專利名稱：基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試劑盒，尤其涉及一種基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫 吸附試劑盒。
背景技術(shù)：
氯霉素(ChloramphenicoLCAP)，化學(xué)名D-蘇式_(-)-Ν-[α-(羥基甲基)-β-羥 基-對(duì)硝基苯乙基]-2，2-二氯乙酰胺。其屬于廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌均有 良好的抑制作用，因而廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。但在動(dòng)物性食品內(nèi)殘留的CAP對(duì)人體 的健康具有潛在的危害。為此，世界上許多國(guó)家均制定了氯霉素的最高殘留標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格限制 其使用。為了適應(yīng)加入WTO后的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)與挑戰(zhàn)，必須建立起一種具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的快 速檢測(cè)方法。因此開發(fā)出一種簡(jiǎn)單快速，適用于氯霉素殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的痕量分析具有十分 重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前對(duì)氯霉素殘留檢測(cè)的主要方法有色譜法、微生物法等。其中HPLC法、氣相色 譜以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等方法雖然具有靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，但該類方法前處理較復(fù)雜， 所需儀器昂貴，而且需要有熟練的技術(shù)人員，難以在基層工作中普及推廣。微生物檢測(cè)方法 操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，但耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性和專一性低，易漏檢，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，引起誤判，一般 用于定性檢測(cè)簡(jiǎn)便。而免疫分析法具有一定的靈敏度和特異性，而且不需要昂貴的儀器設(shè) 備，為氯霉素提供了一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)用的分析檢測(cè)途徑。適用于大量樣本的快速檢測(cè)，ELISA檢 測(cè)方法勢(shì)必成為檢測(cè)氯霉素殘留的發(fā)展趨勢(shì)。兔單克隆抗體較常規(guī)的鼠單克隆抗體具有更多優(yōu)點(diǎn)。首先，兔子相比于小鼠能識(shí) 別更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾臟較大，可以進(jìn)行更多的融合實(shí)驗(yàn)，使得高通量篩 選融合細(xì)胞成為可能。本試劑盒應(yīng)用雜交瘤技術(shù)及重組抗體技術(shù)得到氯霉素兔單克隆抗 體，開發(fā)出基于兔單克隆抗體的氯霉素間接酶聯(lián)免疫試劑盒，國(guó)內(nèi)外均未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有高特異性、高靈敏度的基于 兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒?；谕脝慰寺】贵w的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒包括盒體和設(shè)在盒體 內(nèi)的96孔酶標(biāo)板以及試劑，96孔酶標(biāo)板內(nèi)包被有氯霉素包被抗原，盒內(nèi)的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀釋濃縮液；(3)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)氯霉素抗體； (5)辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔抗體；(6)底物稀釋液；(7)底物；
(8)底物顯色液；(9)反應(yīng)終止液。所述的氯霉素包被抗原為氯霉素與卵清蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物，氯霉素包被抗原能與抗 氯霉素抗體特異性結(jié)合。所述的洗滌濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉 3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫200. 5 Iml和去離子水。所述的稀釋濃縮液的組成為 氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g和去離子 水。所述的氯霉素抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動(dòng)物，經(jīng)過雜交瘤技術(shù)以及重組抗 體技術(shù)最終得到的。所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺配制液。所述的底物稀 釋液為PH5. 0檸檬酸緩沖液，pH5. 0檸檬酸緩沖液的組成為3 6g檸檬酸、6 9g磷酸氫 二鈉和去離子水。所述的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/ mL、0.625ng/mL或0.3125ng/mL。所述的底物為過氧化氫或過氧化脲。所述的反應(yīng)終止液 為2M硫酸或鹽酸。本發(fā)明在氯霉素檢測(cè)中，IC5tl值為1.06ng/mL，抑制率曲線線性擬合方程y = 39. 705x+48. 946，檢測(cè)范圍在0. 19-6. 05ng/mL之間，最低檢測(cè)限是0. 10ng/mL。試劑盒中抗 氯霉素抗體具有較高的特異性，除了和琥珀氯霉素酸鈉，甲砜霉素，氟甲砜霉素交叉反應(yīng)率 分別為2. 09%, 18. 10%,12. 45%外，和其他喹諾酮類以及磺胺類藥物均無交叉反應(yīng)。本發(fā)明適用于牛奶、蜂蜜等樣品中氯霉素殘留的檢測(cè)。該試劑盒能同時(shí)檢測(cè)大批 量樣本，方便又快速，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控痕量分析具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義；同時(shí)使檢測(cè)成本大大 降低，具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖1是以PBS緩沖液為基質(zhì)的氯霉素單抗間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2是以牛奶為基質(zhì)的氯霉素單抗間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體的實(shí)施方式本發(fā)明基于兔單克隆抗體開發(fā)氯霉素殘留分析的間接酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，該試 劑盒基于免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)，能夠檢測(cè)牛奶及蜂蜜等樣本中的氯霉素的殘留?；谕脝?克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒包括盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板以 及試劑。96孔酶標(biāo)板內(nèi)包被有氯霉素包被抗原，盒內(nèi)的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀 釋濃縮液；(3)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)氯霉素抗體；(5)辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔抗體；(6) 底物稀釋液；(7)底物；(8)底物顯色液；(9)反應(yīng)終止液。所述的氯霉素包被抗原為氯霉素與卵清蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物，氯霉素包被抗原能與抗 氯霉素抗體特異性結(jié)合；所述的洗滌濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫200. 5 Iml和去離子水。所述的稀釋 濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g和去離子水。所述的氯霉素抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動(dòng)物，經(jīng)過雜交瘤 技術(shù)以及重組抗體技術(shù)最終得到的。所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺配制液。 所述的底物稀釋液為PH5. O檸檬酸緩沖液，pH5. O檸檬酸緩沖液的組成為3 6g檸檬酸、 6 9g磷酸氫二鈉和去離子水。所述的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL或0. 3125ng/mL。所述的底物為過氧化氫或過氧化脲。所述的 反應(yīng)終止液為2M硫酸或鹽酸。盒內(nèi)的試劑設(shè)置(1)洗滌濃縮液1瓶，25 35mL/瓶，內(nèi)含有氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫200. 5 1ml，為正常使用濃度的30 40倍；(2)稀釋濃縮液1瓶，25 35mL/瓶，內(nèi)含有氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、 磷酸氫二鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g，為正常使用濃度的30 40倍；(3)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶 液(10ng/mL、5ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. lng/mL、0. 05ng/mL)各 1 瓶，ImL/瓶；(4)氯霉素 抗體1管，25 50 μ 1/管，使用時(shí)2000 3000倍稀釋；(5)辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔抗體 (酶標(biāo)二抗)1管，50-100 μ 1/管，使用時(shí)1000 2000倍稀釋；(6)底物稀釋液1瓶，25 35mL/瓶，內(nèi)含3 6g檸檬酸，6 9g磷酸氫二鈉，為正常使用量的30-40倍；(7)底物1 瓶，1 5mL/瓶，其為過氧化氫或過氧化脲；(8)底物顯色液為四甲基聯(lián)苯胺配制液1瓶， 2 5mL/瓶，配制方法為IOmgTMB溶于2mLDMS0中；(9)反應(yīng)終止液1瓶，15 20mL/瓶， 其為2mol/L硫酸或鹽酸。實(shí)施例1 氯霉素免疫抗原及包被抗原的合成具體操作步驟如下取CAP小分子80mg，溶于1. 5mL無水乙醇中，加入12mL Imo 1/ L鹽酸。加入鋅粉65mg，70°C水浴加熱50min。冷卻后，在4°C，pH 1_2條件下逐滴加入 0. 5mol/L NaNO2數(shù)滴，避光攪拌，直至淀粉碘化鉀試紙呈灰藍(lán)色(溶液I)；稱取BSA 150mg, 溶于12mL磷酸緩沖液(PBS，pH 7.4)中，冷卻。(溶液II)。然后將I液邊攪拌邊緩慢加入 II液中，同時(shí)加入0. 2mol/L的NaOH溶液，使pH始終保持在7_8左右。4°C攪拌12h，反應(yīng) 產(chǎn)物用PBS透析5d。包被抗原OVA-CPFX同法制備，用于包被酶標(biāo)板。氯霉素與載體蛋白的偶聯(lián)原理如下 實(shí)施例2 氯霉素兔單克隆抗體的產(chǎn)生1、兔子的免疫初免將500μ g的免疫抗原與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化后，采用背部皮下 5點(diǎn)注射白兔(ImL/只)；三周后用200yg的免疫抗原與弗氏不完全佐劑混合后同法進(jìn) 行第二次免疫；以后每?jī)芍苊庖咭淮危裁庖? 7次后，血清效價(jià)達(dá)到64000以上時(shí)，用 500 yg的免疫抗原耳緣靜脈注射，4天后頸動(dòng)脈采全血，無菌取脾臟，準(zhǔn)備細(xì)胞融合。
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2、兔單克隆抗體的制備將兔子脾淋巴細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的240E細(xì)胞進(jìn)行融合，融合劑為50%的 PEG。融合后的細(xì)胞用HAT作為選擇性培養(yǎng)基，分裝于加有飼養(yǎng)細(xì)胞的2X20塊96孔細(xì)胞 培養(yǎng)板中，置37°0、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2周后預(yù)檢，發(fā)現(xiàn)背景高，換液。一周后，用間接 ELISA法篩選出陽(yáng)性克隆72個(gè)，將初檢陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。一周 后，采用間接ELISA法、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法篩選出分泌抗體親和力強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 雜交瘤細(xì)胞9-3。將該雜交瘤細(xì)胞在液氮中保存一份，一份用于細(xì)胞裂解，提取mRNA，構(gòu)建 質(zhì)粒，生產(chǎn)抗體。從9-3雜交瘤細(xì)胞中分離mRNA，分別克隆其重鏈和輕鏈基因?；蚪?jīng)酶切 后與質(zhì)粒連接，涂板挑取克隆。大腸桿菌過夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒，重鏈輕鏈質(zhì)粒配對(duì)轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。無菌收集細(xì)胞，離心后取上清。小轉(zhuǎn)后獲得了 6株CAP單抗質(zhì)粒。通過間 接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)、ELISA夾心法確定CAP 9-3H1/L2質(zhì)粒進(jìn)入大轉(zhuǎn)生產(chǎn)。采用Protein A 純化方法純化并收集CAP單克隆抗體，共得IOmL CAP單抗，IgG濃度為1. 23mg/mL。實(shí)施例3 酶標(biāo)板的包被氯霉素包被抗原用pH9. 6,0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(含2. 93g碳酸氫鈉和1. 59g 碳酸鈉，溶于雙蒸水或超純水1L)稀釋成0. 2 μ g/mL，在酶標(biāo)板的每孔加50 μ L，4°C包被12h 或37°C包被2h，傾去包被液體，用PBST洗滌3 5次，拍干，然后在每孔中加入250 μ L 3% 脫脂乳，37°C封閉1小時(shí)，取出后洗滌3 5次，干燥封膜后保存。實(shí)施例4 試劑盒的測(cè)定原理首先將氯霉素與大分子載體蛋白偶聯(lián)制成復(fù)合物作為包被抗原，并使包被抗原結(jié) 合到某種固相載體表面。然后加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)的樣本(含待測(cè)的稀釋樣本)及 氯霉素兔單克隆抗體，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣本與氯霉素的包被抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合氯霉素 抗體，與包被抗原結(jié)合的抗體在加入酶標(biāo)二抗后可以顯現(xiàn)出顏色，與游離的氯霉素小分子 結(jié)合的抗體在洗滌時(shí)被除去。最后加入底物顯色，氯霉素標(biāo)液或樣本中氯霉素含量越多，與 固相抗原結(jié)合的抗體就越少，最后的發(fā)色反應(yīng)減弱，抵制率就越高；反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)， 抑制率減低，因而先根據(jù)已知量氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得抑制率與氯霉素含量之間的半對(duì)數(shù) 關(guān)系作圖即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣本的抑制率來推出待測(cè)樣本的濃度。實(shí)施例5 待測(cè)樣本的前處理A、牛奶檢測(cè)樣品的前處理新鮮牛奶，于4°C下5000r/min離心20min，棄去上層脂肪，取下層清液，加入 0. 3yL 17%的鐵氰化鉀溶液，搖勻后再加入0.3μ L 52%的硫酸鋅溶液，迅速搖勻。5000r/ min離心15min，取上清液用PBS做一定稀釋待用。B、豬尿樣品的前處理豬尿高速離心lOmin，取上層清夜，5倍稀釋，待用。實(shí)施例6 檢測(cè)氯霉素試劑盒的使用(1)試劑配制A、稀釋濃縮液試劑盒中稀釋濃縮液用超純水或蒸餾水稀釋30 40倍后使用。B、洗滌濃縮液試劑盒中洗滌濃縮液用超純水或蒸餾水稀釋30 40倍后使用。C、底物稀釋液試劑盒中底物稀釋液用超純水或蒸餾水稀釋30 40倍后使用。(2)試劑盒操作過程如下
A、試劑盒使用前需要室溫穩(wěn)定半小時(shí)以上。B、取出酶標(biāo)板，加入50 μ L標(biāo)樣或待處理樣本加入到各自孔中，標(biāo)樣和樣本同時(shí) 做2-4個(gè)重復(fù)，然后加入50 μ L稀釋好的氯霉素抗體，37°C孵育1小時(shí)。C、倒出孔中的液體，將微孔板倒置于吸水紙上拍打，以保證完全除去孔內(nèi)的液體， 用300 μ L洗滌液洗滌3 5次，拍干。D、加入稀釋好的酶標(biāo)二抗100 μ 1，反應(yīng)50分鐘。Ε、取底物顯色液200 μ L加于底物緩沖液IOmL中，再加入0. 02%底物過氧化氫，振 蕩均勻后，每孔加入100 μ L以上配制好的顯色溶液，輕微振板，37°C暗處孵育15min。F、加入50 μ L終止液，測(cè)定OD45tl值判定結(jié)果。G、根據(jù)不同濃度標(biāo)樣的OD值計(jì)算抑制率，繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。H、根據(jù)樣本測(cè)定的OD45tl值和稀釋倍數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中氯霉素的測(cè)定 含量ng/mL(即ppb，以ImL液體為Ig計(jì)算)。樣本中氯霉素含量=分析濃度X稀釋倍數(shù)
(ppb) ο實(shí)施例7 =ELISA試劑盒測(cè)定結(jié)果1、ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，相對(duì)的BZiBciX 100%值為縱坐標(biāo)繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲 線(Btl 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為Ong/mL所對(duì)應(yīng)的吸光值；B 其它各濃度所對(duì)應(yīng)的吸光值)。曲線上測(cè) 得達(dá)到50%抑制率時(shí)所對(duì)應(yīng)的氯霉素小分子的濃度值即為靈敏度。從圖1氯霉素ELISA平 均測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線中可知該曲線在0.3125 lOng/mL之間有良好的線性，達(dá)到10%抑制率 氯霉素的濃度值為0. lOng/mL，有較理想的靈敏度，IC5tl值為1. 06ng/mL。2、ELISA 的特異性采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，將與氯霉素結(jié)構(gòu)相似的藥物，如氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉 素、氟甲砜霉素以及一些常見的喹諾酮類藥物和磺胺類藥物與氯霉素兔單克隆抗體同時(shí)加 入到96孔酶標(biāo)板中，以抑制率為縱坐標(biāo)，各樣品濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì) 算各自的IC5tl值。再根據(jù)氯霉素兔單克隆抗體相對(duì)氯霉素小分子的IC5tl值與氯霉素兔單克 隆抗體相對(duì)各種競(jìng)爭(zhēng)物的IC5tl值的比值即得到交叉反應(yīng)率(CR% )。對(duì)其它藥物的交叉率 結(jié)果見表1 表3。CR% = IC50氯霉素/IC5tl其他競(jìng)爭(zhēng)小分子X 100%表1與結(jié)構(gòu)相似藥物的交叉反應(yīng)性 表2與部分喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)性
表3與部分磺胺類藥物交叉反應(yīng)性 3、ELISA的精確度與準(zhǔn)確度測(cè)定添加氯霉素到牛奶中使其濃度為lng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL每個(gè)濃度設(shè) 四個(gè)重復(fù)進(jìn)行測(cè)定；在豬尿中添加氯霉素使其濃度為2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL，每個(gè)濃度設(shè) 四個(gè)重復(fù)分別進(jìn)行測(cè)定。由于用PBS緩沖體系建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線在檢測(cè)牛奶時(shí)回收率不理想，因此本實(shí)驗(yàn) 建立了以牛奶為基質(zhì)，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖2中可以看出，小分子濃度在 0. 5ng/mL-20ng/mL間曲線線性擬合良好，R2 = 0. 9883。用外標(biāo)法對(duì)對(duì)間接ELISA法測(cè)定牛 奶樣品的準(zhǔn)確度進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果(表4)表明，回收率在75.40%-117.00之間，變異系數(shù) 介于5. 57% -16. 39%，滿足檢測(cè)需要。 表4牛奶ELISA準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果 應(yīng)用外標(biāo)法，以PBS緩沖液建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)，對(duì)間接ELISA法測(cè)定豬尿樣品 的準(zhǔn)確度進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果(表5)表明，將豬尿稀釋5倍并添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液使其濃度達(dá)到8ng/mL，4ng/mL，2ng/mL的平均回收率分別為79. 38%,89. 50%和114. 50%，變異系數(shù)分 別為9. 76%，6. 98%，1. 75%?；厥章屎妥儺愊禂?shù)均滿足ELISA檢測(cè)要求。表5豬尿中ELISA準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果 846.35±0.6279.389.76 443.58士0.2589.506.98 242.29±0.0權(quán)利要求
一種基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征在于包括盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板以及試劑，96孔酶標(biāo)板內(nèi)包被有氯霉素包被抗原，盒內(nèi)的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀釋濃縮液；(3)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)氯霉素抗體；(5)辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔抗體；(6)底物稀釋液；(7)底物；(8)底物顯色液；(9)反應(yīng)終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的氯霉素包被抗原為氯霉素與卵清蛋白的偶聯(lián)產(chǎn)物，氯霉素包被抗原能與 抗氯霉素抗體特異性結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的洗滌濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二 鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g、吐溫20 0. 5 Iml和去離子水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的稀釋濃縮液的組成為氯化鈉7 9g、磷酸二氫鉀0. 1 0. 3g、磷酸氫二 鈉3 5g、氯化鉀0. 1 0. 3g和去離子水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的氯霉素抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動(dòng)物，經(jīng)過雜交瘤技術(shù)以 及重組抗體技術(shù)最終得到的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺配制液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的底物稀釋液為PH5. 0檸檬酸緩沖液，pH5. 0檸檬酸緩沖液的組成為3 6g檸檬酸、6 9g磷酸氫二鈉和去離子水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑 盒，其特征在于所述的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、 0. 625ng/mL 或 0. 3125ng/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒， 其特征在于所述的底物為過氧化氫或過氧化脲。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑 盒，其特征在于所述的反應(yīng)終止液為2M硫酸或鹽酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于兔單克隆抗體的氯霉素殘留分析酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。它包括盒體和設(shè)在盒體內(nèi)的96孔酶標(biāo)板以及試劑，96孔酶標(biāo)板內(nèi)包被有氯霉素包被抗原，盒內(nèi)的試劑如下(1)洗滌濃縮液；(2)稀釋濃縮液；(3)氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)氯霉素抗體；(5)辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗兔抗體；(6)底物稀釋液；(7)底物；(8)底物顯色液；(9)反應(yīng)終止液。本發(fā)明適用于牛奶、豬尿等樣本中氯霉素殘留的檢測(cè)。該試劑盒能同時(shí)檢測(cè)大批量樣本，方便又快速，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控痕量分析具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義；同時(shí)使檢測(cè)成本大大降低，具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101915840SQ20101023170
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者倪庚, 劉娜, 鄭曉冬, 陸蕾 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)