專利名稱：乙肝表面抗原的兔單克隆抗體及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總地涉及乙肝病毒(HBV)。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及抗HBV表面抗原的兔單 克隆抗體和用它診斷HBV感染的方法。
背景
乙肝病毒(HBV)是一組含有小DNA的病毒的成員，它們能引起肝臟的持續(xù)性非 致細(xì)胞病變性感染。人感染HBV可引起嚴(yán)重的黃疸、肝變性和死亡。HBV主要通 過(guò)胃腸道外途徑進(jìn)入(人體)，特征性潛伏期為60-160天，在慢性病攜帶者血液中可 持續(xù)數(shù)年。HBV在醫(yī)學(xué)上十分重要，因?yàn)樗侨寺愿尾∪绺渭?xì)胞癌的最常見誘因 之一。感染的肝細(xì)胞連續(xù)分泌病毒顆粒，在血液中積累到很高水平。而且，估計(jì)約 6-7%人群被感染，在東南亞和亞撒哈拉非洲的某些地區(qū)人群感染水平高達(dá)20%。
用幾項(xiàng)測(cè)試監(jiān)測(cè)血清和其它體液中是否存在HBV組分。在原理上，這些測(cè)試主 要是免疫學(xué)測(cè)試，依賴人或動(dòng)物產(chǎn)生的抗體的存在來(lái)監(jiān)測(cè)特定病毒蛋白，如乙肝表 面抗原(HBsAg)、乙肝核心(核衣殼)抗原(HBcAg)或乙肝"E"抗原(HBeAg)。然而，相 對(duì)于在血清學(xué)HBsAg診斷或血液篩選試驗(yàn)中產(chǎn)生假陰性結(jié)果，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注變異 的HBsAg的作用。
具體說(shuō)，由于HBV通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄前基因組RNA的復(fù)制模式，HBV相對(duì)于其它 DNA病毒突變速率更高。已經(jīng)描述了所有HBV DNA-編碼的病毒蛋白如聚合酶、 HBcAg和HBsAg中的氨基酸取代。HBV的組特異性"a"決定區(qū)(氨基酸124-147， 相對(duì)于HBsAg的S部分編號(hào))已經(jīng)吸引了許多關(guān)注，因?yàn)樵?0-20%的逃避疫苗中和 者(escapee)中發(fā)現(xiàn)此區(qū)中的突變，該突變導(dǎo)致變異HBV的誤診，即使采用最新的市 售血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。因此，需要開發(fā)可靠的診斷測(cè)試來(lái)檢測(cè)病毒血樣品中的HBV，以防 止該病毒通過(guò)血液和血漿衍生品或通過(guò)個(gè)人密切接觸傳播。
嘗試用兔-兔和兔-小鼠雜交瘤產(chǎn)生免疫反應(yīng)性提高的單克隆抗體。參見例如，美 國(guó)專利號(hào)4,977,081; 4,859,595; 5,472,868; 5,675,063; Spieker-Polet等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:9348-9352。由于以下幾個(gè)原因，優(yōu)選實(shí)驗(yàn)兔單克隆抗體。首先，兔可識(shí)別在小鼠或大鼠中沒(méi)有免疫原性的抗原和表位，小鼠和大鼠是常用于產(chǎn)生單
克隆抗體的兩個(gè)物種。此外，兔抗體的親和力通常很高。美國(guó)專利號(hào)4,859,595描述 了用兔-兔融合蛋白產(chǎn)生HBsAg的兔單克隆抗體。
然而，仍然需要采用對(duì)各種HBsAg突變體免疫反應(yīng)性較寬的單克隆抗體的改進(jìn) 免疫試驗(yàn)。非常需要用于準(zhǔn)確和有效測(cè)定HBV感染的試劑容易獲得。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了用于簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和有效地診斷HBV感染的免疫反應(yīng)性高的單克隆 抗體。該抗體由兔雜交瘤產(chǎn)生，對(duì)各種突變的HBV毒株具有免疫反應(yīng)性。因此，采 用兔單克隆抗體的測(cè)定方法更準(zhǔn)確，并且降低了用其它血清學(xué)測(cè)試獲得的假陰性的 數(shù)量。因此，采用該抗體的試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)各種HBV突變體引起的HBV感染，如果 檢測(cè)到感染，可在足夠時(shí)間中適當(dāng)?shù)刂委熢搨€(gè)體，以幫助預(yù)防干損傷和死亡。
因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及能識(shí)別在"a"決定區(qū)中具有突變的HBsAg 突變體的抗-HBV兔單克隆抗體，或其免疫反應(yīng)性片段，如Fab、 F(ab')2、 Fv或sFv 片段。在某些實(shí)施方式中，該抗體能識(shí)別一種以上"a"決定區(qū)中具有突變的HBsAg 突變體。在其它實(shí)施方式中，該抗體也能識(shí)別野生型HBsAg。在又一實(shí)施方式中， HBsAg突變體是突變的sAg，如含有"a"決定區(qū)F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S 或Q129R/M133T的序列的突變體。在其它實(shí)施方式中，該抗體能識(shí)別HBsAg和/或 選自F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S和Q129R/M133T的一種或至少兩種突 變的HBSAg。任何上述抗體均可用兔-兔雜交瘤或兔-小鼠雜交瘤產(chǎn)生。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及雜交瘤99S6(ATCC登錄號(hào)PTA-6015)和 99S9(ATCC登錄號(hào)PTA-6014),以及這些雜交瘤產(chǎn)生的抗體。在其它實(shí)施方式中， 本發(fā)明涉及能識(shí)別與雜交瘤99S6和/或99S9產(chǎn)生的抗體所識(shí)別表位相同的表位的兔 單克隆抗體。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物樣品中HBV表面抗原的方法。該方法 包括
將該生物樣品與上述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的至少一種兔單克隆抗體接觸，該接 觸條件應(yīng)該能使HBV抗原(當(dāng)其存在于生物樣品中時(shí))結(jié)合于該抗體，形成抗體/抗原 復(fù)合物；
檢測(cè)是否存在抗體/抗原復(fù)合物，從而檢測(cè)樣品中是否存在HBV表面抗原。 在上述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述至少一種兔單克隆抗體是雜交瘤99S6或雜交瘤99S9產(chǎn)生的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述至少一種兔單克隆抗體被可檢測(cè)地 標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，該方法還包括使該生物樣品與抗野生型HBsAg或"a"決定 區(qū)中含有突變的HBsAg突變體的另外一種或多種抗體反應(yīng)。所述另外一種或多種抗 體可包括另一種單克隆抗體，如小鼠單克隆抗體。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)HBV感染的免疫診斷測(cè)試試劑盒。該 測(cè)試試劑盒包括
上述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的至少一種兔單克隆抗體，或其免疫反應(yīng)性片段；和 進(jìn)行所述免疫診斷測(cè)試的說(shuō)明書。
在上述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述至少一種兔單克隆抗體是雜交瘤99S6或雜 交瘤99S9產(chǎn)生的抗體。在某些實(shí)施方式中，所述測(cè)試試劑盒還包括抗野生型HBsAg 或"a"決定區(qū)中含有突變的HBsAg突變體的另外一種或多種抗體。所述另外一種或多 種抗體可包括另一種單克隆抗體，如小鼠單克隆抗體。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含上述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的至少一種兔單 克隆抗體或其免疫反應(yīng)性片段的固體支持物。在所述固體支持物的優(yōu)選實(shí)施方式中， 所述至少一種兔單克隆抗體是雜交瘤99S6或雜交瘤99S9產(chǎn)生的抗體。在某些實(shí)施 方式中，該支持物還包含抗野生型HBsAg或"a"決定區(qū)中含有突變的HBsAg突變體 的另外一種或多種抗體。所述另外一種或多種抗體可包括另一種單克隆抗體，如小 鼠單克隆抗體。在其它實(shí)施方式中，所述固體支持物還包括至少兩種內(nèi)部對(duì)照，其 中一種對(duì)照限定了釆用固體支持物的免疫試驗(yàn)中陽(yáng)性結(jié)果的檢測(cè)下限，另一對(duì)照確 定了采用固體支持物的免疫試驗(yàn)中的高度陽(yáng)性結(jié)果。在一些實(shí)施方式中，所述固體 支持物是硝酸纖維素條帶。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)HBV的免疫診斷測(cè)試試劑盒。該測(cè)試 試劑盒包括-
(a) 如上述任一項(xiàng)實(shí)施方式所述的固體支持物；和
(b) 進(jìn)行所述免疫診斷測(cè)試的說(shuō)明書。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物樣品中是否存在HBV表面抗原的方 法。該方法包括
(a) 提供生物樣品；
(b) 提供上述固體支持物；
(c) 將所述生物樣品與所述固體支持物相接觸，該接觸條件應(yīng)該能使HBV表面抗 原(如果存在于生物樣品中)結(jié)合于至少一種兔單克隆抗體，形成抗體/抗原復(fù)合物；和
(d) 檢測(cè)是否存在抗體/抗原復(fù)合物，從而檢測(cè)生物樣品中是否存在HBV表面抗原。
在某些實(shí)施方式中，該方法還包括
(e) 去除未結(jié)合的HBV抗原；
(f) 提供能夠連接于所述抗體/抗原復(fù)合物一種或多種部分；和
(g) 檢測(cè)是否存在一種或多種部分，從而檢測(cè)生物樣品中是否存在HBV表面抗原。
在該方法的其它實(shí)施方式中，所述一種或多種部分包含可檢測(cè)標(biāo)記的HBV抗 體，如能識(shí)別"a"決定區(qū)中含有突變的HBsAg突變體的可檢測(cè)標(biāo)記的兔單克隆抗體， 或其免疫反應(yīng)性片段。可檢測(cè)標(biāo)記可以是酶。此外，所述生物樣品可以來(lái)自人血樣
口
叩o
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及檢測(cè)生物樣品中是否存在抗HBsAg抗體的方 法。該方法包括
(a) 提供上述固體支持物；
(b) 將該固體支持物與一種或多種HBsAg相接觸，該接觸條件應(yīng)該能使一種或多 種HBsAg結(jié)合于至少一種兔單克隆抗體，形成抗體/抗原復(fù)合物；
(d) 將包含抗體/抗原復(fù)合物的固體支持物與生物樣品相接觸，該接觸條件應(yīng)該能 使抗HBsAg抗體(如果存在于生物樣品中)結(jié)合于抗體/抗原復(fù)合物，形成抗體/抗原/ 抗體復(fù)合物；和
(e) 檢測(cè)是否存在抗體/抗原/抗體復(fù)合物，從而檢測(cè)生物樣品中是否存在抗 HBsAg抗體。
在其它實(shí)施方式中，該方法還包括
(f) 去除未結(jié)合抗體；
(g) 提供能夠連接于該抗體/抗原/抗體復(fù)合物的一種或多種部分，如包含可檢測(cè)標(biāo) 記的免疫球蛋白分子的一種或多種部分；和
(h) 檢測(cè)是否存在一種或多種部分，從而檢測(cè)該生物樣品中是否存在抗HBsAg 抗體。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備基本不含HBV的血液供給品，包括全血、
血小板、血漿或血清的方法。該方法包括
(a)用上述方法篩選收集的血液樣品中的全血、血小板、血漿或血清等份；(b) 清除檢測(cè)到有HBV抗原的任何樣品；和
(c) 混合沒(méi)有檢測(cè)到HBV抗原的樣品，以提供基本不含HBV的血液供給品。 在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備基本不含HBV的血液供給品，包括全血、
血小板、血漿或血清的方法。該方法包括
(a) 用上述方法篩選收集的血液樣品中的全血、血小板、血漿或血清等份；
(b) 清除檢測(cè)到有抗HBsAg抗體的任何樣品；禾口
(c) 混合沒(méi)有檢測(cè)到有抗HBsAg抗體的樣品，以提供基本不含HBV的血液供給
[=1
PR o
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在移植前篩選捐贈(zèng)的組織或器官的方法，以提
供基本不含HBV的組織或器官。該方法包括
(a) 用上述方法篩選組織或器官中的樣品；
(b) 清除檢測(cè)到有HBV抗原的組織或器官，以提供基本不含HBV的組織或器官。 在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在移植前篩選捐贈(zèng)的組織或器官，以提供基本
不含HBV的組織或器官的方法。該方法包括
(a) 用上述方法篩選組織或器官中的樣品；
(b) 清除檢測(cè)到有抗HBsAg抗體的組織或器官，以提供基本不含HBV的組織或 器官。
在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備抗-HBV兔單克隆抗體的方法。該方法包括
(a) 用"a"決定區(qū)中含有突變的HBsAg突變體免疫兔；
(b) 將產(chǎn)生抗HBsAg突變體的抗體的兔細(xì)胞與永生化細(xì)胞系的細(xì)胞融合產(chǎn)生雜 交瘤；
(C)選擇雜交瘤；
(d) 培養(yǎng)所選擇的雜交瘤；和
(e) 收集培養(yǎng)的雜交瘤分泌的抗體。
在某些實(shí)施方式中，所述免疫步驟包括用一種以上HBsAg突變體免疫兔。在某 些實(shí)施方式中，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是兔脾細(xì)胞。脾細(xì)胞可與永生化兔細(xì)胞系如兔漿細(xì) 胞瘤的細(xì)胞融合，產(chǎn)生兔-兔雜交瘤；或與永生化小鼠細(xì)胞系融合，產(chǎn)生兔-小鼠雜交瘤。
在上述方法的某些實(shí)施方式中，所述HBsAg突變體是突變的sAg，如含有 F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S或Q129R/M133T的"a"決定區(qū)序列的突變體。 在其它實(shí)施方式中，所述HBsAg突變體包括F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S或Q129R/M133T。在其它實(shí)施方式中，用"a"決定區(qū)中含有不同突變的至少兩種 HBsAg突變體，如選自F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S或Q129R/M133T 的至少兩種HBsAg突變體免疫兔。在其它實(shí)施方式中，用HBsAg突變體F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S和Q129R/M133T免疫兔。在其它實(shí)施方式中，再用 野生型HBsAg免疫兔。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及上述方法產(chǎn)生的抗-HBV兔單克隆抗體。在其它 實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及制備兔-兔雜交瘤的方法。該方法包括
(a) 用"a"決定區(qū)中含有突變的HBsAg突變體免疫兔；
(b) 將產(chǎn)生抗HBsAg突變體的抗體的兔脾細(xì)胞與兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合；
(c) 選擇分泌抗體的細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及編碼兔單克隆抗體或其免疫反應(yīng)性片段如上述 Fab、 F(ab')2、 Fv或sFv片段的多核苷酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文公開內(nèi)容不難理解本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方式。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1顯示了 HBV表面抗原的示意圖，它說(shuō)明了該蛋白的高度構(gòu)象結(jié)構(gòu)(下圖， 實(shí)線)和"a"決定簇周圍的氨基酸序列(SEQ ID NO:l)(aa 121-147，上圖，圓圈)。箭頭 表示各種已知HBsAg變體的位置和取代。
圖2A和2B(SEQ ED NOS:2和3)分別顯示了 sAg野生型adw和ayw抗原的氨 基酸序列。
圖3A-3D顯示了 99S6(圖3B)和99S9(圖3D)產(chǎn)生的兔單克隆抗體的免疫反應(yīng)性， 作比較的是抗上述HBV突變體的小鼠抗體mMAbl(圖3C)和mMAb2(圖3A)。
發(fā)明詳述
除非另有說(shuō)明，實(shí)施本發(fā)明將采用病毒學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、重組DNA技術(shù)和 免疫學(xué)各領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法。文獻(xiàn)中充分解釋了這些技術(shù)。參見例如，《基
礎(chǔ)病毒學(xué)》(Fundamental Virology),第三版，第I和II巻(B.N. Fields和D.M. Knipe 編)；《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》(Handbook of Experimental Immunology),第I-IV巻(D.M. Weir 和CC. Blackwell編，Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton，《蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)和分子特性》(Proteins: Structures and Molecular Properties)(W.H. Freeman禾口 Company, 1993); A,L. Lehninger，《生斗勿化學(xué)》(Biochemistry)(Worth Publishers, Inc.,當(dāng)前加入)；Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(第二版，1989);《酶學(xué)方法》(Methods In Enzymology)(S. Colowick和N. Kaplan 編，Academic Press, Inc.)。
通篇采用以下氨基酸縮寫
丙氨酸Ala (A) 天冬酰胺Asn(N) 半胱氨酸Cys(C) 谷氨酸Glu(E) 組氨酸His(H) 亮氨酸Leu(L) 甲硫氨酸Met(M) 脯氨酸Pro(P) 蘇氨酸Thr(T) 酪氨酸Tyr(Y)
精氨酸Arg(R) 天冬氨酸Asp(D) 谷胺酰胺Gln(Q) 甘氨酸GIy(G) 異亮氨酸He (I) 賴氨酸Lys(K) 苯丙氨酸Phe(F) 絲氨酸Ser(S) 色氨酸Trp(W) 纈氨酸Val(V)
I.定義
在表述本發(fā)明的過(guò)程中，采用以下術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)的定義如下。
必須注意，本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和 "這種"包括復(fù)數(shù)含義，除非內(nèi)容中明確指出不是這樣。因此，例如，提到"一種兔 單克隆抗體"包括兩種或多種這樣的多肽的混合物等。
術(shù)語(yǔ)"多肽"和"蛋白質(zhì)"指氨基酸殘基的聚合物，不受產(chǎn)物最小產(chǎn)毒的限制。因此， 此定義包括肽、寡肽、二聚體、多聚體等。此定義包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)和其片段。該術(shù) 語(yǔ)也包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。而且，為了本發(fā)明 目的，"多肽"指包含對(duì)天然序列的修飾，如缺失、加入和取代(通常在性質(zhì)上保守)的 蛋白質(zhì)，只要該蛋白質(zhì)維持所需活性。這些修飾可以是有意修飾，如定位誘變；或 者可以是偶然修飾，如產(chǎn)生該蛋白的宿主突變或由于PCR擴(kuò)增出錯(cuò)。
術(shù)語(yǔ)"抗原"指天然、重組或合成的多肽，它包括能夠識(shí)別抗體的一個(gè)或多個(gè)表 位。所研究的抗原不需要包括參比分子的全長(zhǎng)氨基酸序列，可僅包括產(chǎn)生免疫反應(yīng) 所必需的那段分子(即當(dāng)該抗原用于產(chǎn)生抗體時(shí))或能與感興趣的HBV抗體發(fā)生反應(yīng) 的那段分子(即當(dāng)在試驗(yàn)中檢測(cè)該抗原時(shí))。因此，僅需要存在參比分子的一個(gè)或幾個(gè) 表位。而且，抗原可包括全長(zhǎng)參比分子或參比分子的片段與另一種蛋白如另一種HBV
14抗原和/或不破壞HBV抗原反應(yīng)活性的蛋白的融合蛋白。不難明了，該抗原因此可包 括參比分子的全長(zhǎng)序列、片段、截短和部分序列、以及其類似物、突變蛋白和前體 形式。該術(shù)語(yǔ)也包括參比序列的缺失、加入和取代，只要該抗原保持刺激抗體產(chǎn)生
和/或與HBV抗體反應(yīng)的能力。
在這個(gè)方面，在特定HBV毒株中分離物之間存在天然變異。因此，該術(shù)語(yǔ)旨在 包括這些變異，具體是與參比抗原抗原相比氨基酸組成的不同之處不多于約20數(shù)量 %、更優(yōu)選不多于約10-15數(shù)量％、最優(yōu)選不多于約5數(shù)量％的抗原。因此，參比多 肽的定義也包括氨基酸序列與參比分子基本相同，但具有基本不影響該抗原的抗體 結(jié)合能力的少量氨基酸取代的蛋白質(zhì)。
"衍生自"HBV毒株或分離物的抗原指包含序列參比HBV基因組編碼抗原區(qū)域 的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域或部分的序列的抗原。該抗原一般由包括表位的區(qū)域的區(qū)域或部 分組成，通常具有基本與參比多肽同源的氨基酸序列，如下所述。因此，用術(shù)語(yǔ)"衍 生自"確定分子的初始來(lái)源，但不旨在限制該分子的制備方法，所述制備方法可以是
(例如)化學(xué)合成或重組方法。
術(shù)語(yǔ)"類似物"和"突變蛋白"指在本文所述試驗(yàn)中保持所需活性如免疫反應(yīng)性的 參比分子的生物活性衍生物。通常，術(shù)語(yǔ)"類似物"指具有相對(duì)于天然分子含有一個(gè)或 多個(gè)氨基酸加入、取代(通常是性質(zhì)上保守的取代)和/或缺失的天然多肽序列和結(jié)構(gòu) 的化合物(只要該修飾不破壞免疫原性活性)以及與參比分子"基本同源"的化合物，如 下所述。已知各種分離物之間有許多保守區(qū)和可變區(qū)，通常，衍生自這些區(qū)域的表 位的氨基酸序列在對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)具有高度序列同源性，如氨基酸序列同源 性大于50%，通常大于60%-70%。術(shù)語(yǔ)"突變蛋白"指含有一種或多種肽模擬物(如" 類肽")的肽。優(yōu)選地，該類似物或突變蛋白至少免疫反應(yīng)性與天然分子相同。本領(lǐng)域
已知制備多肽類似物和突變蛋白的方法，以下作進(jìn)一步描述。
術(shù)語(yǔ)"類似物"和"突變蛋白"也包括對(duì)參比分子進(jìn)行的有目的的突變。尤其優(yōu)選的
類似物包括特性上保守的取代，即其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族中發(fā)生的取代。具體說(shuō)， 氨基酸通常分為四個(gè)家族(l)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性一賴氨酸、精氨酸、 組氨酸；(3)非極性一丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電的極性一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有時(shí)被分類為芳族氨基酸。 例如，可合理地預(yù)測(cè)，分別用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸，用谷氨酸取代天冬氨 酸，用絲氨酸取代蘇氨酸，或者類似地用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸保守取代氨基酸，這些取代對(duì)生物學(xué)活性沒(méi)有大影響。例如，感興趣的抗原可包括多達(dá)約5-10個(gè)保守性或
非保守性氨基酸取代，或甚至多達(dá)約15-25、 50或75個(gè)(或5-75個(gè))保守性或非保守 性氨基酸取代，只要該分子的所需功能保持不變。參照本領(lǐng)域熟知的Hopp/Woods 和Kyte-Doolittle曲線，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定可耐受改變的感興趣分子的區(qū)域。
"抗原片段"指僅由完整的全長(zhǎng)抗原多肽序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成的抗原。該片 段可包括天然多肽的C-末端缺失、N末端缺失和/或內(nèi)部缺失。"免疫原性片段"指包 含一個(gè)或多個(gè)表位，從而能引發(fā)一種或多種本文所述免疫應(yīng)答的多肽片段。具體的 HBV蛋白的"免疫原性片段"通常包括能限定表位的全長(zhǎng)分子的至少約5-10個(gè)毗連氨 基酸殘基，優(yōu)選全長(zhǎng)分子的至少約15-25個(gè)毗連氨基酸殘基，最優(yōu)選全長(zhǎng)分子的至少 約20-50或更多個(gè)毗連氨基酸殘基，或者5個(gè)氨基酸-全長(zhǎng)序列的毗連氨基酸殘基， 只要待研究片段保持了引發(fā)本文所述免疫應(yīng)答的能力。
"HBsAg"指衍生自各種HBV毒株和分離物的HBV表面抗原。該術(shù)語(yǔ)指包含 HBsAg多肽的基本完整的S結(jié)構(gòu)域(本文稱為"sAg")的表面抗原，及其免疫原性片段。 如果HBsAg的S結(jié)構(gòu)域含有該多肽的天然序列，其N-末端或C-末端區(qū)域或多肽內(nèi) 沒(méi)有或僅有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的小缺失，那么它是"基本完整的"。例如，HBsAg S 結(jié)構(gòu)域可被截短幾個(gè)氨基酸，即至多約3、 5、 7或10個(gè)氨基酸，而不顯著影響其抗 原性。本發(fā)明所用HBsAg抗原通常包括在氨基酸位置124-147(相對(duì)于sAg編號(hào))上發(fā) 現(xiàn)的對(duì)應(yīng)于"a"決定簇的區(qū)域。以下進(jìn)一步描述此區(qū)域。該術(shù)語(yǔ)也指除S結(jié)構(gòu)域外還 包含preS2(以前稱為preS)的抗原，或除S結(jié)構(gòu)域外還包含HBsAg的preS2和preSl 結(jié)構(gòu)域的抗原。Valenzuda等(1982) Nature 298:347-350描述了代表性HBsAg的基因。 也參見Valenzuela等(1979) Nature 280:815-819。
本文所用"突變的"HBsAg分子指野生型HBsAg的類似物，如上所述。為了本發(fā) 明目的，"野生型HBsAg"指來(lái)自ayw和adw亞型的HBsAg。這些類似物可通過(guò)天然 突變事件產(chǎn)生(如在逃避中和突變體的情況下)，或可有目的地建立。代表性突變 HBsAg序列見本文圖1。其它天然產(chǎn)生的突變體是本領(lǐng)域已知的，GenBank中記錄 了這些突變體的核苷酸序列和來(lái)自這些突變體的表面抗原的相應(yīng)氨基酸序列。參見 例如，NCBI登錄號(hào)AY341335(在sAg的"a"決定簇中含有多個(gè)突變的天然產(chǎn)生的表 面突變體)，X59795(來(lái)自ayw亞型的天然產(chǎn)生的突變體)；AF01360和AF013629(來(lái) 自adw亞型的天然產(chǎn)生的突變體)和Zuckerman等，1999 (J. Med Virol. 58:193)。
HBsAg的"免疫原性"序列指包括包含至少一個(gè)表位的氨基酸序列的HBsAg分 子，以致于該分子能夠在合適宿主中刺激產(chǎn)生抗體。"表位"指能與特定B細(xì)胞和/或T細(xì)胞起反應(yīng)，使待研究HBV表位能夠刺激抗體產(chǎn)生的抗原上的位點(diǎn)。該術(shù)語(yǔ)也可
與"抗原決定簇"或"抗原決定位點(diǎn)"互換使用。表位可包含空間構(gòu)象獨(dú)特的3個(gè)或多個(gè) 氨基酸。通常，表位由至少5個(gè)這種氨基酸組成，更通常由至少8-10個(gè)這種氨基酸
或更多氨基酸組成。
可用本領(lǐng)域熟知的任何表位作圖技術(shù)鑒定包含表位的給定多肽區(qū)域。參見例如， 《分子生物學(xué)中的表位作圖法》(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology), 第66巻(GIenn E. Morris編，1996) Humana Press, Totowa， New Jersey。
例如，可通過(guò)(例如)以下方法測(cè)定線性表位在固體支持物上同時(shí)合成大量肽，這些 肽對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)分子的部分，在這些肽仍然連接于支持物的情況下使這些肽與抗體
反應(yīng)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,708,871; Geysen等，(1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81:3998-4002; Geysen等，(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:178-182; Geysen等，(1986) Molec. Immunol. 23:709-715。類似地，通過(guò)(例如)x-射線晶體衍射和2-維核磁共振測(cè)定氨基酸的空間構(gòu)象，從而不難鑒定構(gòu)象表位。參 見例如，《表位作圖法》(Epitope Mapping Protocols),同上。也可用標(biāo)準(zhǔn)的抗原性和 親水性圖鑒定蛋白質(zhì)的抗原區(qū)，如用(例如)購(gòu)自O(shè)xford Molecular Group的Omiga 1.0 版軟件程序計(jì)算。此計(jì)算機(jī)程序采用Hopp/Woods法(H叩p等，Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828)測(cè)定抗原性特征，并采用Kyte-Doolittle技術(shù)(Kyte等，J. Mol. Biol, (1982) 157:105-132)作親水性圖。
"免疫原性組合物"是包含至少一種免疫原性多肽(如HBsAg抗原或抗體)的組合物。
"基本上純化的"通常指分離物質(zhì)(化合物、多核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、多肽組合 物)，使該物質(zhì)構(gòu)成它存在的樣品的大部分。樣品中基本上純化的組分一般占樣品的 50%，優(yōu)選80%-85%，更優(yōu)選90-95%。純化感興趣的多核苷酸和多肽的技術(shù)是本領(lǐng) 域熟知的，包括(例如)離子交換色譜、親和色譜和根據(jù)密度沉降。
提到多肽時(shí)，"分離"指所示分子與天然情況下發(fā)現(xiàn)該分子的完整生物體分離， 或者基本不含相同類型的其它生物大分子。提到多核苷酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)"分離"是指核酸分 子完全或部分缺少通常在天然情況下與其相連的序列；或者象天然存在時(shí)那樣只是 連接了異源序列的序列；或者與染色體分離的分子。
"等效抗原決定簇"指來(lái)自HBV的不同分離物或毒株的抗原決定簇，由于序列變 異抗原決定簇不必相同，但其出現(xiàn)在待研究HBV序列的等效位置中。通常，在比對(duì) 兩個(gè)序列時(shí)，等效抗原決定簇的氨基酸序列具有高度序列同源性，如氨基酸序列同源性大于30%，通常大于40%，如大于60%，甚至大于80-90%同源性。
"同源性"指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽部分的相同性百分?jǐn)?shù)。當(dāng)在指定的分子長(zhǎng) 度上序列相同性至少約50%、優(yōu)選至少約75%、更優(yōu)選至少約80%-85%、優(yōu)選至少 約90%、最優(yōu)選至少約95%-98%時(shí)，稱兩個(gè)核酸或兩個(gè)多肽序列互相"基本同源"。 本文所用基本同源也指與特定序列完全相同的序列。
通常，"相同性"指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列之間準(zhǔn)確的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸對(duì)應(yīng)?？赏ㄟ^(guò)比對(duì)序列、計(jì)數(shù)兩條比對(duì)序列之間匹配的準(zhǔn)確數(shù)量、除以參比 序列的長(zhǎng)度、將結(jié)果乘以100的方法來(lái)直接比較兩個(gè)分子(參比序列和與參比序列的 相同性％未知的序列)之間的序列信息，從而確定相同性百分?jǐn)?shù)?？捎萌菀撰@得的計(jì) 算機(jī)程序輔助分析，如ALIGN ，Dayhoff，M.O.《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(Atlas of Protein Sequence and Structure) M.O. Dayhoff編，增干U 5. 3:353-358， National biomedical Research Foundation, Washington, DC，該程序改編了 Smith禾Q Waterman的用于肽 分析的局部同源性算法(Advances in Appl. Math. 2:482-489， 1981)。測(cè)定核苷酸序列 相同性的程序可來(lái)自Wisconsin Sequence Analysis Package,第8版(獲自Genetics Computer Group, Madison, WI)，例如BESTFIT、 FASTA和GAP程序，這些程序也 依賴Smith禾n Waterman算法。采用生產(chǎn)商推薦和上述Wisconsin Sequence Analysis Package描述的默認(rèn)參數(shù)，不難使用這些程序。例如，可用Smith和Waterman的同 源性算法(默認(rèn)評(píng)分表和六個(gè)核苷酸位置的缺口罰分)測(cè)定具體核苷酸序列與參比序 列的相同性百分?jǐn)?shù)。
在本發(fā)明內(nèi)容中建立相同性百分?jǐn)?shù)的另一方法是采用著作權(quán)屬于University of Edinburgh、由John F. Collins禾口 Shane S. Sturrok開發(fā)并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View, CA)分銷的MPSRCH程序包?？墒褂么塑浖械腟mith-Waterman算法，其 中評(píng)分表采用默認(rèn)參數(shù)(例如，缺口開放罰12分，缺口延伸罰l分，缺口6分)。從 產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可以看出，"匹配"值反映了"序列相同性"。計(jì)算序列之間相同性或相似性 百分?jǐn)?shù)的其它合適程序通常是本領(lǐng)域已知的，例如，另一比對(duì)程序是BLAST(采用默 認(rèn)參數(shù))。例如，BLASTN和BLASTP可采用以下默認(rèn)參數(shù)遺傳密碼=標(biāo)準(zhǔn)；過(guò)濾= 無(wú)；鏈=雙鏈；截止值=60;期望值=10;矩陣BLOSUM62;描述=50個(gè)序列；分選 =HIGH SCORE;數(shù)據(jù)庫(kù)=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯 +Swiss蛋白+Spupdate+PIR。不難獲得這些程序的詳情。
或者，可通過(guò)在同源區(qū)之間形成穩(wěn)定雙鏈體的條件下雜交多核苷酸，然后用單 鏈特異性核酸酶消化，測(cè)定消化片段的大小，從而確定同源性?？捎肧outhern雜交
18實(shí)驗(yàn)在(例如)嚴(yán)謹(jǐn)條件，如為具體系統(tǒng)定義的條件下鑒定基本同源的DNA序列。本
領(lǐng)域技術(shù)人員能夠定義合適的雜交條件。參見例如，Sambrook等，同上；DNA Cloning, 同上；Nucleic Acid Hybridization ， 同上。
描述核酸分子時(shí)本文所述"重組"指基因組、cDNA、病毒、半合成或合成來(lái)源的 多核苷酸，由于其來(lái)源和操作不連接于它在天然情況下連接的多核苷酸的整體或一 部分。提到蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)"重組"指通過(guò)表達(dá)重組多核苷酸產(chǎn)生的多肽。通常， 感興趣基因被克隆，然后在轉(zhuǎn)化的生物體中表達(dá)，如以下所述。宿主生物體在表達(dá) 條件下表達(dá)外來(lái)基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
"抗體"指"識(shí)別"(即特異性結(jié)合)于抗原中存在的感興趣表位的分子。"特異性結(jié)合 "指該抗體以"鎖鑰"型相互作用與表位相互作用，形成抗原和抗體復(fù)合物，這與非特 異性結(jié)合相反，非特異性結(jié)合可能在抗體與(例如)包含抗體能與之反應(yīng)的受試物質(zhì)的 混合物的組分之間發(fā)生。因此，抗-HBV抗體是特異性結(jié)合于HBV蛋白表位的分子。 本文所用術(shù)語(yǔ)"抗體"包括獲自多克隆和單克隆制備的抗體，以及以下物質(zhì)雜交(嵌 合)抗體分子(參見例如，Winter等，Nature (1991) 349:293-299和美國(guó)專利號(hào) 4,816,567); F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共價(jià)異二聚體，參見例如，Inbar等，Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662和Ehrlich等，Biochem (1980) 19: 4091-4096); 單鏈Fv分子(sFv)(參見例如，Huston等，Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85: 5879-5883); 二聚和三聚抗體片段構(gòu)建物；小抗體(minibody)(參見例如，Pack等， Biochem (1992) li:1579國(guó)1584; Cumber等，J Immunology (1992) 149B: 120-126);人 源化抗體分子(參見例如，Riechmann等，Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan等， Science (1988) 239:1534-1536和1994年9月21日公開的英國(guó)專利出版物GB 2,276,169);以及獲自這些分子的任何功能片段，其中這些片段保持了母體抗體分子 的免疫結(jié)合特性。
本文所用術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指具有均一的抗體群體的抗體組成。該術(shù)語(yǔ)不限制 抗體的種類或來(lái)源，也不旨在限制制備抗體的方式。該術(shù)語(yǔ)包括整個(gè)免疫球蛋白以 及片段如Fab、 F(ab')2、 Fv和其它片段，以及具有母體單克隆抗體分子的免疫結(jié)合特 性的嵌合和人源化均 一 抗體群體。
本文所用術(shù)語(yǔ)"兔單克隆抗體"指用感興趣的抗原(如突變的HBsAg)免疫兔產(chǎn)生 的上述單克隆抗體?？捎猛?兔雜交瘤(即免疫兔的產(chǎn)抗體細(xì)胞與兔的永生化細(xì)胞的融 合物)、兔-小鼠雜交瘤(即免疫兔的產(chǎn)抗體細(xì)胞與小鼠的永生化細(xì)胞的融合物)等產(chǎn)生" 兔單克隆抗體"，下面有更詳盡的描述。"小鼠單克隆抗體"指用感興趣抗原(如突變的HBsAg)免疫小鼠產(chǎn)生的上述單克 隆抗體。用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法由小鼠-小鼠雜交瘤產(chǎn)生"小鼠單克隆抗體"，下面 有更詳盡的描述。
本文所用"固體支持物"指可連接大分子如抗體、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多核苷酸 的固體表面，如磁性珠、膠乳珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龍、瓊脂糖、聚丙 烯酰胺、二氧化硅顆粒、硝酸纖維素膜等。
"免疫反應(yīng)性"指待研究抗體能與來(lái)自HBV感染個(gè)體的生物樣品中存在的HBV 抗原特異性反應(yīng)。
抗體的"免疫反應(yīng)性片段"是僅由完整抗體序列和結(jié)構(gòu)的一部分組成，并具有上 述免疫反應(yīng)性的分子。這些免疫反應(yīng)性片段的非限制性例子包括能夠顯示出衍生出 它們的母體抗體分子的免疫結(jié)合特性的F(ab')2、 Fv和sFv分子。
"免疫復(fù)合物"指抗體結(jié)合于抗原上的表位時(shí)形成的組合。
本文所用"生物樣品"指分離自對(duì)象的組織或液體樣品，例如但不限于血液、 血漿、血小板、血清、糞便、尿、骨髓、膽汁、脊髓液、淋巴液、腦脊髓液、皮膚 樣品；皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道分泌物；眼淚、唾液、乳汁、血細(xì)胞、器 官、活組織檢查樣品，以及體外細(xì)胞培養(yǎng)組分的樣品，包括但不限于細(xì)胞和組織
在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)物如重組細(xì)胞，和細(xì)胞組分。上面詳述的樣品不必 是直接獲自該來(lái)源的形式。例如，在分析前，可臨用前通過(guò)(例如)加熱、離心等處理 樣品。
本文所用術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"和"可檢測(cè)標(biāo)記"指能夠檢測(cè)的分子，其包括但不限于放射 性同位素、熒光劑、半導(dǎo)體納米晶體、化學(xué)發(fā)光劑、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因 子、酶抑制劑、染料、金屬離子、金屬溶膠、配體(如生物素、鏈霉抗生物素蛋白或 半抗原)。術(shù)語(yǔ)"熒光劑"指能夠在可檢測(cè)范圍內(nèi)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)或其部分?？捎糜诒?發(fā)明的標(biāo)記的具體例子包括但不限于辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、熒光素、FITC、羅丹 明、丹?；?、7-羥基香豆素、二甲基吖啶鑰酯(dimethylacridiniumester， DMAE)、得 克薩斯紅、魯米諾、NADPH和a-(3-半乳糖苷酶。
II.實(shí)施本發(fā)明的方式
在詳述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于具體配方或方法參數(shù)，它們當(dāng)然可以 改變。也應(yīng)理解，本文所用術(shù)語(yǔ)只是為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，不旨在限制。 雖然與本文所述方法和材料相似或等效的許多方法和材料可用于實(shí)施本發(fā)明，但本文描述了優(yōu)選的材料和方法。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)HBV感染的試驗(yàn)中，抗突變HBsAg的新型兔單 克隆抗體的免疫反應(yīng)性比常規(guī)小鼠單克隆抗體高得多。本發(fā)明兔單克隆抗體能夠反
應(yīng)的HBsAg突變體范圍比常規(guī)小鼠單克隆抗體寬。而且，本發(fā)明兔單克隆抗體一般 也與野生型HBsAg反應(yīng)。實(shí)際上，在檢測(cè)HBV抗原的存在(可以說(shuō)明HBV感染)中，
一種本發(fā)明兔單克隆抗體與使用多種小鼠單克隆抗體同樣有效。因此，本發(fā)明兔單 克隆抗體降低了采用(例如)小鼠單克隆抗體的試驗(yàn)獲得假陰性結(jié)果的數(shù)量，從而可用
于準(zhǔn)確檢測(cè)HBV感染的診斷方法。本發(fā)明試驗(yàn)也可利用其它抗體如其它小鼠單克隆 抗體來(lái)提供從各種分離物和逃避中和突變體診斷HBV感染的能力。
該方法可用于檢測(cè)人HBV感染，以及檢測(cè)血樣(包括但不限于全血、血清、血 小板和血漿)以及用于移植的組織和器官中的HBV感染，尤其是檢測(cè)HBV抗原或 HBV抗體的存在。因此，該方法可用于診斷對(duì)象如人對(duì)象的HBV感染，以及檢測(cè) 捐獻(xiàn)血樣的HBV污染。可篩選個(gè)體捐獻(xiàn)樣品或集合樣品的等份中是否存在HBV。 可在混合之前清除被HBV污染的樣品或集合樣品。以此方式，可提供基本不含HBV 污染的血液供給品。類似地，也可篩選用于移植的組織和器官的樣品，以去除污染 樣品。
為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面提供了關(guān)于本發(fā)明所用HBV抗原、抗體和診斷方 法的更詳細(xì)討論。
HBV表面抗原
乙肝表面抗原由共享羧基端序列的以大小分類的三種蛋白質(zhì)組成。這些蛋白質(zhì) 包括大(L， preS2結(jié)構(gòu)域)、中(M， preSl結(jié)構(gòu)域)和小(S, sAg結(jié)構(gòu)域)蛋白。在從感 染患者血清中回收的呈42nm球狀物的感染性毒粒(常常稱為Dane顆粒)中發(fā)現(xiàn)了所 有三種蛋白質(zhì)，。血清樣品也含有平均為22nm的空球形顆粒，它主要含有S類蛋白 (sAg)。僅用編碼sAg蛋白的DNA轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系釋放類似于感染細(xì)胞釋放 的20nm空球。而且，用相同基因轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞形成類似球狀物，發(fā)現(xiàn)它的免疫 原性與來(lái)自感染細(xì)胞的22 nm球狀物相同。參見例如，"HBV疫苗-從實(shí)驗(yàn)室到許可 使用案例石開究"(HBV vaccine-from the laboratory to license: a case study), Mackett， M.禾口 Williamson, J.D.，《人類疫苗和疫苗接種》(Human Vaccine and Vaccination), 159-176頁(yè)，其中討論了HBV結(jié)構(gòu)；美國(guó)專利號(hào)4,722,840、 5，098，704、 5,324,513、 5,965,140， Beames等，J. Virol. (1995) 69:6833-6838， Birnbaum等，J. Virol. (1990)64:3319-3330， Zhou等，J. Virol. (1991) 65:5457-5464，其中描述了各種HBV顆粒的
重組生產(chǎn)。
因此，如上所述，用于產(chǎn)生本發(fā)明兔單克隆抗體的HBsAg可包括sAg、 preSl 禾口/或preS2的免疫原性區(qū)，以及上組的任何組合如sAg/preSl、 sAg/preS2和 sAg/preSl/preS2的免疫原性區(qū)。任選地，HBsAg多肽可包括sAg、 preSl或preS2多 肽中的一種以上。此外，sAg、 preSl和preS2多肽可衍生自HBV的相同或不同分離 物。提供的這些多肽也可以是融合蛋白或分離的多肽。已知來(lái)自幾百種不同HBV分 離物的HBsAg序列，這些序列不難獲自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。
用于本發(fā)明的優(yōu)選HBsAg至少包含HBV"a"決定區(qū)(氨基酸124-147，相對(duì)于sAg 編號(hào))的氨基酸序列。此區(qū)域的代表性野生型序列是 CTTPAQGNSMFPSCCCTKPSDGNC (SEQ ID NO : 4 ， adw 野生型)； CMTTAQGTSMYPSCCCTKPSDGNC (SEQ ID NO: 5， ayw野生型)。在大量HBV逃 避疫苗中和者中發(fā)現(xiàn)sAg的此區(qū)域中有突變。關(guān)于大量HBsAg變異的描述可參見 Ashton-RichardtPG， Murray K.( 1989)《乙肝病毒表面抗原的突變體并定義免疫顯性 "a"區(qū)土或中一些抗原必要?dú)埢?Mutants of the hepatitis B virus surface antigen and define some antigenically essential residues in the immunodominant "a" region). J. Medical Virology 29: 196-203; Norder H. Courouce A —M， Magnius L (1992)《四種 主要亞型中乙肝病毒血清型變異的分子基礎(chǔ)》(Molecular basis of the hepatitis B virus serotype variation within the four major subtype). J. General Virology 73: 3141-3145; Carman WF ， Zanetti AR等(1990)，《疫苗-誘導(dǎo)的乙肝病毒逃避中和突變體》 (Vaccine-induced escape mutant of hepatitis B virus). Lancet 336: 325-329; Fujii H. MoriyamaK等，《乙肝病毒的免疫逃避中和突變體HBs抗原中的GIy 145Arg取代》 (Gly 145 to Arg substitution in HBs antigen of immune escape mutant of hepatitis B virus). Biochem. BiophysResComm 184: 1152-1157; Carman,W.乙肝病毒的疫苗-相關(guān)型突 變體(Vaccine-associated mutants of hepatitis B virus). 《病毒型肝炎禾口肝病》(Viral Hepatitis and Liver Disease)(1945) 243-247頁(yè)，K. Nishioka， H. Suzuki, S. Mishiro T. Oda 編)
因此，此區(qū)域中包含突變的HBsAg尤其可用于本發(fā)明。此區(qū)域的代表性突變體 包括F134A、 F134S、 G145R、 S143L、 P142S和Q129R/M133T。在各突變名稱中， 數(shù)字表示取代氨基酸的位置，數(shù)字之前的字母表示野生型序列中該位置上的氨基酸， 數(shù)字之后的字母表示突變體中該位置上的氨基酸。這些突變體僅僅是代表性的，應(yīng)
22理解，存在大量其它天然產(chǎn)生突變體，這些突變體可用于本發(fā)明。此外，"a"決定區(qū) 中有突變的合成突變體也可用于本發(fā)明。上述"a"決定區(qū)以外的區(qū)域中有突變的變體 也可用于本發(fā)明。例如，在氨基酸位置120上Q取代P的突變體(P120Q)可用作產(chǎn)生 單克隆抗體的抗原。
可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得用于本發(fā)明的抗原。用本領(lǐng)域熟知的重組方法能方便地產(chǎn)生 HBV抗原。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,722,840、 5098,704、 5324,513、 5,965,140和 6,306,625，它們描述了用重組方法產(chǎn)生HBV抗原。例如，可通過(guò)本領(lǐng)域己知方法(如 美國(guó)專利號(hào)4,710,463所述)從感染人血清中存在的Dane顆粒中酚抽提DNA，分離 HBsAgS蛋白編碼序列。然后可用限制性核酸內(nèi)切酶消化分離的DNA。核酸內(nèi)切酶 的選擇部分取決于具體Dane顆粒。例如，adw血清型中某些Dane顆粒的HBV DNA 的HBsAg編碼序列可分離成單個(gè)BamHI片段；ayw血清型中某些Dane顆粒的HBV DNA的HBsAg編碼序列可分離成Hhal片段。相同血清型的Dane顆粒的HBV DNA 也可具有不同的限制性位點(diǎn)圖。
可根據(jù)HBV基因組的已知序列設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，用該探針檢測(cè)基因組文庫(kù)或 cDNA文庫(kù)以尋找編碼用于本發(fā)明的抗原的HBV基因。然后，還可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離 基因，如果需要，可用限制性酶使全長(zhǎng)序列上所需部分的基因突變。參見例如， Sambrook等，同上，它描述了用于獲得和分離DNA的技術(shù)。
最后，可根據(jù)己知序列合成產(chǎn)生編碼HBV抗原的基因?？捎盟杈唧w氨基酸序 列的合適密碼子設(shè)計(jì)核苷酸序列。通常選擇表達(dá)該序列的指定宿主的優(yōu)選密碼子。 通常由用標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸組裝完整序列，并組裝成完整的編碼序列。 參見例如，Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair等，Science (1984) 223:1299; Jay 等，J.Biol. Chem. (1984)259:6311。
多核苷酸可包括各種多肽的編碼序列，這些多肽是天然存在的或可包括天然情 況下不存在的人工序列。如果需要，可用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將這些多核苷酸連接 形成融合蛋白的編碼序列。
一旦制備或分離了編碼序列后，可將這種序列克隆入任何合適的載體或復(fù)制子。 本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多克隆載體，選擇合適的克隆載體是選擇問(wèn)題。合適的載體
包括但不限于當(dāng)連接于合適的控制元件時(shí)能夠復(fù)制的質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘 粒、染色體或病毒。然后將編碼序列置于合適控制元件的控制下，控制元件取決于 用于表達(dá)的系統(tǒng)。因此，可將編碼序列置于啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))
和(任選地)操縱子的控制下，以便將感興趣的DNA序列通過(guò)合適的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列可以含有或不含可以隨后在翻譯后加工中被宿主去除的信號(hào)肽或前
導(dǎo)序列。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,431,739; 4,425,437; 4,338,397。
如果存在，信號(hào)序列可以是與感興趣HBV抗原相連的天然前導(dǎo)物?；蛘?，可存 在可提高分泌效率的異源信號(hào)序列。本領(lǐng)域己知許多代表性前導(dǎo)序列，包括但不限 于酵母a-因子前導(dǎo)物、TPA信號(hào)肽、Ig信號(hào)肽等。本領(lǐng)域已知這些和其它前導(dǎo)序 列的序列。
除了控制序列以外，可能需要加入可以相對(duì)于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)序列表達(dá)的調(diào) 控序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知調(diào)控序列，例子包括由于化學(xué)或物理刺激(包括存在調(diào) 控化合物)引起基因表達(dá)被打開或關(guān)閉的序列。載體中也可存在其它類型的調(diào)控元件。 例如，本文可用增強(qiáng)子元件提高構(gòu)建物的表達(dá)水平。例子包括SV40早期基因增強(qiáng)子 (Dijkema等，(1985) EMBO J. 4:761)、衍生自勞氏肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR) 的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(Gorman等，(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777)和衍生自人 CMV的元件(Boshart等，(1985) Cell ii:521)如CMV內(nèi)含子A序列中包括的元件(美 國(guó)專利號(hào)5,688,688)。表達(dá)盒還可包括在合適宿主細(xì)胞中自動(dòng)復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、 一個(gè) 或多個(gè)可選擇標(biāo)記、 一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)、高拷貝數(shù)和強(qiáng)啟動(dòng)子的可能。
構(gòu)建表達(dá)載體，使具體編碼序列位于具有合適調(diào)控序列的載體中，編碼序列相 對(duì)于控制序列的位置和方向應(yīng)該能使編碼序列在控制序列的"控制"下轉(zhuǎn)錄(即結(jié)合 于控制序列的DNA分子的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄編碼序列)。可能需要對(duì)編碼感興趣分子 的序列加以修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)此目的。例如，在一些情況下，可能需要修飾序列，以使其 以合適方向連接于控制序列；即以維持閱讀框?？刂菩蛄泻推渌{(diào)控序列可在插入 載體前連接于編碼序列?；蛘?，可將編碼序列直接克隆入己含有控制序列和合適的 限制性位點(diǎn)的表達(dá)載體。
可構(gòu)建任何合適的表達(dá)載體，或用其表達(dá)任何形式的本發(fā)明HBsAg。示范性載 體是pCMVII， 一種基于pUC19的設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的克隆載體。 pCMVII包括以下元件人CMVIE增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、人CMV內(nèi)含子A、人組織纖溶 酶原激活物(tPA)前導(dǎo)物、牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸終止子(BGHt)、 ColEl復(fù)制起點(diǎn)和Amp R氨芐青霉素抗性基因。例如，pCMVII-pS2-sAg可用于表達(dá)preS2-sAg。在此載體 中，己將HBsAg的sAg和preS2結(jié)構(gòu)域的編碼序列插入pCMVII中的CMV內(nèi)含子 A和BGHt之間。也可通過(guò)(例如)去除preS2結(jié)構(gòu)域或加入preSl結(jié)構(gòu)域的編碼序列 修飾此載體。以舉例方式提供這些載體，它們不旨在限制本發(fā)明范圍。美國(guó)專利號(hào) 6,740,323中詳細(xì)描述了上述載體。
24如上所述，也可能需要產(chǎn)生感興趣多肽的突變體或類似物?？赏ㄟ^(guò)缺失編碼感 興趣分子的序列的一部分、插入序列和/或取代該序列中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸，來(lái)制 備用于本發(fā)明組成的HBV多肽的突變體或類似物。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知修飾核苷酸
序列的技術(shù)，如定位誘變等。參見例如，Sambrook等，同上；Kunkel， T.A.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:448; Geisselsoder等，(1987) BioTechniques 5:786; Zoller 和Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland等，(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409。
可在以下各種系統(tǒng)中表達(dá)分子包括本領(lǐng)域熟知的昆蟲、哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病 毒和酵母表達(dá)系統(tǒng)。例如，昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟
矢口的，參見例如Summers禾口 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒形式購(gòu)自 Invitrogen， San Diego CA("MaxBac"試劑盒)等。類似地，細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的，參見例如Sambrook等，同上。酵母表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域熟知的， 參見例如《酵母遺傳工程》(Yeast Genetic Engineering)(Barr等編，1989) Butterworths， Londono
用于上述系統(tǒng)的許多合適宿主細(xì)胞也是已知的。例如，本領(lǐng)域己知哺乳動(dòng)物細(xì) 胞系，包括獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的永生化細(xì)胞系，例如但不限于 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人胚 腎細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(如HepG2)、 Madin-Darby牛腎("MDBK")細(xì)胞等。類似地， 細(xì)菌宿主如大腸桿菌(A co//)、枯草芽孢桿菌CBfl"7/^ wMfc)和鏈球菌屬 0^r印tococc^ ^p.)可用于本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建物。用于本發(fā)明的酵母宿主包括釀酒酵母 OSflcc/wramycM cerev/W。e)、白假絲酵母(Qmc/〖o(jì)fa o//j/catw)、麥芽糖假絲酵母(Cfl"cfeto wa/ o犯)、多形漢遜酵母(/fa/wera/a戶0&m0A77/za)、脆弱克魯維酵母菌(《/矽veramj;c^f /rag/"力、乳糖克魯維酵母菌(A7wveromycM /acto)、尸/c/w'a gw'〃en'wcw&7、巴斯德畢 赤酵母(尸/cA/a / aWon》、粟酒裂殖酵母OSc/z/za acctoram;;c^ pom6e)和解脂耶氏酵母 (&mw/a印o(yfea)等。與桿狀病毒表達(dá)載體一起使用的昆蟲細(xì)胞包括埃及伊蚊 (Jedej ae<gy/7"')、 苜蓿夜蟲我(^w/ograpAfl cfl/z》r"/ca)、桑蠶(5ow6jvx "2oh)、 黑月復(fù)果蟲黽 (Z)聰o/ Ma me/。"ogaster)、 草地貪夜蛾彌。(io,ra如g—油)禾口粉紋夜蛾 (7Hc/zop/脂'a m')等。
可用本領(lǐng)域熟知的各種基因遞送技術(shù)將包含感興趣核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定 地整合到宿主細(xì)胞基因組中或維持在合適宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定附加型元件上。參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,399,346。
根據(jù)所選的表達(dá)系統(tǒng)和宿主，通過(guò)在能夠表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)用上述表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生該分子。然后從宿主細(xì)胞中分離表達(dá)蛋白并純化。如果 表達(dá)系統(tǒng)將蛋白質(zhì)分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，可直接從培養(yǎng)基中純化產(chǎn)物。如果沒(méi)有分 泌，可從細(xì)胞裂解物中分離產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠選擇合適的培養(yǎng)條件和回收 方法。
也可用化學(xué)聚合物合成如固相肽合成方法來(lái)合成HBV抗原。本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知這種方法。固相肽合成技術(shù)參見例如，J. M. Stewart和J.D.Young，《固相肽合成》 (Solid Phase Peptide Synthesis),第二版，Pierce Chemical Co.， Rockford， IL(1984)和 G. Barany和R. B. Merrifield，《肽分析、合成、生物學(xué)》(The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology), E. Gross禾口 J. Meienhofer編，第2巻，Academic Press, New York, (1980)， 3-254頁(yè)。
然后用如上所述獲得的HBV抗原產(chǎn)生用于診斷的兔單克隆抗體。
抗-HBV抗體
然后用HBV抗原產(chǎn)生用于診斷和檢測(cè)試驗(yàn)的HBV-特異性多克隆和單克隆抗 體。HBV-特異性多克隆和單克隆抗體特異性結(jié)合于HBV抗原。具體說(shuō)，可通過(guò)將 HBV抗原給予哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、兔、羊或馬，用HBV抗原產(chǎn)生多克隆抗 體。收集免疫動(dòng)物的血清，通過(guò)(例如)用硫酸銨沉淀、然后進(jìn)行色譜(優(yōu)選親和色譜)， 從而純化血漿中的抗體。本領(lǐng)域已知產(chǎn)生和加工多克隆抗血清的技術(shù)。
也不難產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)中存在的抗HBV-特異性表位的兔和小鼠單克隆抗體。為 了產(chǎn)生這些單克隆抗體，通過(guò)(例如)以下方法免疫感興趣的哺乳動(dòng)物如兔或小鼠在 鹽水、優(yōu)選佐劑如弗氏完全佐劑("FCA")中混合或乳化抗原，并通過(guò)胃腸道外(通常是 皮下或肌肉內(nèi))注射該混合物或乳液。通常在2-6周后，用鹽水、優(yōu)選采用弗氏不完 全佐劑("FIA")注射該抗原一次或多次，從而加強(qiáng)免疫動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，用 一種或多種HBsAg突變體，優(yōu)選2-5種不同HBsAg突變體的混合物免疫動(dòng)物。免疫 原中也可包括野生型HBsAg。在優(yōu)選方案中，起初用野生型HBsAg免疫動(dòng)物(優(yōu)選 兔)，然后用一種或多種HBsAg突變體加強(qiáng)免疫。尤其可用作免疫原的是天然存在的 HBsAg突變體，如D3、 D2、 Dl、 Yl、 Y2，如下所述。也可用本領(lǐng)域已知方法通過(guò) 體外免疫產(chǎn)生抗體。參見例如，James等，J. Immunol. Meth. (1987) 100:5-40。
然后獲得免疫動(dòng)物的多克隆抗血清。然而，并非使動(dòng)物放血以提取血清，取出脾臟(和任選的幾個(gè)大淋巴結(jié))并分離成單細(xì)胞。如果需要，可通過(guò)將細(xì)胞懸液施加于 用抗原包被的板或孔，篩選脾細(xì)胞(去除非特異性粘附的細(xì)胞后)。表達(dá)對(duì)抗原特異的 膜結(jié)合免疫球蛋白的B-細(xì)胞能結(jié)合于該板，用其余懸液不能將其沖走。然后，誘導(dǎo) 得到的B細(xì)胞或所有分離的脾細(xì)胞與來(lái)自永生化細(xì)胞系的細(xì)胞(也稱為"融合伙伴") 融合，形成雜交瘤。融合伙伴一般具有能夠用特定培養(yǎng)基選擇得到的雜交瘤的特性。
例如，融合伙伴可以是次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸苷(HAT)-敏感型。
如果需要兔-兔雜交瘤，永生化細(xì)胞系來(lái)自兔。本領(lǐng)域已知這種兔衍生的融合伙
伴，包括例如淋巴來(lái)源的細(xì)胞，如兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞(如Spieker-Polet等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:9348-9352和美國(guó)專利號(hào)5,675,063所述)或美國(guó)專利號(hào) 4,859,595所述的TP-3融合伙伴。如果需要兔-小鼠雜交瘤或大鼠-小鼠或小鼠-小鼠雜 交瘤等，小鼠融合伙伴可衍生自小鼠的永生化細(xì)胞系，如淋巴來(lái)源的細(xì)胞， 一般來(lái) 自小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。本領(lǐng)域已知許多這種細(xì)胞系，可從ATCC獲得。
用本領(lǐng)域己知技術(shù)完成融合。促進(jìn)融合的化學(xué)物質(zhì)通常稱為促融劑。這些物質(zhì) 極度親水，有利于接觸膜。用于細(xì)胞融合的一種尤其優(yōu)選的方法采用聚乙二醇(PEG)。 細(xì)胞融合的另一種方法是電融合。在此方法中，使細(xì)胞接觸改變細(xì)胞膜電位的預(yù)定 放電。用于細(xì)胞融合的其它方法包括橋接-融合法(bridged-infusionmethod)。在此方法 中，使抗原生物素化，使融合伙伴親和素化。當(dāng)細(xì)胞加在一起時(shí)，形成抗原反應(yīng)性B 細(xì)胞-抗原-生物素-親和素-融合伙伴的橋。這能夠?qū)⒖乖?反應(yīng)性細(xì)胞與永生化細(xì)胞特 異性融合。該方法還可采用化學(xué)或電學(xué)方法來(lái)幫助細(xì)胞融合。
融合后.，用選擇性培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)培養(yǎng)細(xì)胞。為了增加抗體分泌，可任 選地采用具有分泌刺激作用的物質(zhì)，如IL-6。參見例如，Liguori等，場(chǎng)6n'ctoma(2001) 20: 189-198?？赏ㄟ^(guò)有限稀釋接種得到的雜交瘤，并測(cè)定其產(chǎn)生的能夠特異性結(jié)合 于免疫抗原(不結(jié)合不相關(guān)抗原)的抗體。然后，在體外(如用組織培養(yǎng)瓶或中空的纖 維反應(yīng)器)或體內(nèi)(如作為小鼠腹水瘤)培養(yǎng)所選擇的分泌單克隆抗體的雜交瘤。例如， 可用RIA或ELISA鑒定產(chǎn)生HBV特異性抗體的雜交瘤，并通過(guò)在半固體瓊脂中克 隆或有限稀釋分離?？捎昧硪惠喓Y選分離產(chǎn)生HBV特異性抗體的克隆。
產(chǎn)生本發(fā)明兔單克隆抗體的另一種技術(shù)是選擇性淋巴細(xì)胞抗體法(SLAM)。此方 法包括在一大群淋巴細(xì)胞中鑒定產(chǎn)生具有所需特異性和功能的抗體的一種淋巴細(xì) 胞。然后，拯救并克隆編碼該抗體特異性的遺傳信息(即免疫球蛋白Vh和VlDNA)。 參見例如，Babcook等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:7843-7848，它描述了此 方法。關(guān)于兔單克隆抗體以及從兔-兔和兔-小鼠融和細(xì)胞制備該單抗的方法的進(jìn)一步
描述可參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,675,063(兔-兔)；4,859,595(兔-兔)；5,472,868(兔-小鼠) 和4,977,081(兔-小鼠)。對(duì)產(chǎn)生常規(guī)小鼠單克隆抗體的描述，參見例如，Kohler和 Milstein， Nature (1975) 256:495-497。
可能需要提供嵌合抗體。可由上述單克隆抗體分子形成由人和非人氨基酸序列 組成的嵌合抗體，以降低它們?cè)谌酥械拿庖咴?Winter等，(1991)Nature 349:293; Lobuglio等，(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:4220; Shaw等，(1987) J Immunol. 138:4534;和Brown等，(1987) Cancer Res. 47:3577; Riechmann等，(1988) Nature 332:323; Verhoeyen等，(1988) Science 239:1534;禾PJones等，(1986) Nature 321:522; 1992年12月23日公開的EP公開號(hào)519,596;和1994年9月21日公開的英國(guó)專利
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