腸道病毒71型vp1抗原的免疫原性多肽及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種腸道病毒71型VPl抗原的免疫原 性多膚及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EV71是單股正鏈RNA病毒，從屬于小RNA病毒科腸道病毒A屬，其感染可引起嬰幼 兒手足口病，發(fā)病時(shí)主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉及瘤疹性咽峽炎。與典型手足口病不同的是，某 些EV71毒株感染可引起重癥手足口病，并發(fā)癥包括無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻 搏、神經(jīng)源性肺水腫甚至死亡。EV71感染發(fā)病廣泛，其流行范圍波及亞洲、歐洲、北美洲、澳 洲等，死亡率高，是目前頗受重視的公共衛(wèi)生問題。
[0003] 多年來，各國學(xué)者一直致力于EV71疫苗的研發(fā)，隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)等多學(xué) 科的交叉發(fā)展，EV71的重組亞單位疫苗、DNA疫苗、病毒樣顆粒疫苗相繼問世。其中EV71 傳統(tǒng)全滅活疫苗發(fā)展最為迅速，目前中國有S家機(jī)構(gòu)已完成EV71全滅活疫苗的III期臨床 試驗(yàn)。但全滅活疫苗存在諸多問題，例如免疫效果一般較低，無法誘導(dǎo)細(xì)胞毒T淋己細(xì)胞反 應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間較短，滅活劑對病毒抗原存在影響等；所W亟需研發(fā)新型 疫苗，在保留完整免疫原性的同時(shí)有效刺激免疫應(yīng)答，同時(shí)避免感染。
[0004] 關(guān)于EV71的感染診斷，傳統(tǒng)方法包括中和實(shí)驗(yàn)法及病毒分離法，W上方法費(fèi)時(shí)費(fèi) 力，實(shí)驗(yàn)要求較高，不適于臨床應(yīng)用。近年來，分子生物學(xué)檢測技術(shù)（如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（RT-PCR)、實(shí)時(shí)巧光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（如antitativeReal-timePCR))用于診斷 EV71感染的應(yīng)用越來越多，但是此類方法存在假陽性及假陰性，對實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，不易 在基層醫(yī)院開展。而酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)及免疫層析法（ICA)利用抗原抗體結(jié)合的原 理進(jìn)行EV71的檢測，操作簡單快速，目前有不少相關(guān)研究，但尚未在臨床上推廣。
[0005]EV71可分為A、B、CS個(gè)亞型，其中B及C亞型又可分別分為B1-B5及Cl-巧型。 EV71僅含一個(gè)開放閱讀框（openreadingframe, 0RF)，ORF的上下游分別為5'UTR和 3'UTR?；蚪MRNA全長約含7500個(gè)核巧酸，編碼具有2193個(gè)氨基酸的多聚蛋白，多聚蛋 白可^水解為？1、？2、口3^個(gè)前體蛋白，最終水解為4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（￥口1-￥口4)和7個(gè)非結(jié)構(gòu) 蛋白（2A-2C、3A-3D)。4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中，VP4包埋于病毒外殼的內(nèi)側(cè)，其余S個(gè)均暴露于病 毒顆粒表面，直接接觸宿主免疫系統(tǒng)；其中VPl蛋白具有與血清型相對應(yīng)的遺傳多樣性，包 含EV71主要的抗原決定簇，因此VPl是目前研究的熱點(diǎn)之一，已被廣泛應(yīng)用于手足口病的 病原檢測及疫苗研究。
[000引 VPl蛋白的BCloop區(qū)巧1-106氨基酸位點(diǎn)）是目前公認(rèn)的中和抗原決定簇位點(diǎn)， 但是否還存在其他重要的抗原決定簇尚需進(jìn)一步的研究論證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種腸道病毒71型VPl抗原的免疫原性 多膚及其制備方法與應(yīng)用。將VPl蛋白進(jìn)行分割，研究各膚段的抗原性及免疫原性，為EV71 的早期診斷試劑和疫苗研發(fā)提供基礎(chǔ)研究。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及一種腸道病毒71型VPl抗原的免疫原性多膚，其具有如序 列表中SEQIDNO.I-SEQIDNO. 5任一序列所示的氨基酸序列，或上述序列經(jīng)替換、缺失或 添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明的再一個(gè)方面設(shè)及編碼上述免疫原性多膚的多核巧酸；具體的，所述多核 巧酸的序列分別如沈QIDNO. 6-SEQIDNO. 10所示。
[0011] 本發(fā)明還提供含有上述多核巧酸序列的重組載體。
[0012] 前述的重組載體，其出發(fā)載體為祀T-49b(+)。
[0013] 本發(fā)明還提供含有上述重組載體的重組表達(dá)菌。
[0014] 前述的重組表達(dá)菌，其出發(fā)菌株為大腸桿菌DE3。
[0015] 本發(fā)明還提供腸道病毒71型VPl抗原的免疫原性多膚的表達(dá)和純化方法，其包括 如下步驟：
[0016] (1)將沈QIDNO. 6-SEQIDNO. 10所示的基因片段和載體祀T-49b(+)，經(jīng)SpeI 及HandIII雙酶切后，連接構(gòu)建得到表達(dá)載體祀T-49b(+) -VPl、祀T-49b(+) -VPl79 432、 祀T-49b(+) -VPl436 864、祀T-49b(+) -VPl436 73日和祀T-49b(+)-VPl5肋86S
[0017] 0)將步驟（1)的表達(dá)載體pET-49b(+)-VPl、pET-49b(+)-VPl? 432、 祀T-49b(+) -VPl436 864、祀T-49b(+) -VPl436ns和祀T-49b(+)-VPlses864轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3， 篩選陽性克隆，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白；
[0018] (3)將步驟（2)的重組蛋白采用谷脫甘膚琉基轉(zhuǎn)移酶（GST)瓊脂糖凝膠純化，即 得。
[0019] 步驟（1)中，SEQIDNO. 6-SEQIDNO. 10所示的基因片段的構(gòu)建方法為：W SDLY107 (GenBank:JX244186. 1)全長cDNA為PCR模板，W沈QIDNO. 11-沈QIDNO. 20 所 示的引物序列為擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到VPl基因全長片段及4段VPl基因片段，分別為 VPlVPl79 432YPl436 864YPl436 735和YPl565 864
[0020] 擴(kuò)增的引物序列具體如下：
[002。SpeIVPlPrimerF:5' -CGGACTAGTGGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTG-3'；（SEQID NO. 11)；
[0022] HindIIIVPlPrimerR:5, -CCCAAGCTTCTAAAGAGTGGTGATCGCTGTGCG-3,；（SEQID NO. 12)；
[0023]IVPlSpeIPrimerF:5，-CGGACTAGTATGCCCACAGGCCAGAACACACAGGTGA-3，；（SEQID NO. 13)；
[0024]IVPlHindIIIPrimerR:5'-CCCAAGCTTCTACCCGGTGGGTGTGCACGCAACAAAA-3，；（SEQ IDNO. 14)；
[00巧]2VPlSpeIPrimerF:5,-CGGACTAGTATGGTTGTCCCACAATTGCTCCAATATA-3，；（SEQIDNO.巧）；
[0026] 2VPlHindIIIPrimerR:5，-CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTTG-3，；（SEQID NO. 16)；
[0027] 3VPlSpeIPrimerF:5'-CGGACTAGTGTTGTCCCACAATTGCTCCAATA-3,；（SEQID NO. 17)；
[0028] 3VPlHandIIIPrimerR:5' -CCCAAGCTTCTAGTACTTGGACTTGGAGGTCC-3';(沈QID NO. 18)；
[0029] 4VPlSpeIPrimerF: 5, -CGGACTAGTCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTC-3,；（SEQID NO. 19)；
[0030] 4VPlHandIIIPrimerR:5' -CCCAAGCTTCTAACCAGTTGGCTTAATGGAGTT-3';(SEQID NO. 20)。
[0031] 本發(fā)明還提供上述腸道病毒71型的VPl抗原的免疫原性多膚在制備EV71病毒的 診斷試劑中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明的有益效果：
[0033] (1)本發(fā)明在EV71結(jié)構(gòu)蛋白VPl上BCloop區(qū)巧1-106氨基酸位點(diǎn)）之外發(fā)現(xiàn)了 新的免疫原性多膚，該多膚具有良好的抗原性和免疫原性，為EV71的早期診斷試劑開發(fā)和 疫苗研發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。
[0034] (2)本發(fā)明的免疫原性多膚的表達(dá)和純化方法操作簡單、方便、省時(shí)，有利于實(shí)現(xiàn) 大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[00巧]圖1 :VP1蛋白的表達(dá)及鑒定結(jié)果；圖中，1 :蛋白marker;2 :未轉(zhuǎn)化過質(zhì)粒的DE3 菌體；3 :W濃度為0. 33mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)化；4 :W濃度為0. 67mmol/L的IPTG誘導(dǎo) 表達(dá)化；5 :W濃度為0. 33mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)地；6 :W濃度為0. 67mmol/L的IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)地；7 :W濃度為0. 33mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)化；8 :W濃度為0. 67mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)化。VPl-GST融合蛋白分子量為59kd。
[003引圖2 :免疫原性