破壞，蛋白與 多克隆抗體的結(jié)合能力降低，EGCG結(jié)合到蛋白上，也一定程度上降低了蛋白與IgG的結(jié)合 活力。從效果上分析，0LG經(jīng)120°C高溫處理后與EGCG結(jié)合，其蛋白免疫反應(yīng)性大大降低。
[0031] 0LG熱穩(wěn)定性強(qiáng)，有效降低免疫反應(yīng)性需要長(zhǎng)時(shí)間高溫處理。但當(dāng)牛奶經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí) 間之間的熱處理不僅會(huì)破壞牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，導(dǎo)致牛奶"烹任風(fēng)味"，也對(duì)能源一種浪費(fèi)。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明PLG熱處理后與EGCG結(jié)合能顯著減少PLG免疫反應(yīng)性，其效果優(yōu)于單一的熱 處理。特別是在120°C處理10分鐘時(shí)，EGCG的結(jié)合使其免疫反應(yīng)性大大降低。
[0032] 蛋白質(zhì)熱變性過(guò)程中構(gòu)象變化非常復(fù)雜，外部熱破壞蛋白質(zhì)S級(jí)結(jié)構(gòu)各種力量， 使蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散，但高溫使二硫鍵介導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)形成蛋白質(zhì)聚合物、蛋白 質(zhì)相互將聚集。牛奶是非常復(fù)雜的，高溫，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，蛋白質(zhì)聚合本身將與其他蛋白 質(zhì)聚集，也可能與碳水化合物如交聯(lián)作用。到目前為止，加熱牛奶蛋白過(guò)敏機(jī)制的變化仍是 一個(gè)未解決的復(fù)雜問(wèn)題。
[003引所示，當(dāng)溶液環(huán)境為正常抑時(shí)，即生物體內(nèi)相近抑，即抑=6. 4。0LG與EGCG結(jié)合 后，免疫反應(yīng)性降低，但是降低程度較小。PLG經(jīng)120°C預(yù)熱處理后其結(jié)合產(chǎn)物的免疫反應(yīng) 性大大降低。此時(shí)蛋白的存在形式是二聚體，常W非共價(jià)鍵結(jié)合。
[0034] 由于過(guò)酸或者過(guò)堿的條件下，抗原和抗體的結(jié)合會(huì)受到相應(yīng)的影響，所W本實(shí)驗(yàn) 將相應(yīng)0LG溶液抑調(diào)為對(duì)應(yīng)的抑值，W減小對(duì)ELISA反應(yīng)本身的影響。
[0035] 當(dāng)溶液環(huán)境抑為2時(shí)，常溫結(jié)合產(chǎn)物與0LG與抗體結(jié)合能力相差不多，可能是 強(qiáng)酸影響了抗原與抗體的結(jié)合，從而使得其兩者結(jié)果相似。但是經(jīng)120°C高溫預(yù)處理后的 0LG與EGCG結(jié)合產(chǎn)物的免疫反應(yīng)性大大降低，可能是高溫使蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化。此時(shí)蛋 白的存在形式為單體，可能使更多結(jié)合位點(diǎn)暴露出來(lái)。因此其降敏效果較好。
[0036] 由圖3所示，當(dāng)溶液環(huán)境抑為4. 5時(shí)，蛋白質(zhì)二聚體四聚化形成八聚體，常溫結(jié)合 產(chǎn)物比PLG與抗體結(jié)合能力好，說(shuō)明EGCG與蛋白結(jié)合能有效降低其致敏性。經(jīng)12(TC高 溫預(yù)處理后的PLG與EGCG結(jié)合，其產(chǎn)物更能降低免疫反應(yīng)性。較于生物體能正常近似抑 (6.4)的免疫反應(yīng)結(jié)果，其降敏效果不如前者?？赡苁且?yàn)榘司垠w的結(jié)構(gòu)使得本可和EGCG 結(jié)合的位點(diǎn)沒(méi)有暴露出來(lái)或者由于非共價(jià)鍵的作用使其不能結(jié)合。所W導(dǎo)致其降敏效果要 劣于二聚體的蛋白存在形式。
[0037] 由圖5所示，當(dāng)環(huán)境溶液抑為10時(shí)，二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化形成膨脹的單 體，相應(yīng)抑下常溫結(jié)合產(chǎn)物PLG能略微降低其免疫反應(yīng)性。經(jīng)120°C高溫預(yù)處理后的PLG 與EGCG結(jié)合，其產(chǎn)物更能降低免疫反應(yīng)性。對(duì)于同樣是W單體形式存在的抑為2的溶液 中，較于對(duì)應(yīng)抑環(huán)境中的0LG，抑為10時(shí)，降敏效果更好。可能是因?yàn)?，單體發(fā)生膨脹后， 露出的能與EGCG結(jié)合的表位更多，從而使更多地EGCG與蛋白結(jié)合。
[003引八聚體狀態(tài)下的eLG-EGCG比單體狀態(tài)下(膨脹和非膨脹）得到了更高的抑制率， 目前本實(shí)驗(yàn)無(wú)法解答。由于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化十分復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步研究。
[0039] 3. 3圓二色光譜 在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的膚鍵具有規(guī)則W高度有序排列，在不同的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)不 同的強(qiáng)度和圓二色性產(chǎn)生吸收位置；在一般情況下，在圓二色光譜，a-螺旋結(jié)構(gòu)192有在 波長(zhǎng)為接近陽(yáng)性條帶，有兩個(gè)負(fù)峰帶在222納米和208納米的波長(zhǎng)的附近，運(yùn)在附近的絕對(duì) 值222毫微米0值的波長(zhǎng)更大的蛋白質(zhì)具有更a-螺旋結(jié)構(gòu)；0 -片狀結(jié)構(gòu)在185的波長(zhǎng) 為具有正帶200nm附近，在216納米和鄰近負(fù)頻帶的波長(zhǎng)；0-轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)波有近206納米長(zhǎng)了 積極的波段。因此，通過(guò)測(cè)量蛋白的圓二色光譜可W推斷蛋白的信息的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0040] 樣品的圓二色光譜顯示鄰近222納米和208納米的有明兩個(gè)顯著負(fù)峰，運(yùn)是 典型的a-螺旋結(jié)構(gòu)；185~200納米波長(zhǎng)接近正譜帶，運(yùn)是0-折疊結(jié)構(gòu)的典型特征。 0LG-EGCG在波長(zhǎng)222皿附近的0值比天然的0LG要大，說(shuō)明0LG-EGCG，蛋白中的a 螺旋結(jié)構(gòu)可能有所增加?？傮w而言，與天然PLG圓二色光譜我們提交的線譜數(shù)據(jù)服務(wù)器 DICHR0WEB，由Selcon3算法在樣品上的二級(jí)結(jié)構(gòu)被計(jì)算。如下表所示圓二色性的數(shù)據(jù)。結(jié) 果表明：在結(jié)合蛋白的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)略有增加a-螺旋結(jié)構(gòu)和0-折疊結(jié)構(gòu)稍有不規(guī) 則卷曲略微減少。如圖6-14為PLG-EGCG圓二色光譜圖。
[0041] 表2 :pH=2, 25°C0LG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表3:pH=2，120°CPLG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表4 :pH=4. 5,25°CPLG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表5 :pH=4. 5,120°C0LG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表6:pH=6.4,25°CPLG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表7 :pH=6. 4,120°C0LG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表8:pH=10,25°CPLG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
表9:pH=10，120°CPLG-EGCG圓二色光譜的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果
由圖15和圖16所示，當(dāng)抑為2時(shí)，預(yù)熱處理后，復(fù)合產(chǎn)物比未預(yù)熱處理的復(fù)合產(chǎn)物的a螺旋大量增加，0折疊大量減少，無(wú)規(guī)則卷曲略有增加。
[004引由圖17和圖18所示，當(dāng)抑為4. 5時(shí)，預(yù)熱處理后，復(fù)合產(chǎn)物比未預(yù)熱處理的復(fù)合 產(chǎn)物的a螺旋減少，0折疊增加，無(wú)規(guī)則卷曲略有減少。
[0043] 由圖19和圖20所示，當(dāng)抑為6. 4時(shí)，預(yù)熱處理后，復(fù)合產(chǎn)物比未預(yù)熱處理的復(fù)合 產(chǎn)物的a螺旋略有減少，0折疊減少，無(wú)規(guī)則卷曲略有減少。
[0044] 由圖21和圖22所示，當(dāng)抑為10時(shí)，預(yù)熱處理后，復(fù)合產(chǎn)物比未預(yù)熱處理的復(fù)合 產(chǎn)物的a螺旋大量增加，0折疊大量減少，無(wú)規(guī)則卷曲略有增加。
[0045] 由上述光譜學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，經(jīng)過(guò)預(yù)熱處理后蛋白構(gòu)象發(fā)生巨大改變，且當(dāng) 環(huán)境抑為2或10時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化程度最大?？赡苁且?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)處于單體狀態(tài)，二 級(jí)結(jié)構(gòu)更容易被改變。pH為6. 4時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)的變化最小?？赡苁且?yàn)榇藭r(shí)蛋白質(zhì)處 于二聚體狀態(tài)，二級(jí)結(jié)構(gòu)較不容易被改變。當(dāng)抑為4. 5時(shí)，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化程度也較大?？?能是因?yàn)榇藭r(shí)的八聚體狀態(tài)下，二級(jí)結(jié)構(gòu)因?yàn)槟撤N作用力容易被發(fā)生改變。
[0046] 至此，預(yù)熱處理的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化程度和免疫反應(yīng)性變化程度成反比，可能由于 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化大了W后，蛋白結(jié)構(gòu)趨于緊湊，使原處于內(nèi)部疏水基團(tuán)不外露。由于蛋白在熱 變性過(guò)程中蛋白構(gòu)象變化十分復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步研究。
[0047] 4 結(jié)論 獲得了親和純化的多克隆抗體。
[0048] PLG預(yù)熱處理后與EGCG結(jié)合，其結(jié)合能力增強(qiáng)，蛋白免疫反應(yīng)性的降低程度大 于單一的熱處理蛋白。
[004引在抑為6.4時(shí)，0LG-EGCG免疫反應(yīng)性降低最為明顯，0LG預(yù)熱處理后與EGCG結(jié) 合產(chǎn)物更能降低免疫反應(yīng)性，即變化最大，圓二色光譜顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最小?？赡苁且?為加熱后二聚體的存在形式更能讓0LG與EGCG結(jié)合。
[0050] 在抑為4. 5時(shí)，0LG-EGCG免疫反應(yīng)性降低程度中等，0LG預(yù)熱處理后與EGCG結(jié) 合產(chǎn)物更能降低免疫反應(yīng)性，即變化中等，圓二色光譜顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化中等?？赡苁且?為加熱后八聚體的存在形式能讓0LG與EGCG結(jié)合，但效果中等。
[005。 在抑為2和10時(shí)，0LG-EGCG免疫反應(yīng)性降低程度最小，0LG預(yù)熱處理后與EGCG 結(jié)合產(chǎn)物更能降低免疫反應(yīng)性，但變化最小，圓二色光譜顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)變化最大?？赡苁?因?yàn)榧訜岷蠖垠w的存在形式更能讓0LG與EGCG結(jié)合，效果相對(duì)而言最不理想。
[005引在抑為2~6.4時(shí)，隨著抑的增加，0LG構(gòu)象膨脹，有很多表位點(diǎn)暴露出來(lái)，因 而使得免疫反應(yīng)性逐漸減低。但當(dāng)抑過(guò)高時(shí)，很多表位點(diǎn)暴露出來(lái)的同時(shí)，也有很多表位 點(diǎn)被遮蔽，所W免疫反應(yīng)性不如pH較低時(shí)的產(chǎn)物。
[0053] 總之，本研究建立了一個(gè)主要的奶變應(yīng)原PLG檢測(cè)了一系列的方法來(lái)填補(bǔ)的牛 的檢測(cè)牛奶過(guò)敏原的空白。通過(guò)探索的主要活性成分PLG變化同時(shí)結(jié)合多酪后的免疫反 應(yīng)變化的機(jī)理，將提供新的思路和低過(guò)敏性的乳制品發(fā)展的理論支持。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降低牛乳蛋白i3LG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于在pH2-10條件下，將i3LG 和EGCG結(jié)合。2. 如權(quán)利要求1所述的一種降低牛乳蛋白0LG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于0LG在溫度120°C預(yù)熱后，在pH2-10下將f3LG和EGCG結(jié)合。3. 如權(quán)利要求1所述的一種降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于用pH為2-10的PBS溶劑，將βLG稀釋為1%，再與摩爾比為1 :50的EGCG在25°C下水浴lh。4. 如權(quán)利要求1所述的一種降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于用pH為2-10的PBS溶劑，將βLG稀釋為1%，在120°C下油浴lOmin，再與摩爾比為1 :50的EGCG 在25°C下水浴lh。5. 如權(quán)利要求1或2或3或4所述的一種降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)性的方法，其特 征在于pH為4. 5-6. 4。6. 如權(quán)利要求1或2或3或4所述的一種降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)性的方法，其特 征在于βLG和EGCG結(jié)合后在4°C下用5kDa半透膜對(duì)反應(yīng)后樣品進(jìn)行透析過(guò)夜，除去沒(méi)有 結(jié)合的EGCG。
【專利摘要】一種降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)性的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法為在pH？2-10條件下，將βLG和EGCG結(jié)合。本發(fā)明為降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)提供了一種新的方法，其以更有效，更合理地利用牛奶蛋白，為低過(guò)敏性的乳制品發(fā)展的新思路路和理論支持。
【IPC分類】C07K14/47
【公開(kāi)號(hào)】CN105294850
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510764359
【發(fā)明人】楊章昀, 潘家榮
【申請(qǐng)人】中國(guó)計(jì)量學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月11日