驟三中，兩種拉曼報告分子均含巰基，以使得拉曼報告分子能夠通過金硫鍵牢固地、共價地連接到粒子A的表面；要求使用的兩種拉曼報告分子的拉曼散射截面較大，便于產(chǎn)生強(qiáng)SERS信號。
[0020]有益效果:本發(fā)明提供的端粒長度測量方法，相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)勢:1、本發(fā)明中的探針粒子能提供SERS信號，具有超高的靈敏度，可用于單細(xì)胞水平的分析研究；2、本發(fā)明中采用長度不變的著絲粒作為內(nèi)部參考，能有效避免探針、細(xì)胞、染色體濃度等因素的影響，提高端粒長度測量的準(zhǔn)確性；3、本發(fā)明采用SERS探針原位雜交實現(xiàn)端粒長度測量，具有實驗成本低、周期短、特異性好、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明提出的原位雜交SERS法測量端粒長度的示意圖；
[0022]圖2為本發(fā)明中使用的SERS探針的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0023]圖3為實施例1中端粒SERS探針的SERS光譜；
[0024]圖4為實施例1中著絲粒SERS探針的SERS光譜。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0026]如圖1所示為一種端粒長度測量方法，將端粒SERS探針粒子和著絲粒SERS探針粒子加入到用固定劑固定好的待測細(xì)胞上，使端粒SERS探針粒子和著絲粒SERS探針粒子分別通過它們表面修飾的DNA序列雜交到待測細(xì)胞的端粒和著絲粒上，利用端粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度與著絲粒SERS探針粒子的SERS信號強(qiáng)度之比RT/e表征待測細(xì)胞的端粒長度，RT/e越小表示待測細(xì)胞的端粒長度越短；如圖2所示，所述端粒SERS探針粒子是一種能與細(xì)胞的端粒序列雜交的SERS探針粒子，所述著絲粒SERS探針粒子是一種能與細(xì)胞的著絲粒序列雜交的SERS探針粒子。該方法包括如下步驟:
[0027]步驟一:制備球形金納米粒子A ;
[0028]步驟二:在粒子A表面修飾與細(xì)胞的端粒互補(bǔ)的DNA序列5’ -SH (CH2) 6TTTTTTTTTTCCCTAACCCTAACCCTAA-3’，得到能與細(xì)胞的端粒序列雜交的金納米粒子B1;在粒子A表面修飾與細(xì)胞的著絲?；パa(bǔ)的DNA序列5’ -SH(CH2)6TTTTTTTTTTTAGCTTCTGTCTAGTTT-3’，得到能與細(xì)胞的著絲粒序列雜交的金納米粒子B2;兩種DNA序列的5’端均修飾了巰基，以使得兩種DNA序列能夠通過金硫鍵牢固地、共價地連接到粒子A的表面；
[0029]步驟三:在粒子B1表面的空位上修飾拉曼報告分子，得到能產(chǎn)生SERS信號且能與細(xì)胞的端粒序列雜交的金納米粒子C1;在粒子B 2表面的空位上修飾拉曼報告分子，得到能產(chǎn)生SERS信號且能與細(xì)胞的著絲粒序列雜交的金納米粒子C2;要求在粒子B:和粒子B 2表面修飾的拉曼報告分子不同，使得粒子C1和粒子C2產(chǎn)生的SERS信號不同；兩種拉曼報告分子均含巰基，以使得拉曼報告分子能夠通過金硫鍵牢固地、共價地連接到粒子A的表面。
[0030]步驟四:在粒子C1表面包覆一層銀殼形成端粒SERS探針粒子D:，銀殼將粒子D1I的拉曼報告分子和富T堿基的一段DNA序列包埋在內(nèi)，而用于