血管緊張素轉化酶抑制肽及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血管緊張素轉化酶抑制肽及其制備方法和應用，該抑制肽的氨基酸序列為：Asn?Thr?Leu?Thr?Leu?Ile?Asp?Thr?Gly?Ile?Gly?Met?Thr?Lys。本發(fā)明采用現代生化技術手段，對雜色蛤中的抑制血管緊張素轉化酶的活性成分進行跟蹤篩選和評價，通過酶解、乙醇沉淀、離子交換色譜、反相高效液相色譜法等純化方法制備得到，實驗結果表明，該抑制肽具有很好的抑制血管緊張素轉化酶的作用，具有很好的抗高血壓的功效，并且安全性能好，具有很好的應用前景。
【專利說明】
血管緊張素轉化酶抑制肽及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種活性多肽，具體涉及一種從雜色蛤軟體酶解物中分離得到的具有 抑制ACE活性的多肽，屬于生物醫(yī)藥技術領域。
【背景技術】
[0002] 血管緊張素轉化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)是一種鋅離子依賴型 的二肽羧基肽酶，廣泛存在于哺乳動物組織中，能將血管緊張素 I (Angiotensin I)轉化血 管緊張素 Π (Angiotensin Π )，后者為強烈的血管收縮劑，促使血壓升高；另一方面，ACE可 以使具有血管舒張作用的舒緩激肽(bradykinin)轉化為失活的片段，抑制降壓系統一一激 肽釋放酶-激肽系統(Kailikrein-Kinin System，KKS)，同樣導致血壓升高。因此，抑制ACE 的活性，可以達到緩解血壓增高，具有治療高血壓的作用。
[0003] 現代研究表明，活性肽與蛋白質及單一氨基酸相比，具有更強的生物活性和營養(yǎng) 價值?；钚噪膶傩詮姟⑸锘钚愿?、毒副作用小，易被消化吸收，具有多種功能，作為預防 和治療疾病的醫(yī)藥產品進行研究有著巨大的開發(fā)潛力。而食源性的ACE抑制劑控制高血壓 起效快、作用強、安全性高，目前己經在臨床治療高血壓和心血管疾病中發(fā)揮了重要的作 用。
[0004] 雜色蛤(Ruditapes philippinarum)是廣泛分布于江蘇沿海的一種重要雙殼經濟 貝類。傳統中醫(yī)理論認為其貝殼和軟體部份均可入藥，蛤蜊肉咸、冷、無毒，歸胃、肝、膀胱 經，宋代《嘉祐本草》中關于蛤蜊有記載："潤五臟，止消渴，開胃，解酒毒。主老癖能為寒熱 者，及婦人血塊，宜煮食之"?，F代研究表明蛤蜊酶解肽具有抗腫瘤、抗氧化等多種生物活 性。

【發(fā)明內容】

[0005] 發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是在雜色蛤現有研究的基礎之上，通過大量實驗篩選，采 用現代生化技術手段，對雜色蛤中的抑制血管緊張素轉化酶的活性成分進行跟蹤評價，通 過酶解、乙醇沉淀、離子交換色譜、反相高效液相色譜法等純化方法制備得到一種血管緊張 素轉化酶抑制肽，該抑制肽具有很好的抑制血管緊張素轉化酶的作用，具有很好的抗高血 壓的功效。
[0006] 技術方案:為了實現以上目的，本發(fā)明采取的技術方案為：
[0007] -種血管緊張素轉化酶抑制肽，該抑制肽具有下述的氨基酸序列"抓-!!^-!^!!-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lys (天冬酰胺-蘇氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-亮 氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-蛋氨酸-蘇氨酸-賴氨酸）。
[0008] 本發(fā)明提供的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其包括以下步驟：
[0009] (1)雜色蛤酶解物的制備：
[0010] 將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，分離煎煮液與肉渣，瀝干； 取肉渣，加3至8倍量水勻漿后，加入酶酶解，酶的加入重量為肉渣重量的0.01 %-2.0%，酶 解的溫度為37至50 °C，酶解的pH為7至9,酶解反應時間為2至6h;酶解結束后，于沸水浴滅 活，然后加入無水乙醇進行醇沉，并在4°C下靜置24小時，再取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到 凍干粉；
[0011] (2)離子交換色譜純化：
[0012] 取步驟(1)酶解得到的凍干粉以去離子水溶解后，經過離子交換色譜分離，流動相 為:A相:水，B相：lmol/L的氯化鈉溶液;洗脫條件為:0~40min內lmol/L氯化鈉溶液體積比 為0%，40~140min內lmol/L氯化鈉溶液體積比為0%~100% ;流速:3mL/min;檢測波長： 220nm;酶解物被離子交換色譜分離成不同組分，分別測定各組分ACE抑制活性，取活性最好 的部分，冷凍干燥，得凍干粉；
[0013] (3)反向色譜分離純化：
[0014] 取步驟(2)分離后的凍干粉以甲醇溶解，經過反相高效液相色譜分離，流動相為:A 相:0.1 %甲酸;B相：甲醇，洗脫程序為:B相甲醇體積由0 %至10 % (0~1 Omiη )，B相甲醇體積 由20%至40%(10~20111；[11)，13相甲醇體積由40%至100%(20~25111；[11);流速：101111^/111；[11;柱 溫:30°C，檢測波長為220nm，共分離收集到三組成分，然后進行冷凍干燥，經ACE抑制活性測 定后得到活性最好的血管緊張素轉化酶抑制肽，其氨基酸序列為Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lyso
[0015] 作為優(yōu)選方案，以上所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，所述的酶為胰 蛋白酶，所述胰蛋白酶活性為10000至50000U/g。
[0016] 作為優(yōu)選方案，以上所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，所述的酶的加 入重量為肉渣重量的0.1-1%，酶解的溫度為30~50°C，酶解的pH為6~9,酶解反應時間為 l-5h〇
[0017] 作為優(yōu)選方案，以上所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，所述的酶的加 入重量為肉渣重量的〇. 6%，酶解的溫度為45°C，酶解的pH為8.5，酶解反應時間為2h。本發(fā) 明通過大量試驗篩選最佳的酶解工藝。
[0018] 酶解工藝的篩選實驗：
[0019] 酶解溫度考察:取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，分別加入胰蛋白酶，加酶 量為肉渣量的〇. 25%，以pH 8.5，酶解反應時間2h的條件下，考察溫度因素對酶解產物ACE 抑制活性影響實驗，分別考察40°C、45°C、50°C、55°C和60°C酶解得到的雜色蛤酶解物對ACE 的抑制率，結果見表1。結果表明，45°C條件下的雜色蛤酶解產物ACE抑制活性最佳。
[0020] 表1溫度對胰蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制ACE活性的影響
[0021]
[0022]酶解pH值的考察:取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，分別加入胰蛋白酶，加 酶量為肉渣重量的〇 . 25%，以溫度45°C，酶解2h條件下，考察酶解反應pH對酶解產物抑制 ACE活性的影響實驗，考察的pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5和9.0時，酶解得到的雜色蛤酶解 物對ACE的抑制活性，結果見表2。結果表明，pH8.5時，雜色蛤酶解產物ACE抑制活性最佳。
[0023] 表2pH對胰蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制ACE活性的影響
[0024]
[0025] 胰蛋白酶加入量的考察:取雜色蛤軟體肉渣稱重，加 3倍量水勻漿，分別加入胰蛋 白酶，在pH = 8.5、溫度45°C條件下酶解2h，考察加酶量對酶解產物ACE抑制活性的影響實 驗，考察酶-底物比（酶-底物比按加酶量占肉渣重量的百分比計）分別為0.05 %、0.1 %、 0.25%、0.5%和0.75 %時酶解得到的雜色蛤酶解物抑制ACE活性，結果見表3，加酶量0.5% 時，雜色蛤酶解產物ACE抑制活性最佳。
[0026] 表3加酶量對胰蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制ACE活性的影響
[0027]
[0028] 酶解時間考察:取雜色蛤軟體肉渣稱重，加3倍量水勻漿，各取適量勻漿液加入胰 蛋白酶，加酶量為肉渣重量的〇. 5%，在pH 8.5，溫度45°C下，考察酶解反應時間對酶解產物 抑制ACE活性的影響實驗，分別考察1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3. Oh酶解得到的雜色蛤酶解物 的抑制ACE活性，結果見表4，結果表明，酶解時間2小時，得到的酶解物ACE抑制活性最強。 [0029] 表4不同酶解時間對胰蛋白酶酶解雜色蛤酶解物抑制ACE活性的影響
[0030]
[0032] 經過活性跟蹤評價驗證結果表明，采用胰蛋白酶作為水解酶，并且加入量為雜色 蛤肉渣重量的0.6 %，酶解的溫度為45°C，酶解的pH為8.5，酶解反應時間為2h時，具有最佳 的酶解效果，可以將具有血管緊張素轉化酶抑制活性的多肽分解出來，有利于后續(xù)進一步 純化得到活性肽，具有很好的技術效果。
[0033] 本發(fā)明所述的血管緊張素轉化酶抑制肽在制備防治高血壓藥物中的應用。
[0034] 有益效果：本發(fā)明提供的血管緊張素轉化酶抑制肽和現有技術相比具有以下優(yōu) 占.
[0035] 本發(fā)明通過大量試驗對雜色蛤中具有抑制血管緊張素轉化酶活性的多肽成分進 行跟蹤篩選，通過優(yōu)選工藝的酶解，離子交換色譜和反相高效液相色譜分離純化方法，獲得 具有很好的抑制血管緊張素轉化酶活性的多肽。并且本發(fā)明對活性多肽進行氨基酸序列分 析，確定氨基酸序列為 Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lys。本 發(fā)明工藝設計合理，可操作性強，為低值貝類開發(fā)新的臨床用途，具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0036] 圖1為本發(fā)明提供的血管緊張素轉化酶抑制肽的質譜圖。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明，應理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領域技術人員對本發(fā)明的各種等價形 式的修改均落于本申請所附權利要求所限定的范圍。
[0038] 實施例1
[0039] 血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其包括以下步驟：
[0040] (1)雜色蛤酶解物的制備：
[0041 ]將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分鐘，分離煎煮液與肉渣， 瀝干;取肉渣，加3倍量水勻漿后，加入酶活性為30000U/g的胰蛋白酶酶解，胰蛋白酶的加入 重量為肉渣重量的〇. 60 %，酶解的溫度為45°C，酶解的pH為8.50，酶解反應時間為2h;酶解 結束后，于沸水浴滅活，然后加入一定量的無水乙醇進行醇沉，最終形成70%的醇溶液，并 在4 °C下靜置24小時，再取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉；
[0042] (2)離子交換色譜純化：
[0043] 取步驟（1)酶解得到的凍干粉以去離子水溶解后，通過AKTA 900FPLC系統進行離 子交換分離純化，流動相為:A相:水，B相：lmol/L的氯化鈉溶液;洗脫條件為：lmol/L氯化鈉 溶液0%(0~40111；[11)，11]1〇1凡氯化鈉溶液0%~100%(40~140111；[11);流速:31]1]^/111；[11;檢測波 長:220nm。酶解物被分離成不同組分，按實施例4方法分別測定各組分ACE抑制活性，取活性 最好的部分，冷凍干燥，得凍干粉。
[0044] (3)反向色譜分離純化：
[0045] 取步驟(2)分離后的凍干粉以甲醇溶解，經過反相高效液相色譜分離，流動相為:A 相:0.1 %甲酸;B相：甲醇，洗脫程序為:B相甲醇體積由0 %至10 % (0~1 Omiη )，B相甲醇體積 由20%至40%(10~20111；[11)，13相甲醇體積由40%至100%(20~25111；[11);流速：101111^/111；[11;柱 溫:30°C，檢測波長為220nm，共分離收集到三組成分，然后進行冷凍干燥，得到血管緊張素 轉化酶抑制肽。
[0046] 實施例2血管緊張素轉化酶抑制肽的序列分析
[0047]取實施例1制備得到的血管緊張素轉化酶抑制肽，采用Nano-LC-ESI-MS/MS分析多 肽的氨基酸序列，質譜條件為:ESI源，掃描方式:正離子模式，質量掃描范圍：50~1000m/z; 分析得到活性多肽分子量為1477.80Da，質譜檢測圖如圖1所示，測定得到氨基酸序列為： Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lyso
[0048] 實施例3血管緊張素轉化酶抑制肽的合成
[0049] 根據實施例2獲得的氨基酸序列，采用固相合成的方法，合成血管緊張素轉化酶抑 制肽 Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-I le-Asp-Thr-Gly-I le-Gly-Met-Thr-Lys，合成后的多肽通過 HPLC分析純度為98%，質譜測定分子量為1477.80Da，與純化多肽分子量一致，二級質譜碎 片與純化多肽碎片一致。
[0050] 實施例4血管緊張素轉化酶抑制肽活性測試
[0051] 本發(fā)明采用高效液相色譜法測定血管緊張素轉化酶抑制活性，具體步驟如下：取 實施例1和實施例3分別制備得到的抑制肽溶于O.lmol/L硼酸緩沖液(含0.3mol/L NaCl，pH 8.3)制成相應的樣品液。血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)分別用 0.1mol/L硼酸緩沖液(含0.3mol/L NaCl，pH 8.3)配成 100mU/mL ACE溶液和5mmol/L HHL溶 液。將30yL HHL和10yL樣品（或緩沖溶液)混勻后，于37°C保溫5min，再加入20yL的ACE啟動 反應，混勻后繼續(xù)于37°C下反應lh，迅速加入70yL HC1 (lmol/L)終止反應，用高效液相色譜 分析結果。同時用硼酸緩沖液代替樣品溶液做空白對照。
[0052] 色譜條件：Xbridge_Ci8 柱（4.6X250mm，5ym，美國 Waters 公司）；流動相：甲醇-0.05 %三氟乙酸水溶液，流速：1. OmL/min;檢測波長:228nm;柱溫:30 °C ;進樣量：10yL。梯度 條件：甲醇25%~70%(0~30min)。
[0053] ACE抑制率（％ ) = [ l-(Ai/Aj) ] X 100
[0054] 式中:Ai為樣品組馬尿酸峰面積，Aj為空白組的馬尿酸峰面積。
[0055] 測定得到本發(fā)明實施例1和實施例3制備得到的血管緊張素轉化酶抑制肽的體外 ACE抑制IC50均為5.75μΜ，和現有技術相比取得了很好的預料不到的技術效果。
[0056] 本發(fā)明從雜色蛤中提取純化制備得到具有血管緊張素轉化酶抑制活性的多肽，具 有很好的抗高血壓活性，并且安全性能高，具有廣闊的應用前景。
[0057] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種血管緊張素轉化酶抑制肽，其特征在于，該抑制肽具有下述的氨基酸序列:Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lyso2. 權利要求1所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 雜色蛤酶解物的制備： 將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，分離煎煮液與肉渣，瀝干;取肉 渣，加3至8倍量水勻漿后，加入酶酶解，酶的加入重量為肉渣重量的0.01 %-2.0%，酶解的 溫度為37至50°C，酶解的pH為7至9，酶解反應時間為2至6h;酶解結束后，于沸水浴滅活，然 后加入無水乙醇進行醇沉，靜置，再取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉； (2) 離子交換色譜純化： 取步驟(1)酶解得到的凍干粉以去離子水溶解后，經過離子交換色譜分離，流動相為:A 相為水，B相為lmol/L的氯化鈉溶液;洗脫條件為:0~40min內lmol/L氯化鈉溶液體積比為 0%，40~140min內lmol/L氯化鈉溶液體積比為0 %~100 % ;流速：3mL/min;檢測波長： 220nm;經過離子交換色譜分離得到不同組分的酶解物，分別測定各組分ACE抑制活性，取活 性最好的部分，冷凍干燥，得凍干粉； (3) 反向色譜分離純化： 取步驟(2)分離后的凍干粉以甲醇溶解，經過反相高效液相色譜分離，流動相為:A相為 體積濃度0.1 %甲酸;B相為甲醇，洗脫程序為:0~1 Omin內B相甲醇體積由0 %至10 %，10~ 20min內B相甲醇體積由20 %至40 %，20~25min B相甲醇體積由40 %至100 % ;流速：10mL/ min;柱溫:30°C，檢測波長為220nm，分離收集到氨基酸序列為Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lys的血管緊張素轉化酶抑制肽。3. 根據權利要求2所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其特征在于，所述的酶 為胰蛋白酶，所述胰蛋白酶活性為10000至50000U/g。4. 根據權利要求2所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其特征在于，所述的酶 的加入重量為肉渣重量的0.1~1%，酶解的溫度為30~50 °C，酶解的pH為6~9,酶解反應時 間為1~5h。5. 根據權利要求4所述的血管緊張素轉化酶抑制肽的制備方法，其特征在于，所述的酶 的加入重量為肉渣重量的0.6%，酶解的溫度為45°C，酶解的pH為8.5，酶解反應時間為2h。6. 權利要求1所述的血管緊張素轉化酶抑制肽在制備防治高血壓藥物中的應用。
【文檔編號】C12P21/06GK106084013SQ201610740899
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月26日
【發(fā)明人】劉睿, 盛乃娟, 吳體智, 王倩, 陳曉鈺, 李曉芳, 吳皓
【申請人】南京中醫(yī)藥大學