專利名稱：一種主動脈疾病早期診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種主動脈疾病早期診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基膜聚糖(Lumican)是一種存在于主動脈中層的基質(zhì)蛋白，在急性主動脈損傷過程中釋放入血，其血清濃度的可作為早期判斷急性主動脈疾病(AD)的特異性指標(biāo)。急性主動脈疾病(AD)包括急性主動脈夾層(AAD)、主動脈壁間血腫(IMH)、胸腹主動脈瘤(TAA/AAA)等。其年發(fā)病率約25 30/百萬，且發(fā)病急、病情嚴(yán)重。據(jù)文獻(xiàn)報告，AAD 在急診室的漏診率可高達(dá)50%，而且有25%的AAD診斷是通過死后尸體解剖才明確的。AAD 導(dǎo)致患者死亡的原因除了與病情嚴(yán)重、血壓控制欠佳、病情發(fā)展等因素有關(guān)外，重要的一點是診斷的耽擱和延遲，導(dǎo)致臨床上危險因子出現(xiàn)機(jī)率增高。故對于臨床上胸背痛、高度懷疑 AD的患者，醫(yī)學(xué)界急需確立一套高度敏感、特異性好的臨床指標(biāo)進(jìn)行早期AD確診。近十余年來，由于超聲心動圖、磁共振成像、螺旋CT等敏感性和特異性俱高的影像技術(shù)的進(jìn)步，使醫(yī)生能更早確診和治療AD。但是，大多數(shù)這些影像檢查成本高、價格貴、檢查時間長且需搬動患者，故廣泛開展存在困難。生物化學(xué)診斷具有快速、經(jīng)濟(jì)和非侵入性的優(yōu)點。這些優(yōu)點使外周血生化指標(biāo)診斷AD非常具有吸引力。因此，尋找AD的早期外周血標(biāo)記物對于迅速確定AD的診斷，早期干預(yù)和治療，降低死亡率和并發(fā)癥均有重要的意義。已有文獻(xiàn)報告的AD患者外周血標(biāo)志物如平滑肌肌球蛋白重鏈(smMesHC)、CK_BB、MMPs、平滑肌肌鈣蛋白(Sm. troponin) ,Elastin 等，雖然這些指標(biāo)眾多，但是各自的優(yōu)缺點導(dǎo)致目前無法進(jìn)入臨床運(yùn)用。D- 二聚體是反應(yīng)體內(nèi)纖溶活性的生化指標(biāo)，是目前唯一能在臨床運(yùn)用的篩查AD的生化指標(biāo)。但是由于敏感性高、特異性差的特點，D- 二聚體也無法作為確診AAD的生化標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是篩選和鑒定能用于AD早期診斷的分子標(biāo)志物，為AD的早期診斷提供可以量化的指標(biāo)，提高主動脈夾層早期診斷率，降低臨床誤診與漏診率。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了 Lumican作為主動脈疾病早期診斷標(biāo)志物在制備主動脈疾病早期診斷試劑中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的主動脈疾病為急性主動脈疾病(AD)。優(yōu)選地，所述的急性主動脈疾病為急性主動脈夾層(AAD)、主動脈壁間血腫 (IMH)、胸腹主動脈瘤(TAA/AAA)。優(yōu)選地，所述的主動脈疾病早期診斷試劑為主動脈疾病早期診斷Elisa試劑，其包含生物素標(biāo)記Lumican抗體以及Lumican標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明的優(yōu)點是對胸痛患者進(jìn)行血清Lumican檢測，其檢測過程快速、檢測費用經(jīng)濟(jì)并對患者無創(chuàng)傷。


圖1為Lumican蛋白檢測驗證結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例來具體說明本發(fā)明。實施例1 :Lumican蛋白的篩查
首先取10例AAD患者的血清，以10例正常健康人血清為正常對照，以10例急性心肌梗死患者血清為疾病對照，利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation, iTRAQ)技術(shù)進(jìn)行篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Lumican在AAD患者血清中的表達(dá)是健康人的3. 6311倍。實施例2 檢測LUMICAN的ELISA試劑盒以及檢測方法
1.檢測LUMICAN的ELISA試劑盒包括酶聯(lián)板；Lumican標(biāo)準(zhǔn)品；樣品稀釋液；生物素標(biāo)記抗體稀釋液；辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液；生物素標(biāo)記Lumican抗體；辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素；底物溶液；濃洗滌液；終止液(均由武漢華美生物工程有限公司生產(chǎn)的人基膜聚糖/內(nèi)腔蛋白(LUM)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(No. CSB-E09797h)提供)。2.檢測具體步驟
1)標(biāo)本的采集和保存全血標(biāo)本室溫放置2小時內(nèi)，以4500 rpm離心20分鐘，取上清液，立即檢測；也可將上清液放于-80°C低溫保存，解凍后檢測。2)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋標(biāo)準(zhǔn)品8000rpm離心30秒。每瓶以樣品稀釋液稀釋至Iml(濃度為40ng/ml)，蓋好后靜置10分鐘，然后反復(fù)顛倒搓動幫助溶解。做系列倍比稀釋40 ng/ ml,20 ng/mlUO ng/ml、5 ng/ml、2. 5 ng/mlU. 25 ng/ml 和 0. 62 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，檢測前15分鐘配置。3)檢測步驟
加樣分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、代測樣品孔。空白孔中加樣品稀釋液100 μ ，余孔分別加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品或患者血清100 μι。酶標(biāo)板覆蓋覆膜，37°C反應(yīng)120分鐘。棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μ 1 (取1 μ 1生物素標(biāo)記Iumican抗體加99 μ 1生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前1 小時內(nèi)配制)，37°C，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200 μ 1/孔，思干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親合素工作液100 μ 1 (取1 μ 1辣根過氧化物酶標(biāo)記親合素加99 μ 1辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前1小時內(nèi)配制)，37°C，60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1. 5分鐘，200 μ 1/孔，思干。依次每孔加底物溶液90 μ 1，37°C避光顯色(30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止)。依次每孔加終止液50 μ 1，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色)。終止液的加入順序同底物液的加入順序。
用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測定各孔的光密度(0D值)。在加終止液后15分鐘內(nèi)進(jìn)行檢測。4)濃度計算使用Curve Exert 1. 3軟件，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品相應(yīng)的濃度。5)結(jié)果判定使用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)方法檢測患者血清Lumican濃度，當(dāng)胸痛患者Lumican濃度高于1. 5ng/ml時即可基本確診AD。
實施例3
取118例急性胸痛患者的樣本，其中包括AAM4例、主動脈瘤7例、主動脈壁內(nèi)血腫5 例、急性冠脈綜合癥37例、肺栓塞5例、肺部及胸膜炎癥4例、消化系統(tǒng)疾病2例、其他原因引起的胸痛4例，利用實施例2所述的方法進(jìn)行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)非AD患者的血清Lumican 濃度均低于1. 5ng/ml, 54例急性主動脈夾層(AAD)患者中有17例患者的Lumican濃度高于1. 5ng/ml, 7例主動脈瘤的患者中有5例Lumican濃度高于1. 5ng/ml (見圖1)。當(dāng)胸痛患者Lumican濃度高于1. 5ng/ml時，診斷主動脈疾病的準(zhǔn)確率100%。
權(quán)利要求
1.Lumican作為主動脈疾病早期診斷標(biāo)志物在制備主動脈疾病早期診斷試劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的主動脈疾病為急性主動脈疾病。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的急性主動脈疾病為急性主動脈夾層、 主動脈壁間血腫或胸腹主動脈瘤。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的主動脈疾病早期診斷試劑為主動脈疾病早期診斷Elisa試劑，其包含生物素標(biāo)記Lumican抗體以及Lumican標(biāo)準(zhǔn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種主動脈疾病早期診斷標(biāo)志物及其應(yīng)用。具體涉及Lumican作為主動脈疾病早期診斷標(biāo)志物在制備主動脈疾病早期診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點是對胸痛患者進(jìn)行血清Lumican檢測，其檢測過程快速、檢測費用經(jīng)濟(jì)并對患者無創(chuàng)傷。
文檔編號G01N33/68GK102565418SQ20111043864
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月25日
發(fā)明者姚晨玲, 童朝陽, 顧國嶸 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院