靶向生長抑素受體的Al¹⁸F?NOTA?PEG₆?TATE及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了靶向生長抑素受體的Al18F?NOTA?PEG6?TATE及其制備方法和應(yīng)用。該標(biāo)記物的制備方法為：將生長抑素衍生物TATE與雙功能螯合劑NOTA借助用PEG進(jìn)行連接，生成放射性標(biāo)記前體，然后采用“一鍋法”進(jìn)行正電子核素18F標(biāo)記，即可獲得18F標(biāo)記的生長抑素衍生物Al18F?NOTA?PEG6?TATE。本發(fā)明方法可在乙酸鹽緩沖液體系或乙腈反應(yīng)體系中進(jìn)行，且該方法具有操作簡便、標(biāo)記率、產(chǎn)物純度高的優(yōu)點。本發(fā)明制備的靶向生長抑素受體的正電子標(biāo)記物可應(yīng)用于PET/CT分子探針或腫瘤治療藥物的制備中，且為臨床PET/CT分子探針的合成提供了新的思路。
【專利說明】
靶向生長抑素受體的A丨18f-nota-peg6-tate及其制備方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于放射性標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及靶向生長抑素受體的ai18f-nota-peg6-TATE及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，放射性核素標(biāo)記受體結(jié)合肽是腫瘤靶向診斷的研究熱點之一，其中基于 生長抑素受體(somatostatin receptor，SSTR)的腫瘤顯像備受關(guān)注。SSTR作為G蛋白偶聯(lián) 受體家族的一員，共有5個亞型，即S S T R1~5，可在小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤 (neuroendocrine tumor，NET)、腦膜瘤及膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)?；诖耍絹?越多的學(xué)者認(rèn)為尋找對SSTR具有高親和力的生長抑素源性配體或可為腫瘤診斷新靶點提 供借鑒。奧曲肽(octreotide，0C)，是天然的生長抑素經(jīng)人工修飾后合成的環(huán)八肽[0-?116-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr (01)]，它對SSTR2有高度親和力，對SSTR5有輕度親和力。 若3位Phe被Tyr取代，碳末端的Thr(ol)被Thr取代則奧曲肽可衍生為TATE，其氨基酸順序 為:D-Phe-Cy s-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr，此衍生物對SSTR2的親和力進(jìn)一步增高，從而 增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化的比率，最終使得肽分子在SSTR高表達(dá)組織(胰腺、腎上腺、垂體以及 SSTR高表達(dá)的腫瘤）中有明顯高攝取。
[0003] 在歐美國家，mIn-DTPA-〇treotide(Octreoscan)是目前臨床上診斷NETs的金標(biāo) 準(zhǔn)，但因回旋加速器產(chǎn)生mIn費用高，其廣泛應(yīng)用受限，而且與正電子核素相比，mIn能量 較低（171keV，245keV)，使得mIn-DTPA-〇treotide最終成像的空間分辨率較低。對于正電 子PET顯像而言， 68Ga、64Cu、18F等已被用于標(biāo)記奧曲肽衍生物。其中68Ga標(biāo)記的奧曲肽衍生物 ( 68Ga_D0TATATE，68Ga-D0TAT0C及68Ga-D0TAN0C等)在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤顯像中具有巨大潛力， 近年來在臨床上使用明顯增加。然而因 68Ge/68Ga發(fā)生器日產(chǎn)量較低，每次僅可洗脫300-700MBq，再加上缺乏FDA批準(zhǔn)的 68Ga標(biāo)記藥物及68Ge/68Ga發(fā)生器，68Ga PET顯像目前并沒有在 臨床廣泛應(yīng)用。
[0004] 與放射性金屬核素68Ga和64Cu相比，18F應(yīng)用更為廣泛，因其具有相對較長的半衰期 (ti/2 = 110min)、低能(0.64MeV)以及缺乏散射等優(yōu)良的核素特征。另外，18F標(biāo)記化合物可行 延遲顯像，其起始比活度較高可允許大劑量制備，且 18F標(biāo)記化合物空間分辨率較高，故用放 射性18F標(biāo)記生長抑素類似物具有更明顯的優(yōu)勢。
[0005] 目前已有多種放射性18F標(biāo)記的奧曲肽類似物（如2-18F-FP-0C，Gluc-Lys ([ 18F] FP)-T0CA，Gluc-S-Dpr ([ 18F]FB0A) T0CA以及Ce 1-S-Dpr ([ 18F]FB0A)T0CA等）用于神經(jīng)內(nèi)分 泌腫瘤的顯像。但這些化合物放射性制備過程繁瑣、產(chǎn)率較低，其臨床常規(guī)使用受限，而且 其制備過程很難實現(xiàn)自動化。比如：2003年Wester等人通過輔基法合成糖基化的Gluc-Lys ([1叩]即）_了〇(^，先合成中間產(chǎn)物1吁_冊13，再通過，的?；饔?，用，_冊 13與#_(1_ deoxy-D-fructosyl)-LysQ-Tyr3-Lys5(Dde)-〇ctreotate 進(jìn)行反應(yīng)，合成糖基化的Gluc-Lys ([18F]FP)-T0CA，其中賴氨酸(Lys)可同時連接18F-NFP、糖基以及奧曲肽衍生物，總合成時 間約3h，放化產(chǎn)率介于20 % -30 %之間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種靶向生長抑素受體的PET顯像分子探針及其制備方法 和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 一種靶向生長抑素受體的PET分子探針，為ai18f-nota-peg 6-tate，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0009；
[0010] PET分子探針A118F-N0TA-PEG6-TATE在生長抑素受體靶向的腫瘤顯像中的應(yīng)用。包 括神經(jīng)內(nèi)分泌瘤和非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(譬如膠質(zhì)瘤等）。
[0011] PET分子探針A118F-N0TA-PEG6-TATE在非骨轉(zhuǎn)移的生長抑素受體靶向的神經(jīng)內(nèi)分 泌腫瘤顯像的應(yīng)用，或在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用。
[0012] PET分子探針A118F-N0TA-PEG6-TATE在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分子影像診斷中的應(yīng)用。
[0013] -種小分子探針的制備方法，包括下列步驟：在盛有18F離子的反應(yīng)容器中加入 A1C13以及雙功能螯合劑ΝΟΤΑ連接的小分子化合物，90-105°C反應(yīng)15-25分鐘，然后分離純 化，制備得到A1 18F-N0TA標(biāo)記的小分子探針。
[0014] 優(yōu)選的，小分子化合物選自小分子多肽或維生素。
[0015]優(yōu)選的，維生素為葉酸。
[0016] 優(yōu)選的，小分子化合物為PEG6-TATE。
[0017]優(yōu)選的，反應(yīng)緩沖液為乙酸鹽溶液或無水乙腈。
[0018]優(yōu)選的，乙酸鹽緩沖液的濃度為0· 1-0· 5mol/L，pH為3-6· 5。
[0019] 優(yōu)選的，乙酸鹽緩沖液的濃度為0.1-0.5mol/L，pH為3.8-4.2。
[0020] 優(yōu)選的，在乙酸鹽緩沖液中，每0.55-1.11689的^離子中加入611111〇1的41(：13以及 54 · 5-136nmol 的 N0TA-PEG6-TATE 〇
[0021] 優(yōu)選的，在無水乙腈中，每0.55-1.11689的1乍離子中加入52-26〇11111〇1的41(：13以及 26 · 4-264 · 5nmo 1 N0TA-PEG6-TATE，以及26 · 4-264 · 5nmo 1 冰乙酸。
[0022]本發(fā)明的有益效果是：
[0023]本發(fā)明建立了一種制備靶向生長抑素受體的PET分子探針的方法，應(yīng)用雙功能螯 合劑ΝΟΤΑ與親水基團(tuán)PEG修飾的奧曲肽類似物TATE制備標(biāo)記前體，通過"一鍋法"進(jìn)行18F標(biāo) 記，也就是說不經(jīng)中間純化步驟，將兩步反應(yīng)在同一容器中進(jìn)行，最后進(jìn)行純化，得到目標(biāo) 產(chǎn)物A118F-NOTA-PEG6-TATE。該發(fā)明標(biāo)記方法簡便、省時，放化產(chǎn)率優(yōu)于傳統(tǒng)的輔基標(biāo)記法。 [0024]本發(fā)明的N0TA-PEG6-TATE可通過A1 18F方法標(biāo)記成功。本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)緩沖液為 乙酸鹽溶液或無水乙腈。在乙酸鹽緩沖液反應(yīng)體系中，控制每0.55-1. llGBq的18F氟離子中 加入6nmol的AlCh和54.5-136nmolN0TA-PEG 6-TATE。在這種條件下，所得目標(biāo)產(chǎn)物放化產(chǎn)率 介于70%-100%之間，以便進(jìn)行大劑量標(biāo)記。此外，本發(fā)明首次采用無水乙腈為反應(yīng)溶劑進(jìn) 行A1 18F標(biāo)記N0TA-PEG6-TATE，獲得了成功。在無水乙腈反應(yīng)體系下，控制每0.55 -1.1 lGBq 的 18F氟離子中加入52-260nmol的A1C13和26 · 4-264 · 5nmol N0TA-PEG6-TATE，以及26 · 4-264.5nmol冰乙酸，所得產(chǎn)物放化產(chǎn)率介于64%-74%之間。用C18柱純化后放化純均為95% 以上，整個標(biāo)記及純化過程可在1小時內(nèi)完成。
[0025] 脂水分配系數(shù)實驗測得Log P = -2.45 ±0.38，說明A118F-N0TA-PEG6-TATE水溶性 較強，此顯像劑在PBS和小牛血清中可穩(wěn)定存在2小時;細(xì)胞攝取及排泄實驗證明U87MG細(xì)胞 可快速攝取及排泄A118F-N0TA-PEG 6-TATE;生物學(xué)分布實驗及Micro PET顯像提示該顯像劑 在腫瘤攝取較高，并且主要通過腎臟排泄。
[0026]本發(fā)明選用人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞攝取及排泄實驗，用荷U87MG瘤鼠 進(jìn)行生物學(xué)分布及Micro PET實驗，結(jié)果證明A118F-N0TA-PEG6-TATE在U87MG瘤組織及SSTR 高表達(dá)器官（腎上腺及胰腺）中攝取較高，說明U87MG細(xì)胞上確實含SSTR，能與A118F-N0TA-PEG 6-TATE進(jìn)行特異性結(jié)合。
[0027]體內(nèi)生物學(xué)分布實驗及Micro PET顯像結(jié)果提示雙腎攝取較高，而肝腸攝取較低， 說明該顯像劑主要通過泌尿系排泄，與脂水分配系數(shù)實驗得出該顯像劑親水性較強結(jié)論基 本一致。另外該顯像劑在腦中攝取較低，提示顯像劑不通過血腦屏障，而臨床上常用的 18f-FDG可通過血腦屏障在腦中攝取較高，故A118F-N0TA-PEG6-TATE對腦腫瘤的顯像優(yōu)于常用 的 18f-fdg〇
[0028] 此外，本發(fā)明驗證顯像劑A118F-N0TA-PEG6-TATE與生長抑素受體可進(jìn)行特異性結(jié) 合，故該顯像劑也可用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤顯像，特別是非骨轉(zhuǎn)移的生長抑素受體靶向的神 經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤顯像。
【附圖說明】
[0029] 圖 1 為A118F-N0TA-PEG6-TATE 的結(jié)構(gòu)式；
[0030] 圖2為標(biāo)記后(a)及純化后(b)的A118F-N0TA-PEG6-TATE的HPLC圖譜；
[0031] 圖3為A118F-N0TA-PEG6-TATE在PBS緩沖液及胎牛血清中的穩(wěn)定性；
[0032]圖 4 為U87MG攝取(a)和洗脫(b)Al18F-NOTA-PEG6-TATE 的曲線圖；
[0033] 圖5為注射A118F-N0TA-PEG6-TATE 1小時后其在荷U87MG瘤鼠中的生物學(xué)分布圖； [0034] 圖6為荷U87MG瘤鼠、注射A118F-N0TA-PEG6-TATE 1小時和2小時后的正常顯像以及 共注射前體N0TA-PEG6-TATE 1小時后阻斷顯像；
[0035] 圖7為U87MG(A)及KB(B)瘤組織切片SSTR表達(dá)情況的免疫組化圖。
【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0037] 使用材料
[0038] 所有化學(xué)試劑均從專業(yè)的化學(xué)公司購買，為分析等級，使用時沒有進(jìn)一步純化。 NOTA-PEGe-TATE [ p-SCN-Bn-NOTA-PEGe- (D) -Phe^c (Cy s2-Tyr3- (D) -Trp4-Ly s5-Thr6-Cy s7)-Thr8]由本實驗室設(shè)計，指定某生物公司合成，化學(xué)純度大于92%，并經(jīng)過反相高效液相層 析法（reverse-phase high-performance liquid chromatography，RP_HPLC)及質(zhì)譜分析 證實。正電子核素18F用本中心的回旋加速器PET/CTtrac e(西門子，德國）生產(chǎn)獲得，并通過 活化后SepPak'Light Accell plus QMA陰離子交換柱。反相萃取柱CisSep-Pak分離柱從 Waters公司購買(MiIford，MA,USA)，使用前依次用乙醇及水進(jìn)行活化。所有放射性化合物 均是通過RP-HPLC(島津，中國）進(jìn)行分析的，C18柱規(guī)格為5μπι，250 X 4.6mm，分析時流速為 lml/min，流動相條件如下:A緩沖液為含0.1 %三氟乙酸的水，B緩沖液為含0.1 %三氟乙酸 的乙腈，分析梯度為 0-18min，30%B-60%B，18-20min，60%B-30%B。
[0039] 乙酸鹽緩沖液配置如下：
[0040] 1)0.5mol/L(即0.5M)的乙酸鹽緩沖液的配置：用20.5075g乙酸鈉(分子量:82.03) 溶于水，再加入80.478mL冰乙酸(密度1.049g/mL)，定容為500mL，配成0.5mol/L的乙酸鹽緩 沖液；
[0041 ] 2)0 · lmol/L(即0 · ImM)的乙酸鹽緩沖液的配置:取60mL 0 · 5mol/L的乙酸鹽緩沖液 用水定容至300mL，配成0. lmol/L的乙酸鹽緩沖液。
[0042]以下實施例中的實驗所得到的所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果用非配對t檢 驗，p〈0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0043]實施例1放射性標(biāo)記
[0044] N0TA-PEG6-TATE通過A118F化學(xué)方法進(jìn)行18F標(biāo)記，基于兩種完全不同的反應(yīng)體系， 乙酸鹽緩沖液(pH=4)及乙腈，均是在同一個反應(yīng)容器中進(jìn)行，反應(yīng)過程中無中間產(chǎn)物的產(chǎn) 生。
[0045] 1.1基于乙酸鹽緩沖液
[0046] 從本中心加速器取lml 18F水溶液，大約0.55-l.llGBq(15-30mCi)，將其通過活化 后的QMA柱，然后用0.2ml 0.9%的生理鹽水洗脫18F離子至1.5ml EP管中，然后依次往EP管 中加入3yL 2mM的A1 Cl3(6nmo 1)乙酸鹽緩沖液(0·1Μ，ρΗ=4)以及54.5nmo 1 N0TA-PEG6-TATE 前體溶液。密封后，將反應(yīng)液在100°C反應(yīng)20分鐘，冷卻，并用0.5ml PBS緩沖液稀釋，然后通 過活化后的C18柱，先用5ml去離子水沖洗柱子以除去18F-和A118F 2+，再用500μ1 7:3的乙醇/ 水混合液洗脫目標(biāo)化合物，共洗脫3次。最終產(chǎn)品的放化產(chǎn)率及放化純均是通過分析型HPLC 測得，通過PBS稀釋后用于體內(nèi)外實驗。
[0047] 1.2基于乙腈反應(yīng)體系
[0048] 從本中心加速器取lml 18F水溶液，大約0.55-l.llGBq(15-30mCi)，將其通過活化 后的QMA柱，然后用0.5ml的0.5mM K2C03溶液洗脫至5ml的反應(yīng)瓶中，在105°C加入0.5ml乙腈 共沸除水3次，然后依次加入10μ1 0.026mol/L(260nmol)的A1C13溶液及200μ1 N0TA-PEG6-ΤΑΤΕ前體溶液（用lml乙腈溶解0 · 5mg Ν0ΤΑ-ΤΑΤΕ，即52 · 9nmol)再加30ul冰乙酸（52nmol)， 反應(yīng)液在105 °C反應(yīng)20分鐘，冷卻，純化方法同上。
[0049] 1.3放射性標(biāo)記結(jié)果如下：
[0050] A118F-N0TA-PEG6-TATE的結(jié)構(gòu)式見圖1，整個放射性標(biāo)記過程在100-105°C60min之 內(nèi)完成，衰減校正后基于乙酸鹽反應(yīng)體系的標(biāo)記率介于70%-100%之間，基于乙腈反應(yīng)體 系的標(biāo)記率介于64%-74%之間（見圖2。圖2是基于乙腈反應(yīng)體系的HPLC圖，其中2-a為反應(yīng) 后的，而2-b為反應(yīng)完經(jīng)過純化后的HPLC圖）。采用Sep-Pak C18柱分離柱純化、HPLC檢測后， 無論基于哪種反應(yīng)體系，放純度均大于98%，比活度大于16.9GBq/umol。
[0051 ] 本發(fā)明證實N0TA-PEG6-TATE可通過A118F螯合化學(xué)方法標(biāo)記成功，而且這種新型的 A118F螯合化學(xué)較傳統(tǒng)的18F輔基標(biāo)記法放化產(chǎn)率高。無論基于乙酸鹽緩沖液還是有機溶劑 乙腈，A1 18F-N0TA-PEG6-TATE均可標(biāo)記成功，只是后者放化產(chǎn)率較前者略低。另外，基于乙腈 體系的標(biāo)記方法需要共沸除水，總過程耗時較乙酸鹽體系長?？筛鶕?jù)情況選擇上述任一體 系進(jìn)行A1 18F化學(xué)標(biāo)記。最終標(biāo)記產(chǎn)物可通過C18柱進(jìn)行分離純化無需用HPLC進(jìn)行純化。 [0052]實施例2脂水分配系數(shù)測定
[0053] 取 1〇μ1 (1.85MBq)的 A118F-N0TA-PEG6-TATE 反應(yīng)液，加入含有 0.5ml 正辛醇和 0.5ml 磷酸緩沖液（PBS)的1.5ml的EP管中，密封后在室溫下渦旋2min，1000r/min條件下離心 5min。用加樣槍依次取出有機相和水相各50μ1置于γ計數(shù)管中，用γ計數(shù)器測定計數(shù)。由公 式LogP = lg(計數(shù)正辛醇/計數(shù)PBS)計算標(biāo)記物的平均LogP值，重復(fù)三次。
[0054] 經(jīng)實驗測定A118F-N0TA-PEG6-TATE的Log P = -2.45±0.38，說明此分子探針是明 顯親水性的，故可推測此探針在體內(nèi)是通過泌尿系排泄的。
[0055]實施例3體外穩(wěn)定性實驗
[0056] 取 20μ1 (約3.7MBq)的 18F-N0TA-PEG6-TATE 溶液，分別置于 0.5mL 的 PBS 緩沖液（pH = 7.24,0.02111〇1/1)或胎牛血清卬85)中，置于37°(：下孵育，0.5，1，1.5及211后分別用!^(：測定 其放射化學(xué)純度，以觀察其體外穩(wěn)定性。但對于胎牛血清，先用等體積的乙腈稀釋，密封后 在室溫下禍旋2min，1000r/min條件下離心5min，取上清液用HPLC進(jìn)行分析。
[0057] A118F-N0TA-PEG6-TATE在PBS緩沖液及胎牛血清中的體外穩(wěn)定性實驗結(jié)果如圖3所 示，從圖3中可看出，此分子探針在37°CPBS緩沖液中孵育2h放化純?nèi)源笥?5 %，同時在胎牛 血清中孵育2h放化純大于80%，說明A118F-N0TA-PEG6-TATE在體外大部分是穩(wěn)定存在的。 [0058]實施例4細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立
[0059]人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG腫瘤細(xì)胞株在加有10%胎牛血清、10011]/11^青霉素和 100 IU/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)介質(zhì)。細(xì)胞在含有5 %⑶2、溫度37 °C的 潮濕空氣中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后用0. 〇5%EDTA和0.0 lmol/L磷酸緩沖液(pH7.4)分離 用于進(jìn)一步細(xì)胞培養(yǎng)。在每只雄性裸鼠右肩部皮下接種5 X106個U87MG細(xì)胞，待腫瘤直徑達(dá) 到0.8 -lcm時用于體內(nèi)Micro PET實驗(大約種植后4-5周），所有動物實驗遵循國家標(biāo)準(zhǔn)及 動物福利原則。
[0060] 實施例5細(xì)胞攝取及洗脫實驗
[0061] 在24孔板中加入每孔IX 105個U87MG腫瘤細(xì)胞，然后過夜以保證其貼壁，隔天去除 培養(yǎng)基，每孔加入含185KBq A118F-N0TA-PEG6-TATE的無血清培養(yǎng)液0.5ml，37°C孵育10，30， 60,90，180min后用0.5ml/孔冰凍的I?S洗滌3遍，然后用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化 細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液用γ -計數(shù)儀測量計數(shù)。細(xì)胞攝取數(shù)據(jù)經(jīng)衰變校正后用細(xì)胞結(jié)合力，即 百分加入劑量表示，實驗設(shè)3個平行樣，重復(fù)兩次。
[0062] 對于細(xì)胞洗脫實驗，在24孔板中加入每孔IX 105個U87MG腫瘤細(xì)胞，在37 °C與 185KBq/孔A118F-N0TA-PEG6-TATE共孵育2h使其充分內(nèi)在化。然后去除培養(yǎng)基，用冰凍PBS沖 洗3遍，再加入無血清培養(yǎng)液37°C孵育0，15,30,60,90，12011^11。之后再用冰凍?85液沖洗3 遍，最后用0.25 %胰蛋白酶/0.02%EDTA消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液用γ -計數(shù)儀測量計數(shù)。細(xì) 胞排泄數(shù)據(jù)經(jīng)衰變校正后用細(xì)胞滯留率即百分加入劑量表示，實驗設(shè)3個平行樣，重復(fù)兩 次。結(jié)果見圖4。
[0063]由圖4結(jié)果可知:U87MG細(xì)胞能快速、高效的結(jié)合A118F-N0TA-PEG6-TATE，如圖4a所 示，而且隨著孵育時間的延長，顯像劑對U87MG的細(xì)胞結(jié)合力進(jìn)一步增強，在孵育3h時達(dá)到 高峰，細(xì)胞結(jié)合力最高值為1.77% ±0.07%。在細(xì)胞洗脫實驗中，在最初的lOmin內(nèi)，A118F-NOTA-PEG6-TATE在U87MG細(xì)胞內(nèi)排泄最快，細(xì)胞滯留率從1.35%±0.10%降至0.41%土 0.01 %，之后此顯像劑在U87MG細(xì)胞內(nèi)排泄緩慢，2h末細(xì)胞滯留0.29% ±0.07%，見圖4b。 [0064]實施例6體內(nèi)生物學(xué)分布實驗
[0065]體內(nèi)生物學(xué)實驗是通過在2%異氟烷麻醉下每只荷U87MG瘤鼠通過尾靜脈注射 3.7MBq(100yCi)的Al18F-NOTA-PEG6-TATE，阻斷實驗是通過尾靜脈共同注射上述示蹤劑及 前體溶液N0TA-PEG 6-TATE(10mg/kg)。在注射顯像劑后lh后處死動物，分離腫瘤和主要的臟 器并稱重，然后用γ -計數(shù)儀測量放射性計數(shù)，腫瘤和正常臟器的放射性攝取用每克組織百 分注射劑量（％ID/g)來表不。
[0066]結(jié)果見圖5。圖5結(jié)果表明注射顯像劑lh后U87MG腫瘤攝取值（圖5中第三個柱子)為 2.43 ±0.40 % ID/g，高于其他正常臟器，例如血液（1.22 ±0.09 % ID/g)、肌肉（0.86 土 0.12%10/^)、腦（0.89±0.09%10/^)心臟（1.68±0.25%10/^)、肝臟（1.71±0.14%10/ 8) 及肺臟(2.05±0.15%10/^)，尤其是肌肉及腦。顯像劑在雙腎攝取較高，高達(dá)4.13±0.02% ID/g，而胃腸攝取較低，說明Al18F-NOTA-PEG6-TATE是通過泌尿系排泄，而非肝膽排泄。另外 在SSTR表達(dá)的胰腺及腎上腺內(nèi)可見明顯生理性攝取，攝取值分別為1.06 ±0.18% ID/g及 3.88 ± 0.88 % ID/g，提示A118F-NOTA-PEG6-TATE與生長抑素受體有高親和力。骨中攝取明顯 增高，高達(dá)67.18±0.78% ID/g，說明Al18F-NOTA-PEG6-TATE在體內(nèi)易發(fā)生脫氟現(xiàn)像。
[0067] 阻斷實驗顯示腫瘤、胰腺及腎上腺對A118F-N0TA-PEG6-TATE的特異性攝取在大量 非放射性前體的存在下可明顯減低，進(jìn)一步證明A118F-N0TA-PEG6-TATE與生長抑素受體有 高親和力。另外該顯像劑在腦中攝取較低，提示顯像劑不通過血腦屏障，而臨床上常用的 18f-fdg可通過血腦屏障在腦中攝取較高，故Al 18F-NOTA-PEG6-TATE對腦腫瘤的顯像優(yōu)于常 用的 18f-fdg。
[0068] 而骨的攝取在過量前體存在下未見明顯下降，說明骨中高攝取是由于Al18F-NOTA-PEG6-TATE在體內(nèi)發(fā)生了脫氟，而非骨中有SSTR高表達(dá)。目前脫氟還不可避免，但因為脫下 的氟是很微量的，而且人體中本身含氟，所以不存在安全性問題。本發(fā)明的ai 18f-nota-PEG6-TATE可用于生長抑素受體靶向的腫瘤顯像;特別是非骨轉(zhuǎn)移的靶向生長抑素受體的 神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤顯像。
[0069] 實施例7Micro PET顯像
[0070] Micro PET采集及圖像分析是用西門子Inevon小動物PET/CT進(jìn)行的。實驗組荷膠 質(zhì)瘤U87MG裸鼠在2%異氟烷麻醉下經(jīng)尾靜脈注射100μΙ約3.7MBq(100yCi)的A1 18F-N0TA-PEG6-TATE，在注射顯像劑60min及120min后采集靜態(tài)圖像。阻斷組是通過尾靜脈共注射顯 像劑3.7MBq(100yCi)及10mg/kg的前體溶液N0TA-PEG6-TATE，在注射顯像劑60min后采集靜 態(tài)圖像。實驗動物置于俯臥位進(jìn)行固定，在顯像過程中用帶有連接管的鼻罩持續(xù)吸入異氟 烷使動物維持在麻醉狀態(tài)下，實驗動物的體溫用水循環(huán)加熱板使其保持穩(wěn)定。圖像經(jīng)用CT 進(jìn)行衰減校正后并采用2D有序子集期望最大化法重建。每次PET掃描后，用Inevon Research Workplace 4.1軟件在衰減校正后的全身冠狀位圖像上勾畫腫瘤及主要臟器的 感興趣區(qū)，測量放射性攝取值，用％ ID/g表示，PET顯像結(jié)束后將動物處死，遵循動物福利原 則。
[0071] 通過Micro PET/CT顯像可觀察A118F-N0TA-PEG6-TATE在荷U87MG瘤鼠中體內(nèi)的藥 代動力學(xué)特性及腫瘤靶向特征。從圖6可見，U87MG瘤結(jié)節(jié)在Micro PET圖像上顯示清晰，在 注射顯像劑1小時及2小時后瘤組織的攝取值分別為(3.8±0.3)及(4.4±0.4)%1〇4。在過 量非放射性前體的存在下，腫瘤攝取明顯下降，近乎于背景，降至(〇.33±0.06)%ID/g，E 實了 A118F-N0TA-PEG6-TATE對SSTR陽性的U87MG瘤組織有明顯的SSTR靶向性。另外類似于體 內(nèi)分布實驗，雙腎攝取較高、肝臟及肌肉攝取較低。體內(nèi)生物學(xué)分布實驗及Micro PET顯像 結(jié)果提示雙腎攝取較高，而肝腸攝取較低，說明該顯像劑主要通過泌尿系排泄，與脂水分配 系數(shù)實驗得出該顯像劑親水性較強結(jié)論基本一致。
[0072] 體內(nèi)分布實驗結(jié)果一致，Micro PET/CT顯像進(jìn)一步證實A118F-N0TA-PEG6-TATE在 體內(nèi)發(fā)生了脫氟現(xiàn)象。正常組中股骨攝取值較高，為（14.4±2.7)%1〇4，而阻斷組中未見 明顯下降為（14.4±1.8)%ID/g，說明骨中的高攝取不是由于骨中SSTR高表達(dá)，而是發(fā)生了 脫氟。
[0073]實施例8免疫組化實驗
[0074]顯像結(jié)束后，將荷U87MG瘤鼠斷頸處死，將瘤結(jié)節(jié)解剖出來，用10 %福爾馬林固定， 石蠟包埋并切片至4μπι，脫蠟水化、抗原修復(fù)，用DAB顯色方法進(jìn)行SSTR2抗體(H-50，SANTA) 的免疫染色。同時，用非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤-人口腔上皮癌細(xì)胞株KB瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行陰性對照。 [0075] 免疫組化結(jié)果顯示在U87MG腫瘤細(xì)胞膜表面可見SSTR2高表達(dá)，而KB腫瘤則成低表 達(dá)，見圖7，這些結(jié)果與Micro PET顯像結(jié)果相符，說明腫瘤攝取顯像劑A118F-N0TA-PEG6-TATE不是因為非特異性攝取，而是腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)SSTR2所致。
[0076]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種祀向生長抑素受體的陽Τ分子探針，為A118F-N0TA-PEG6-TATE，其結(jié)構(gòu)式如下：2. 陽T分子探針A118F-N0TA-PEG6-TATE在生長抑素受體祀向的腫瘤顯像中的應(yīng)用。3. 陽T分子探針A118F-N0TA-PEG6-TATE在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分子影像診斷中的應(yīng)用。4. 一種小分子探針的制備方法，其特征在于，包括下列步驟:在盛有1中離子的反應(yīng)容器 中加入AlClsW及雙功能馨合劑ΝΟΤΑ連接的小分子化合物，90-105°C反應(yīng)15-25分鐘，然后 分離純化，制備得到All中-ΝΟΤΑ標(biāo)記的小分子探針。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:小分子化合物選自小分子多膚或維生 素。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:小分子化合物為PEG6-TATE。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：反應(yīng)緩沖液為乙酸鹽溶液或無水乙 臘。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：乙酸鹽緩沖液的濃度為0.1-0.5mol/ L，抑為 3-6.5。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:在乙酸鹽緩沖液中，每0.55-1.11 GBq 的"F離子中加入6nmol的AlCbW及54.5-136nmol 的NOTA-PEGs-TATE。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：在無水乙臘中，每0.55-1.11 GBq 的"F離子中加入52-260nmol 的AlCb W及26.4-264.5nmol NOTA-PEGs-TATE，W及26.4- 264.5nmol冰乙酸。
【文檔編號】C07K7/06GK106084005SQ201610423679
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日 公開號201610423679.4, CN 106084005 A, CN 106084005A, CN 201610423679, CN-A-106084005, CN106084005 A, CN106084005A, CN201610423679, CN201610423679.4
【發(fā)明人】尹吉林, 王欣璐, 張蓉琴, 王成
【申請人】廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院