專利名稱：人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程抗體技術(shù)，具體地說，涉及人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)普遍存在的公共健康問題，急性乙型肝炎過后有5%-10%的持續(xù)HBV感染發(fā)展為慢性肝病，包括慢性活動性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。據(jù)估計全世界每年有500，000到1，000,000人死于與HBV有關(guān)的各種肝臟疾病。我國屬于肝炎大國，乙肝病毒攜帶率為人口的9. 75%。全世界乙肝病毒感染者4. 2億，我國約有I. 3億人攜帶乙肝病毒。乙肝病毒的傳播方式大致可分為垂直傳播和水平傳播兩大類。垂直傳播指HBV攜帶者母親對胎兒的傳播，絕大部分發(fā)生在妊娠的最后三個月。嬰兒一旦感染乙肝病毒，他們中85%-90%會發(fā)展成慢性帶乙肝病毒狀態(tài)，其中25%于成年后將死于肝硬化和肝癌。99年的研究顯示，我國乙肝病毒感染者也就是乙肝病毒攜帶者和慢性乙型肝炎中有80%-85%來源于父母在生殖生育過程中的感染。水平傳播可以概括為圍產(chǎn)期傳播、家庭內(nèi)傳播、醫(yī)源性傳播和性傳播，而其中圍產(chǎn)期傳播較嚴(yán)重。關(guān)于慢性乙型肝炎的治療目前還沒有一個令人滿意的方法，對于肝功能有損害的病人通過保肝治療絕大部分可以使肝功能得到恢復(fù)，但要清除乙肝病毒卻是十分困難的。乙肝病毒慢性攜帶者更是如此。其原因主要是免疫耐受，也就是乙型肝炎病毒感染者的體內(nèi)免疫系統(tǒng)對乙型肝炎病毒不能產(chǎn)生有效的清除作用。免疫耐受的原因是人體感染乙肝病毒的時間較早，普遍認(rèn)為是在3歲以前感染的。尚未找到合適的治療方法之前，防止病毒感染就顯得十分重要。目前對于乙肝病毒的預(yù)防主要包括主動免疫和被動免疫兩種。主動免疫即注射乙肝疫苗，自70年代末首次出現(xiàn)血源性乙肝疫苗，經(jīng)過幾十年的發(fā)展到現(xiàn)在已有了成熟的基因工程疫苗。乙肝疫苗的免疫效果好，是預(yù)防乙型肝炎傳播的有效手段之一。被動免疫為注射乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)，主要用于阻斷母嬰傳播(與乙肝疫苗聯(lián)合使用)和意外事故的被動免疫。有研究表明采用乙肝疫苗聯(lián)合HBIG阻斷母嬰傳播效果優(yōu)于單用疫苗者并且能減少慢性感染的比例。目前HBIG均來源于人抗-HbsAg的陽性血清，這就使其大量制備受到限制，同時由于來源于血清所以容易發(fā)生血源性傳播疾病的感染。正如血源性疫苗向基因工程疫苗的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)在也亟待開發(fā)出基因工程乙肝表面抗體替代血源性HBIG，噬菌體抗體庫技術(shù)為這一問題的解決另辟踐徑。利用含有特異性抗體的人源或動物血清免疫球蛋白來預(yù)防和治療傳染病由來已久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實驗的證明，如鼠抗甲肝病毒、漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)100%保護(hù)動物免受病毒攻擊。以抗原免疫動物獲得多抗血清的途徑一直是獲得抗體的經(jīng)典方法，但缺乏特異性和均一性。繼而建立的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)使得眾多科學(xué)家通過細(xì)胞工程可以在體外定向地制備各種單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb),其特異性強(qiáng)，性質(zhì)均一，易于大量生產(chǎn)。然而McAb多為鼠源性，鼠源McAb的異源性反應(yīng)極大地限制了 McAb作為治療制劑在人體的應(yīng)用。免疫球蛋白(Vaccinia immune globulin, VIG)作為抗體成分主要來自捐獻(xiàn)者(恢復(fù)期病人)免疫血清,從獲得陽性血清到通過安全性檢測均需花費(fèi)大量的人力和財力，這就使其大量制備受到限制，同時由于來源于血清所以容易發(fā)生血源性傳播疾病的感染。而使用人源基因工程產(chǎn)品替代血制品則可克服這些缺陷，隨著人源基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來了新的希望和廣闊前景。通過基因水平上抗體分子的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來越顯示出其重要意義及實際運(yùn)用前景。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術(shù)興起和整個基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展 ，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進(jìn)展，并已由基礎(chǔ)研究階段步入實質(zhì)性應(yīng)用研究和開發(fā)階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療帶來了新的希望，在抗病毒感染生物藥領(lǐng)域逐漸形成了一類新的抗病毒藥，即所謂的抗體藥(Antibody Drug)。正如血源性疫苗向基因工程疫苗的轉(zhuǎn)變，現(xiàn)在也亟待開發(fā)出基因工程抗體替代血源性VIG，如通過嵌合抗體技術(shù)(Boulianne, G. L.等，1984;Morrison, S. L.等，1984)、人源化抗體技術(shù)(Jones, P.T.等，1986)、攜帶人單抗的轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)(Green，L.L.等，1994)、異體雜交瘤技術(shù)(James, K. et al.，1987)、曬菌體表面展示技術(shù)(Barbas, C. F.等，1991)等產(chǎn)生人源化抗體,現(xiàn)已成為國內(nèi)外研究的熱點，并正在逐步獲得成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體及其活性片段。本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述抗體或其活性片段的基因。本發(fā)明的另一目的是提供所述人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供所述人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFab03或其活性片段，其輕鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表I所示表I抗體HBFab03的重鏈及輕鏈高變區(qū)的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重鏈VH SITGSSYY IYSTSGTT ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV輕鏈VL QSVDSSR DASQQYASAPDT前述的抗體HBFab03，i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；例如，將第7位的Gly替換為Ala，或是將第17位的Ala替換為Val，或是在28位缺失Asp均不會影響蛋白的功能；以及ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第6位的Gly替換為Asp，或是將第38位的Thr替換為Ala均不會影響蛋白的功能。
本發(fā)明還提供編碼所述抗體HBFab03的基因。其中，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本發(fā)明的一種人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFabl2或其活性片段，其輕鏈高變區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列如表2所示表2抗體HBFabl2的重鏈及輕鏈高變區(qū)的氨基酸序列CDRlCDR2CDR3重鏈VH SITGSSYY IYSTSGTT ARPTAHRNVRMVPGQDAFEV輕鏈VL QSVSSTY GASQQYGYSPLT
前述的抗體HBFabl2，i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；例如，將第 位的Gly替換為Ala，第17位的Ala替換為Val，均不會影響蛋白的功能；以及ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第6位的Gly替換為Asp，或是將第38位的Thr替換為Ala均不會影響蛋白的功能。本發(fā)明還提供編碼所述抗體HBFabl2的基因。其中，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示。本發(fā)明還提供含有編碼所述抗體HBFab03和/或HBFab 12的基因的載體及含有該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供所述抗體HBFab03或HBFabl2或它們的活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體ScFv或全抗體免疫球蛋白IgG。本發(fā)明還提供所述抗體HBFab03或HBFabl2的制備方法，其是利用噬菌體表面展示技術(shù)，采集多個具有高滴度乙肝病毒表面抗原抗體者的外周血淋巴細(xì)胞，通過基因工程方法構(gòu)建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體文庫，并篩選獲得特異性抗乙肝病毒表面抗原的基因工程抗體Fab段。獲得的Fab段抗體分別命名為HBFab03和HBFabl2。這2株重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合乙肝病毒的功能性抗體。它們特異性識別乙肝表面抗原，且均針對“ α ”決定簇，與乙肝病毒表面抗原具有明顯的酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)和較高的親和力，具有阻止HBV感染敏感細(xì)胞的中和功能。HBFab03和HBFabl2特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗乙肝病毒表面抗原抗體基因庫的特異性富積篩選，該抗體庫的建立來源于中國乙肝疫苗免疫者外周血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間框架區(qū)序列組成了每個抗體可變區(qū)序列特征，HBFab03和HBFabl2均隸屬于抗體重鏈家族VH4，抗體輕鏈家族VK3。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域⑶R1、⑶R2和⑶R3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)所決定，6個相應(yīng)的⑶R區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定發(fā)明中每個抗體的抗原結(jié)合特征和抗乙肝病毒功能特征(見表I和表2)。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對編碼上述Fab段抗體的基因序列進(jìn)行改造，獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。進(jìn)一步地，本發(fā)明將上述Fab抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，獲得分子量更小的單鏈抗體(ScFv)，該抗體同樣能夠特異性識別乙肝病毒表面抗原，具有細(xì)胞內(nèi)免疫的作用。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用?？蓪⑸鲜鼍幋aFab抗體的基因、ScFv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主，通過誘導(dǎo)表達(dá)獲得Fab抗體以及單鏈抗體。此外，可將上述Fab抗體的輕鏈編碼基因和重Fd段基因克隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)抗乙肝病毒的全抗免疫球蛋白。例如，可將上述2株Fab抗體(HBFab03和HBFabl2)的輕鏈和重Fd段基因分別克隆入全抗體表達(dá)載體pAC-K_Fc并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)可實現(xiàn)全抗 體的分泌型表達(dá)，得到全抗體HBIgG03 和 HBIgG12。利用ELISA、SDS_PAGE、BIAcore、競爭阻斷實驗及體外細(xì)胞學(xué)實驗對獲得的全抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明2株人源IgG全抗體(HBIgG03和HBIgG12)針對乙肝表面抗原均有特異性結(jié)合；HBIgG03和HBIgG12對乙肝表面抗原顯示出較高的親和力，親和力常數(shù)KD(M)分別為3. 75X 10_9和9. 53X 10Λ競爭阻斷實驗及體外細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果表明這2株人源抗體(HBIgG03和HBIgG12)具有阻止HBV感染敏感細(xì)胞的功能，具有中和活性。這一結(jié)果為阻止乙肝病毒感染和乙肝病毒相關(guān)肝病的治療研究奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明還提供所述抗體HBIgG03或HBIgG12或它們的活性片段在制備預(yù)防或治療乙肝病毒相關(guān)肝病的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步含有所述抗體HBIgG03或HBIgG12或它們的活性片段的藥物或診斷試劑。本發(fā)明利用噬菌體抗體庫技術(shù)，成功地獲得了 2株特異性針對乙肝病毒表面抗原的人源中和性抗體HBIgG03和HBIgG12 ;利用上述獲得的人源中和性抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體可變區(qū)基因、Fab抗體基因以及各自抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)該抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有該抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和乙肝病毒感染的抗體產(chǎn)物，制成臨床上用于預(yù)防和治療乙肝病毒相關(guān)肝病的特異性抗體藥物或診斷試劑。


圖I為ELISA檢測表達(dá)的人Fab抗體對抗人Fab和HBsAg的特異性結(jié)合。圖2純化后IgG的SDS-PAGE電泳圖。圖3為應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)測定人源抗乙肝病毒表面抗原單抗親和力的結(jié)果;其中，A 為 HBIgG03，B 為 HBIgG12。圖4為H印G2細(xì)胞中HBV PreslDNA檢測結(jié)果；其中，A、B、C、D1、D2、E、F和G分別為乙肝病毒感染組；HBV和人源抗體HBIgG03孵育后再感染；HBV和人源抗體HBIgG12孵育后再感染；HBV和鼠單抗孵育后感染(鼠單抗稀釋度1:400) ;HBV和鼠單抗孵育后感染(鼠單抗稀釋度1:800);單用人源抗體HBIgG03和H印G2細(xì)胞作用；單用人源抗體HBIgG12和HepG2細(xì)胞作用；單用鼠單抗與HepG2細(xì)胞作用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例I人源抗乙肝病毒抗體庫的構(gòu)建及Fab抗體的篩選I. I材料和方法I. I. I病毒、細(xì)胞及載體來源乙肝病毒HBV China C Subtype已在文獻(xiàn)(王琳，劉文等，中國流行的C基因型HBV穩(wěn)定復(fù)制表達(dá)細(xì)胞系的建立，解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2010，12 ;黃維金，周誠等，乙型肝炎病毒中國流行株B、C、D/C及A基因型的全基因克隆與序列分析，世界華人消化雜志，2009，17(29) =2978-2983)中公開，由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所肝炎室提供。人肝癌細(xì)胞系H印G2、昆蟲細(xì)胞Sf9(購自ATCC，美國)。菌株 XLl-Blue (Stratagene,美國)，載體 pComb3H(40kb),由美國 Scripps 研究所饋贈。桿 狀病毒表達(dá)載體pAC-K-Fc，購自德國PROGEN公司，商品編號PR3003。乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)購自北京萬泰生物藥業(yè)公司；鼠抗乙肝表面抗原單克隆抗體3E7 (MouseAnti-Hepatitis B Surface Antigen HbsAg, Clone 3E7)購自 DAKO 公司。乙肝表面抗原陽性血清由佑安醫(yī)院肝病研究所惠贈。I. I. 2抗原制備分離HBV病毒顆粒Csc12墊層4ml，上面加6ml血清標(biāo)本(委托首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院采集)，超速離心30000轉(zhuǎn)/分鐘，離心4小時；棄上清，加入IXPBS Iml懸浮沉淀，4°C放置過夜；12000轉(zhuǎn)/分鐘瞬時離心，保留上清即HBV病毒懸液。I. I. 3噬菌體抗體庫的構(gòu)建用淋巴細(xì)胞分離液(Sigma，美國)從具有高滴度乙肝病毒抗體的疫苗注射者的抗凝血液中分離淋巴細(xì)胞，用RNeasy Mini Kit (QIAGEN,德國)提取總細(xì)胞RNA,以01igo-dT為引物，提取的RNA為模版采用Invitrogen公司的第一鏈合成試劑盒(SuperScriptTMIIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PC R. Cat No. 18080-051)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.用一組擴(kuò)增人源抗體IgGl重鏈Fd及輕鏈Kappa和Lambda的引物,使用的引物序列如下(一)重鏈Fd區(qū)引物5，端VHla 5’-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’VHlf 5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’VH2f 5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’VH3a 5’-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3'VH3f 5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3'VH4f 5，-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’VH6f 5’-CAG GTG CAG CTA CTA GAG TGG GG-3’VH6a 5，-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’3，端CGlZ 5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3'(二)輕鏈引物
κ鏈可變區(qū)5’ -端VKla 5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’VK2a 5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3'VK3a 5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3'κ鏈可變區(qū)3-端CKld 5’ -GCG CCG TCT AGA ATT MC ACT CTC CCC TGT TGA AGCTCT TTG TGA CGGGCG AAC TCA-3'λ鏈可變區(qū)5-端
VLl 5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’VL2 5，-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’VL3 5，-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3'VL4 5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3'VL5 5，-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’VL6 5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3'入鏈可變區(qū)3-端CL2 5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’對人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94°C lmin，54°C lmin，72°C 2min,共35個循環(huán)。建庫方法基本按文獻(xiàn)進(jìn)行(Barbas, C. F III. , Kang, A. S. , andlarner, R. A. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: thegene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88 (18) : 7978-7982)。具體如下將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用Sacl/Xbal和Xhol/Spel克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕、重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10 μ I蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入事先制備好的200 μ I電轉(zhuǎn)菌XLl-Blu (電轉(zhuǎn)條件為=Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，2. 5千伏)，電轉(zhuǎn)后加10ml SOC培養(yǎng)液，37° C I小時，加入IOml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液37° C培養(yǎng)1小時，加入80-1001111前述58，37° C 2小時后加入輔助噬菌體VCSM13 1X1012，1小時后加入卡那霉素(70 μ g/ml)，37° C搖床培養(yǎng)過夜。用4% PEG8000和3% NaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm，20分鐘，4°C離心后，用2ml 0. 02M PBS pH 7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫，分裝保存于-20° C冰柜中。I. I. 4噬菌體抗體庫的富集篩選及Fab段抗體的誘導(dǎo)表達(dá)以純化乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)為篩選抗原。使用時用0. lmol/LNaHCO3(pH8. 6)溶液稀釋，包被免疫管，用含4%脫脂奶的PBS液，于37°C封閉2h后，加入上述噬菌體抗體庫，每管lml，37°C孵育2h，用含5% Tween-20的TBS液反復(fù)洗20遍，最后每管用lmlpH2. 2的甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫，并用pH9. 6的Tris液中和。洗脫后的噬菌體繼續(xù)感染2ml新鮮的OD6tltl為I. O左右的XLl-Blu菌，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13 (Stratagene,美國)感染后進(jìn)行下一輪篩選。如此反復(fù)篩選4飛次。具體富集篩選方法及Fab段的誘導(dǎo)表達(dá)基本按文獻(xiàn)(Barbas, C. FIII. , Kang, A. S. , and larner, R. A. Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surface: the gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1991; 88 (18) :7978-7982)進(jìn)行。具體如下
用O. IM NaHCO3 (pH8. 6)的溶液包被純化的乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg) (I :200稀釋)，每孔100μ 1，4°C過夜；次日用IXPBST洗去未吸附的抗原，用4%的脫脂奶37°C封閉I小時，棄封閉液；每孔加入80 μ I噬菌體抗體庫，37°C孵育2小時，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用 lXTBST(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl,0. 5% Tween 20，ρΗ7· 5)洗液沖洗各孔，沖洗時，用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入50 μ I Gly-HCl (ρΗ2. 2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘，期間反復(fù)吹打數(shù)次。加入適量的2Μ Tris，以中和洗脫下來的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLl-Blu菌液中(0D_ = I)，室溫孵育15-20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SBlOml (氨芐青霉素:20yg/ml，四環(huán)素:10 μ g/ml)，立即取10 μ I涂氨芐青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37°C振蕩培養(yǎng)I小時，加入IOOmlSB(氨芐青霉素100 μ g/ml)，37°C I小時后，加入輔助噬菌體VCSM13 μ 1ml，37°C振蕩培養(yǎng)2小時，加入卡那霉素(終濃度70 μ g/ml)，37°C培養(yǎng)過夜。如此反復(fù)篩選4次。
I. I. 5人源抗乙肝病毒表面抗原Fab抗體的ELISA檢測(I)檢測Fab的表達(dá)用O. lmol/L NaHCO3 (pH9. 6)溶液將抗人Fab 抗體(I 2000 稀釋后使用，Sigma，美國)包被于酶標(biāo)板上，4°C過夜；4%脫脂奶封閉，37°C lh，加入表達(dá)的Fab抗體，37°C Ih ;力口入酶標(biāo)抗人Fab 二抗(I 2000稀釋后使用，Sigma，美國)，37°C Ih ;顯色液顯色，2M H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測吸光度A值。(2)間接酶聯(lián)免疫法檢測Fab與乙肝病毒表面抗原的結(jié)合活性用純化乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)作為包被抗原，其余步驟同上。I. I. 6人源Fab抗體可變區(qū)基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit (QIAGEN,德國)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。輕重鏈的測序引物分別為 5' -AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3'和 5' -CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3'。將測序結(jié)果與Internet V-Base基因庫中IgG基因序列進(jìn)行比較。I. I. 7全抗體重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將獲得的Fab抗體的輕鏈用Xbal/SacI進(jìn)行酶切，然后用末端補(bǔ)平酶(K片段)補(bǔ)平，克隆至 pAC-K-Fc 載體(德國 PR0GEN，商品編號 PR3003) (Liang, M. F.，Stefan, D.，Li, D.X. , Queitsch, I. , Li, ff. , and Bautz, E. F. Baculovirusexpression cassette vectors forrapid production of complete human IgG from phage displayselected antibodyfragments. Journal of Immunological Methods. 247:119-130.),再利用 Xhol/Spel 位點將重鏈Fd段克隆進(jìn)去，構(gòu)建成全抗體表達(dá)載體。I. I. 8采用美國Pharmogen公司的BaculoGold共轉(zhuǎn)染試劑盒。操作方法略述如下將5 μ g的重組質(zhì)粒DNA與0. 5 μ g的BaculoGold線性DNA混合后，利用試劑盒中的轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染生長密度為50%的Sf9細(xì)胞，27°C培養(yǎng)4d后，收集上清作為重組病毒的毒種進(jìn)行滴定和擴(kuò)增。具體操作見 Baculovirus expression vector system手冊(BD BiosciencesPharmingen, USA)。I. I. 9全抗體IgG分泌表達(dá)和純化用重組病毒感染生長密度70%左右的Sf9細(xì)胞，27 °C吸附lh。隨后改用SF-900 II SFM無血清培養(yǎng)液，27 °C培養(yǎng)3 5d后收集上清。采用Amersham公司的Protein-A 親和層析柱直接純化表達(dá)上清(Harlow E, Lane D. Antibodies:A LaboratoryManual [Μ]. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)。利用 ELISA 及 IFA對所獲純化的IgG抗體功能特性進(jìn)行鑒定。具體操作見I. I. 5和I. I. 6。I. I. IOBIAcore法測定全 抗體親和力(I) CM5傳感器芯片動力學(xué)手動標(biāo)片用HBS-EP_BUFFER(GE，美國)作為流動相緩沖溶液，樣品稀釋溶液使用IOmM NaAcρΗ4· 0、4· 5、5· 0、5· 5，軟件采用 BIAcore 3000 控制軟件，用 Amine Coupling For 30-50Immoblization Kit (GE,美國)確定氨基偶聯(lián)HBsAg的最佳濃度，IOmM NaAc最佳pH值,在芯片流通池分別固定700RU、1300RU、2400RU，用pH 2.0 IOmM甘氨酸-鹽酸(Gly-HCl)分別進(jìn)行飽和濃度，解離情況測試確定最佳再生條件。(2)動力學(xué)測試分別以HBsAg固定量700RU、1300RU.2400RU流通池為檢測通道，未偶聯(lián)HBsAg流通池為參比通道，HBS為流動相，流速30μ L/min，基線穩(wěn)定5min，抗體抗原結(jié)合3min，解離5min，依次以抗體濃度32、16、8、4、2、0nM(nmol/L)，預(yù)先空跑8nM 3-10次反應(yīng)以穩(wěn)定芯片，OnM和8nM做兩次平行，防止系統(tǒng)漂移。(3)數(shù)據(jù)結(jié)果處理采用Biaevaluation分析軟件處理SPR信號圖，全I(xiàn)gG抗體每個濃度注射到偶聯(lián)HBsAg流通池后的圖譜減去注射相同濃度的抗體到參比流通池所得到的圖譜，參比校正后進(jìn)行曲線擬合，以描述抗原抗體反應(yīng)動力學(xué)的適當(dāng)模型，并計算KA和KD值。I. I. 11人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體體外抗病毒效果研究利用!fepG2細(xì)胞模型來評價獲得的這2株人源抗-HBsAg抗體的中和活性。首先收集乙肝病毒陽性血清通過超速離心獲得病毒顆粒。將生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞分為幾組，A組用病毒顆粒感染；B組用HBV和人源抗體HBIgG03孵育后再感染；C組用HBV和人源抗體HBIgG12孵育后再感染；D組用HBV和鼠單抗孵育后感染；E組單用人源抗體HBIgG03和H印G2細(xì)胞作用疋組單用人源抗體HBIgG12和H印G2細(xì)胞作用；G組單用鼠單抗與H印G2細(xì)胞作用。上述各類樣品與H印G2細(xì)胞作用時，在培養(yǎng)基中加了 10_4-10_6M的地塞米松(地塞米松可以通過作用于HBV基因內(nèi)的糖皮質(zhì)激素元件上調(diào)HBV的復(fù)制)。具體操作如下將HepG2細(xì)胞傳代置于96孔板中，每孔中的細(xì)胞個數(shù)為IX IO4 ;兩天后細(xì)胞數(shù)量增至5 X IO4個/孔，將超速離心獲得的HBV懸液用DMEM全培養(yǎng)基按2倍、4倍、8倍稀釋；分別取HBV原液、2倍、4倍、8倍稀釋液各100 μ I加入96孔板中，與HepG2細(xì)胞37°C孵育3小時；取HBV原液、2倍、4倍、8倍稀釋液各100 μ I分別與人IgGlOO μ g、10 μ g、5 μ g、2. 5 μ g或與I IOOU 200,1 400,1 800稀釋的鼠單抗37°C孵育I小時，將抗原抗體混合物加入96孔板的H印G2細(xì)胞中37°C孵育3小時(每個濃度的抗原抗體混合物制備3孔)；棄去孔中液體，用I XPBS將貼壁細(xì)胞洗3遍；再向孔中加入含有10_4M地塞米松和10_5M胰島素的DMEM全培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I天；吸出孔中液體分別保存，用I XPBS將貼壁細(xì)胞洗3遍，力口入DMEM全培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I天；吸出孔中液體分別保存，加入含有10_6M地塞米松和10_6M胰島素的DMEM全培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)，每兩天換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)8天。分別利用ELISA、免疫熒光(IFA)和PCR等方法檢測細(xì)胞及細(xì)胞上清的乙肝病毒抗原。(I) ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清
用純化乙型肝炎表面抗原(CHO-HBsAg)作為包被抗原，分別檢測經(jīng)HBV或抗原抗體復(fù)合物孵育后I天、2天、4天、6天、8天采集的細(xì)胞培養(yǎng)上清，其余同I. I. 5中(2)。(2)間接免疫熒光(IFA)檢測將經(jīng)過HBV或HBV+抗體孵育后的IfepG2細(xì)胞培養(yǎng)8天后制成抗原片，丙酮固定，-20°C固定30分鐘；加入鼠單抗(I 1000)37°C孵育30分鐘，洗凈，吹干；按照1:30的比例，加入用1:30000稀釋的伊文思蘭溶液稀釋的抗鼠Fe熒光抗體，37°C孵育30min，洗凈，吹干。熒光顯微鏡檢測拍照。(3) PCR 檢測按試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞染色體外DNA，取5 μ I作為模板，合成halfnest-PCR,引物如下
引物I :HBsAg 上游5’ -GACTGGGGACCCTGCACCGAAC-3’引物2 =Presl 上游5，-GGAAGATCTCCATGGGAGGTTGGTC-3’引物3 =Presl 下游5’ -CCGGAATTCTTAGGCCTGAGGATGAC-3’先用引物I和引物3作為外引物擴(kuò)增出Presl+Pres2+S段基因，再用上述擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以引物2和引物3為內(nèi)引物擴(kuò)增出Presl片段。I. I. 12非高變區(qū)氨基酸突變后獲得的抗體對乙肝病毒抗性的研究基于HBIgG03重鏈可變區(qū)氨基酸序列，將SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第6位的Gly替換為Ala，將HBIgG03輕鏈可變區(qū)(SEQ ID No. I所示)的第8位的Thr替換為Gin。分別合成HBIgG03的重鏈編碼核酸序列(在相應(yīng)位置將密碼子ggc替換為gcc)以及輕鏈編碼核酸序列(在相應(yīng)位置將密碼子acc替換為cag)。按照上述I. I. 8 1. I. 11的方法，將輕鏈基因和重鏈Fd段克隆到pAC-K-Fc中，并轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)實現(xiàn)全抗體的分泌型表達(dá)，并對該突變體進(jìn)行免疫學(xué)檢測。I. 2 結(jié)果I. 2. I人源抗乙肝病毒表面抗原抗體庫的篩選成功構(gòu)建4個Kappa庫和4個Lambda庫，庫容量在IXlO7以上，輕重鏈插入率在95%以上。分別對Kappa子庫和Lambda子庫進(jìn)行包裝,用純化乙肝表面抗原經(jīng)過三輪篩選發(fā)現(xiàn)Kappa子庫三輪篩選出現(xiàn)富集現(xiàn)象，洗脫庫容逐漸增加，而Lambda子庫并未出現(xiàn)，挑取400個Kappa子庫克隆和200個lambda子庫克隆，ELISA結(jié)果顯示針對HBsAg陽性克隆有199個，全部來自Kappa子庫，測序共發(fā)現(xiàn)20株序列不同的抗體克隆(表3)。表3抗體庫包裝和富集篩選產(chǎn)出量
包裝庫容賴庫容(出歸)5^
(f; ^^挑選克隆陽性克隆
(cfWml) 一輪二輪二 if/T-TTM、列克隆
(ELISA)
Kappa 庫 7xlOi3 5χ105 6χ106 4χ107 600 199 20 Lambda 庫 8χ1013 5χ105 3χ105 2χ105 200_O_OI. 2. 2人源抗乙肝病毒表面抗原抗體的序列分析用DNASTAR序列分析軟件對Fab片段進(jìn)行分析處理，并與Internet V-Base基因庫中的IgG序列進(jìn)行比較，篩選出20株序列不同的Fab抗體，其重鏈可變區(qū)分類在VH4、VH1和VH3，其中主要為VH4，輕鏈可變區(qū)分類在VKl和VK3，并分別命名為HBFabOl到HBFab20。從輕重鏈可變區(qū)⑶R3區(qū)的氨基酸序列(表4)發(fā)現(xiàn)，從HBFab03到HBFab20重鏈均相同但輕鏈不同。其中，抗體HBFab03輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 7所示；抗體HBFabl2輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ IDNo. 3和SEQ ID No. 4所示，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 7 和 SEQ ID No. 8 所示。表4人源抗乙肝病毒表面抗原Fab抗體互補(bǔ)決定區(qū)基因的氨基酸序列分析
權(quán)利要求
1.人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFab03或其活性片段，其特征在于，其輕鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體HBFab03，其特征在于， i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 )其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求2所述抗體HBFab03的基因，其中編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
4.人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBFabl2或其活性片段，其特征在于，其輕鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體HBFabl2，其特征在于， iii)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQID No. 3所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 iv)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQID No. 4所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
6.編碼權(quán)利要求5所述抗體HBFabl2的基因，其中編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示。
7.權(quán)利要求I或4所述抗體或它們的活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體ScFv或全抗體免疫球蛋白IgG。
8.權(quán)利要求I或4所述抗體或它們的活性片段的制備方法，其特征在于，利用噬菌體表面展示技術(shù)，采集多個具有高滴度乙肝病毒表面抗原抗體者的外周血淋巴細(xì)胞，通過基因工程方法構(gòu)建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體文庫，并篩選獲得特異性抗乙肝病毒表面抗原的基因工程抗體Fab段。
9.權(quán)利要求I或4所述抗體或它們的活性片段在制備預(yù)防或治療乙肝病毒相關(guān)肝病的藥物或診斷試劑中的應(yīng)用。
10.含有權(quán)利要求I或4所述抗體或它們的活性片段的藥物或診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選獲得的人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體HBIgG03(輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)和HBIgG12(輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)。所述抗體能夠特異性識別乙肝病毒表面抗原，可與乙肝病毒表面抗原發(fā)生顯著的酶聯(lián)免疫反應(yīng)且具有抗乙肝病毒感染的中和活性功能。此外，可將本發(fā)明的抗體制成預(yù)防和治療乙肝病毒相關(guān)肝病的特異性抗體藥物，從而在臨床中用于預(yù)防和治療由乙肝病毒引起的肝病。
文檔編號G01N33/569GK102863527SQ20121016783
公開日2013年1月9日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者梁米芳, 畢勝利, 孫麗娜, 郭瑜, 劉洋, 張福順, 李川, 李德新 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所