專利名稱：受體(sstr2)-選擇性生長抑素拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與生長抑素相關(guān)的肽，以及使用所述肽藥物治療哺乳動(dòng)物的方法。具體說，本發(fā)明涉及縮短的受體-選擇性生長抑素肽拮抗劑，以及賦予其受體選擇性的所述肽中氨基酸取代和/或添加的加入，本發(fā)明涉及含有所述肽的藥物組合物，本發(fā)明涉及與放射性核素絡(luò)合或軛合的所述肽，本發(fā)明涉及使用所述肽、特別是與螯合劑偶聯(lián)或以其他方式標(biāo)記的肽診斷性和治療性治療腫瘤性和非腫瘤性哺乳動(dòng)物疾病的方法，本發(fā)明還涉及使用所述肽篩選更有效藥物的方法。

背景技術(shù)：
環(huán)狀十四肽生長抑素-14(SRIF)最初從下丘腦分離并鑒定為生長激素(GH)從垂體前葉釋放的生理抑制劑。它由Guillemin等鑒定并描述于美國專利第3,904,594號。該十四肽在3-和14-位的兩個(gè)半胱氨酰氨基酸殘基的巰基之間具有橋連或環(huán)化鍵。SRIF影響多個(gè)細(xì)胞過程，還已知抑制某些腫瘤生長。類似物[D-Trp8]-SRIF具有氨基酸序列(環(huán)3-14)H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH，公開于美國專利第4,372,884號并據(jù)稱具有比SRIF大很多倍的抑制GH釋放的潛力。
SRIF通過與膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)上類似的受體家族相互作用而誘發(fā)其生物效應(yīng)。已經(jīng)克隆了5種SRIF受體并稱為SSTR 1-5。全部5種受體以高親和力結(jié)合SRIF和SRIF-28。SSTR2和SSTR5的選擇性拮抗劑已經(jīng)被確認(rèn)并用于揭示這些受體的不同功能。據(jù)信，這兩種受體是周緣組織中的主要亞型。據(jù)信，SSTR2介導(dǎo)生長激素、高血糖素和胃酸分泌的抑制。美國專利第5,846,934號描述了據(jù)稱對SSTR2具有一定特異性的類似物。奧曲肽是一種激動(dòng)劑，顯示對SSTR2的一定特異性(參見Yang等，1998，PNAS USA 9510836)。相反，SSTR5似乎主要參與控制胰島素和淀粉酶的釋放。國際公布第WO 97/11962號描述了據(jù)稱對SSTR5具有一定特異性的類似物。SSTR3介導(dǎo)胃平滑肌收縮的抑制。美國專利第6,579,967號公開了對SSTR3特異性的生長抑素類似物，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。SSTR4發(fā)現(xiàn)于腦下垂體、肺、胃腸道、腎和實(shí)質(zhì)上排除其他SRIF受體的某些腫瘤中；據(jù)信，它在被SRIF結(jié)合后即被活化。美國公布的專利申請第2002/0137676號公開了使用生長抑素受體選擇性配體治療內(nèi)皮細(xì)胞的方法，所述配體對SSTR1或SSTR4具有特異性。美國專利第5,750,499和7,019,109號公開了對SSTR1有選擇性的生長抑素肽類似物，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。公布的美國專利申請第2005/0245438號公開了對SSTR4特異性的受體-選擇性生長抑素肽類似物。所有這些發(fā)現(xiàn)說明，不同的受體亞型介導(dǎo)SRIF在體內(nèi)不同的功能。生長抑素受體以病理狀態(tài)、特別是胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤表達(dá)。大多數(shù)起源于生長抑素靶組織的人類腫瘤保留了它們的生長抑素受體。其首先在生長激素生成腺瘤和TSH生成腺瘤中發(fā)現(xiàn)；約一半的非分泌型腺瘤展示生長抑素受體。90％的類癌瘤和大多數(shù)胰島細(xì)胞癌(包括它們的轉(zhuǎn)移灶)通常具有高密度的生長抑素受體。然而，僅10％的結(jié)腸直腸癌和沒有外分泌型胰腺癌含有生長抑素受體。腫瘤中的生長抑素受體可以使用體外結(jié)合方法或使用體內(nèi)成像技術(shù)鑒定；后者允許在患者中精確定位腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶。因?yàn)槲改c胰腺腫瘤中的生長抑素受體是功能性的，所以它們的鑒定可以用來評估類似物抑制患者過量激素釋放的治療效力。
與SSTR2強(qiáng)力結(jié)合、同時(shí)顯示與其他4種受體僅最低結(jié)合傾向的生長抑素肽拮抗劑將值得擁有。因此，一直在尋找對SSTR2具有高度選擇性但不內(nèi)化入細(xì)胞的生長抑素肽拮抗劑。


發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了有效產(chǎn)生相對于其他克隆的SRIF受體對SSTR2有選擇性的SRIF肽類似物的某些修飾。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一類對SSTR2高選擇性的生長抑素肽類似物，其是生長抑素的拮抗劑，并且盡管不內(nèi)化于具有SSTR2受體的細(xì)胞，但令人驚訝地以比可比受體-選擇性生長抑素肽激動(dòng)劑大的量被攝取。得到的肽選擇性結(jié)合至克隆的SSTR2而不活化受體，這些肽類似物被碘化或以其他方式放射標(biāo)記時(shí)將保留其需要的生物性質(zhì)。因此，這些新肽可用于測定受體SSTR2的組織定位和細(xì)胞表達(dá)，以及用于調(diào)控某些藥理功能而無迄今施用SRIF所特有的某些伴隨的副作用。這些SRIF肽拮抗劑被放射標(biāo)記時(shí)，可以用于閃爍掃描法以使用SPECT或PET體外或體內(nèi)定位(即局部化)表達(dá)這些受體的腫瘤；或者可使用該領(lǐng)域公知的其他標(biāo)記，例如熒光標(biāo)記。當(dāng)它們包括適合的螯合的該領(lǐng)域已知的放射性核素時(shí)，這些類似物可以用作適合治療此類腫瘤的放射性核素療法的放射性藥物。
本發(fā)明的SRIF肽拮抗劑抑制25I-[Tyr11]SRIF和125I-[Leu8，D-Trp22，Tyr25]SRIF-28與克隆的人類受體SSTR2的結(jié)合，但是它們不強(qiáng)力結(jié)合SSTR1、SSTR3、SSTR4或SSTR5。因此，未標(biāo)記的拮抗劑可以被施用，以從治療上阻斷該受體發(fā)揮功能。例如已經(jīng)通過螯合劑(例如DOTA或DTPA)與99mTc、111In、68Ga或90Y偶聯(lián)的(或者為了連接用于診斷或治療的部分目的而在N末端連接另一絡(luò)合劑/軛合劑的)這些SRIF拮抗劑不顯著結(jié)合SSTR1、3、4或5，但有效且可飽和地結(jié)合至SSTR2。
優(yōu)選的SRIF拮抗劑不僅選擇性結(jié)合SSTR2，而且它們以高親和力與之結(jié)合。選擇性結(jié)合是指它們表現(xiàn)出的與SSTR2的KD或IC50是所有4種其他受體的KD或IC50的約1％或更低。優(yōu)選的類似物對SSTR2的選擇性是任何其他SRIF受體的至少約200倍，更優(yōu)選至少約500倍。這些SRIF類似物還可容易標(biāo)記，因此有效用于藥物篩選、成像、診斷和放射性核素療法。例如，帶有可檢測標(biāo)記的這些類似物可用于在體內(nèi)定位所述受體并診斷腫瘤、特別是神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的定位。作為放射性核素治療劑，它們被認(rèn)為特別用于抗表達(dá)SSTR2受體的腫瘤；而且，它們能夠無副作用地實(shí)現(xiàn)該用途，即，不會(huì)由于與多種SRIF受體相互作用而破壞相鄰組織的實(shí)質(zhì)部分。
在一個(gè)具體方面本發(fā)明提供選擇性結(jié)合SRIF受體SSTR2而不引發(fā)內(nèi)化入細(xì)胞的環(huán)狀生長抑素(SRIF)肽拮抗劑，所述肽包括氨基酸序列(環(huán)3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15，其中Xaa1是des-Xaa；Xaa2是Trp(A)、Phe(B)、Nal或Tyr，其中A是H、Cl、F、Br、Me、NO2、OMe或N-甲酰基且B是H、鹵素、CH3、NO2或OCH3；D-Xaa3是D-Cys、D-Pen、D-HCys或具有SH側(cè)鏈的另一種D-異構(gòu)體α-氨基酸Xaa4、Xaa5和Xaa6是des-Xaa；Xaa7是APh(Q1)、Tyr(X)、Ala(噻吩基)或Trp(A)，其中Q1是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm、OEt-Cbm、Cbm-Et(OEt)2或Hor，且X是H或鹵素；Xaa8是D-Trp(A)、Trp(A)、Tyr、D-Tyr、Phe(B)、D-Phe(B)、L或D-BzlHis、L或D-(DNP)His、L或D-Aph(Cbm)；Xaa9是Lys、NαMeLys、hLys、NαMehLys、Orn或NαMeOrn；Xaa10是Thr、Ser或Val；Xaa11、Xaa12和Xaa13是des-Xaa；Xaa14是Cys、Pen、hCys或具有SH側(cè)鏈的另一種L-異構(gòu)體α-氨基酸；并且Xaa15是2Nal、D-2Nal、Aph(Q2)、D-Aph(Q2)、(R1)Cha、(R1)D-Cha、(R1)Leu、(R1)D-Leu、Tyr、D-Tyr、Trp、D-Trp或de s-Xaa；其中R1是H或CαMe，且Q2是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm或OEt-Cbm。如本領(lǐng)域已知的，含有螯合劑的部分可以在N末端偶聯(lián)?？蛇x地，含有螯合劑的部分可以在肽的N末端絡(luò)合(例如生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng))至其補(bǔ)體。
在更具體方面本發(fā)明提供選擇性結(jié)合SRIF受體SSTR2的環(huán)狀生長抑素(SRIF)類似肽，該肽包括氨基酸序列環(huán)(3-14)Xaa1-Xaa2-D-Cys-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys-Xaa15-NH，其中Xaa1是des-Xaa；Xaa2是氯代或硝基Phe；Xaa4、Xaa5和Xaa6是des-Xaa；Xaa7是Aph(Hor)、Tyr或ITyr；Xaa8是D-Aph(Cbm)或D-Trp；Xaa9是Lys、Orn、hLys、NαMeLys或NαMeOrm；Xaa10是Thr；Xaa11、Xaa12和Xaa13是des-Xaa；且Xaa15是2Nal或D-Tyr。
在進(jìn)一步具體方面，本發(fā)明提供了在外部對表達(dá)SSTR2的人體組織成像的方法，該方法包括(i)以足以外部成像的量為人類施用包含SRIF肽拮抗劑的組合物，所述SRIF肽拮抗劑相對于其他克隆的SRIF受體對SSTR2具有選擇性并以高親和力結(jié)合至克隆的人受體SSTR2但不活化該受體，所述SRIF肽拮抗劑帶有可檢測標(biāo)記；和(ii)對人類進(jìn)行外部成像。
在另一具體方面，本發(fā)明提供了照射表達(dá)SSTR2的人體腫瘤組織的方法，該方法包括(i)以足以照射腫瘤組織的量為人類施用包含SRIF肽拮抗劑的組合物，所述SRIF肽拮抗劑相對于其他克隆的SRIF受體對SSTR2具有選擇性并以高親和力結(jié)合至克隆的人受體SSTR2但不活化該受體，所述SRIF肽拮抗劑帶有可檢測標(biāo)記；和(ii)使所述SRIF肽拮抗劑結(jié)合至腫瘤組織。
在另一具體方面，本發(fā)明提供在人體內(nèi)檢測組織中具有SSTR2的腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的方法，所述組織在健康狀態(tài)或慢性炎癥的非腫瘤情況下不含有實(shí)質(zhì)量的SSTR2，所述方法包括(i)以足以外部成像的量為所述人施用包含權(quán)利要求1的肽的組合物，所述肽用(a)經(jīng)適合螯合劑連接的放射性金屬同位素或(b)藥物金屬原子標(biāo)記，或者用放射性鹵素同位素標(biāo)記，和此后(ii)通過放射性掃描或通過磁共振成像對所述人進(jìn)行外部成像，以確定其體內(nèi)相對于本底放射性的靶向部位，以實(shí)現(xiàn)所述腫瘤在體內(nèi)的半定量檢測和定位。
本發(fā)明進(jìn)一步提供使用藥效團(tuán)模型篩選對SSTR2高度選擇性的配體的方法，所述藥效團(tuán)模型基于被確定是選擇性結(jié)合所需要的配體特征模式。所述方法可以包括使用SSTR2受體、本發(fā)明配體和候選拮抗劑進(jìn)行競爭性結(jié)合測定，其中所述配體具有適合的可檢測標(biāo)記；測定所述候選拮抗劑取代標(biāo)記配體的能力；和測試所述候選拮抗劑拮抗SRIF相關(guān)活性的能力。

具體實(shí)施例方式 優(yōu)選實(shí)施方案詳述 標(biāo)準(zhǔn)3字母縮寫標(biāo)示α-氨基酸殘基，并且其中氨基酸殘基具有異構(gòu)形式，除非另外明確指明，其是所標(biāo)示氨基酸的L形式，例如Ser＝L-絲氨酸。L或D指特定α-氨基酸的D和L異構(gòu)體。當(dāng)本文提及肽位置時(shí)，是指天然14-殘基生長抑素(SRIF)肽的相應(yīng)位置。
提供對受體SSTR2具有選擇性親和力的SRIF肽拮抗劑；它們優(yōu)選還具有對SSTR2的高親和力，即等于約10納摩爾或更小的KD。這些肽包括SRIF的縮短的環(huán)狀類似物，其中環(huán)部分被縮短至僅6個(gè)殘基，并且其中N末端存在一個(gè)殘基，并且優(yōu)選還在C末端加一個(gè)殘基。換言之，1-，4-，5-，6-，H-，12-和13-位殘基從14-殘基天然SRIF中缺失，產(chǎn)生七肽，并且優(yōu)選還在C末端增加殘基(即殘基15)，產(chǎn)生八肽。
表現(xiàn)出對SSTR2預(yù)期特異性的代表性肽拮抗劑的例子由下述氨基酸序列提供，其基于與天然哺乳動(dòng)物SRIF的14-殘基序列一致的編號系統(tǒng)，其中位置1、4-6和11-13的殘基優(yōu)選被去除(環(huán)3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15，其中Xaa1是des-Xaa；Xaa2是Trp(A)、Phe(B)、Nal或Tyr，其中A是H、Cl、F、Br、Me、NO2、OMe或N-甲?；褺是H、鹵素、CH3、NO2或OCH3；D-Xaa3是D-Cys、D-Pen、D-HCys或具有SH側(cè)鏈的另一種D-異構(gòu)體α-氨基酸；Xaa4、Xaa5和Xaa6是des-Xaa；Xaa7是APh(Q1)、Tyr(X)、Ala(噻吩基)或Trp(A)，其中Q1是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm、OEt-Cbm、Cbm-Et(OEt)2或Hor，且X是H或鹵素；Xaa8是D-Trp(A)、Trp(A)、Tyr、D-Tyr、Phe(B)、D-Phe(B)、L或D-BzlHis、L或D-(DNP)His、L或D-Aph(Cbm)；Xaa9是Lys、NαMeLys、hLys、NαMehLys、Orn或NαMeOrn；Xaa10是Thr、Ser或Val；Xaa11、Xaa12和Xaa13是des-Xaa；Xaa14是Cys、Pen、hCys或具有SH側(cè)鏈的另一種L-異構(gòu)體α-氨基酸；并且Xaa15是2Nal、D-2Nal、Aph(Q2)、D-Aph(Q2)、(R1)Cha、(R1)D-Cha、(R1)Leu、(R1)D-Leu、Tyr、D-Tyr、Trp、D-Trp或des-Xaa；其中R1是H或CαMe，且Q2是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm或OEt-Cbm。2位的Tyr可以是放射性碘化的，或者絡(luò)合劑、軛合劑或螯合劑可以直接或經(jīng)連接體連接至這些肽類似物的任何一個(gè)的N末端殘基的α-氨基，其能夠?qū)⒎派湫院怂剡B接其上。例如，大環(huán)螯合劑(例如DOTA)可以通過使其直接結(jié)合至Xaa2或使用連接體加在N末端，所述連接體例如GABA(γ氨基丁酸，參見例如美國專利第6,022,523號)或βAla。
SRIF類似物的一個(gè)優(yōu)選的亞類包括氨基酸序列(環(huán)3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Lys-Thr-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys，其中Xaa2是取代的Phe；D-Xaa3是D-Cys；Xaa7是Aph(Q1)、Tyr或ITyr；且Xaa8是D-Trp或D-Aph(Cbm)。應(yīng)理解，其他Xaa基團(tuán)在未被指定時(shí)則如上文所定義。
一般為本申請目的，除具體實(shí)施例外的說明書中提及Trp和D-Trp應(yīng)理解為包括未取代的殘基以及其中在Trp的5-位或6-位進(jìn)行單個(gè)氫取代的殘基，這樣的取代基選自氯、氟、溴、甲基、硝基和甲氧基，且鋁、氟和溴是優(yōu)選的，或者甲酰基取代吲哚N的氫。Nal指在β-碳原子上被萘基取代的丙氨酸的異構(gòu)體，與萘的連接優(yōu)選在環(huán)的2-位或者任選在1-位。Aph指氨基苯基丙氨酸，其中氨基優(yōu)選連接至苯環(huán)的4-位，但在2-或3-位的連接一般是等同的。Aph(Cbm)指4-脲基-苯丙氨酸。Aph(OH-Cbm)指4-(3-羥基)-脲基-苯丙氨酸。Aph(CH3-Cbm)指4-(3-甲基)-脲基-苯丙氨酸。Aph(OCH3-Cbm)指4-(3-甲氧基)-脲基-苯丙氨酸。Aph[(EtO)2Et-Cbm]指4-{3-[2-(2-乙氧基-乙氧基)-乙基]}-脲基-苯丙氨酸。ITyr指碘化的L-酪氨酸，例如3-碘-Tyr。Cpa指氯代-Phe且優(yōu)選4ClPhe。Aph(Hor)指4-[(2，6-二氧-六氫-嘧啶-4-羰基)-氨基]-苯丙氨酸。SRIF指14-殘基環(huán)肽生長抑素。Cha指環(huán)己基丙氨酸，且Pen指青霉胺(β-巰基纈氨酸)。hLys或hCys指側(cè)鏈具有另外一個(gè)CH2基團(tuán)的α-氨基酸。
C末端通常被酰胺化，盡管是等同的，例如可以使用Gly-OH。N末端可以各種方式修飾而對結(jié)合親和力無顯著負(fù)面影響，認(rèn)為這些環(huán)狀肽中所有這些修飾被包括為本整體發(fā)明的肽的一部分。例如，可以進(jìn)行多種添加，優(yōu)選以絡(luò)合劑或軛合劑形式(Z)添加至N末端氨基酸，然后Z可以用于將需要的部分結(jié)合至肽或提供標(biāo)記。一般而言，這樣的部分Z可以選自基于DOTA和DTPA的螯合劑、基于NOTA的螯合劑、羰基、2-肼基尼克酰胺(HYNIC)、N4-螯合劑、去鐵胺和NxSy-螯合劑，全部任選與放射性同位素、用于鹵代的酪氨酸(Tyr)、熒光染料和生物素絡(luò)合。Cpa還可用作氚化前體。例如，可以連接螯合劑，例如DTPA、DOTA、HYNIC和P2S2-COOH；優(yōu)選螯合劑可以包括p-NH2-Bz-DOTA(2-p-氨基芐基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸)和DOTA-p-NH2-苯胺[1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸單(對氨基苯胺)]?？蛇x地，螯合劑可以按需要經(jīng)適合連接體(L)共價(jià)連接至N末端；適合的連接體L包括酪氨酸、賴氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、聚乙二醇、脂肪酸及其衍生物、β-丙氨酸、5-氨基戊酸、肌氨酸和gluceronic acid。當(dāng)Tyr出現(xiàn)在N末端時(shí)，其可以被放射性碘化或者以其他方式標(biāo)記。具有不超過約20個(gè)氨基酸的?；部梢源嬖谟贜末端，因?yàn)镹末端殘基也可以按需要用大部分?；粨p失特異性。
本發(fā)明類似肽結(jié)合SSTR2的選擇性已經(jīng)通過測試它們與五種不同克隆的人SRIF受體的相互作用得到證明，下文將非常詳細(xì)地描述。一般而言，表達(dá)受體的重組細(xì)胞經(jīng)洗滌和勻化以制備本領(lǐng)域已知的適合緩沖液中的粗蛋白勻漿。在典型分析中，細(xì)胞勻漿中一定量的蛋白被放入小體積的適當(dāng)pH下的適當(dāng)分析緩沖液。候選物質(zhì)(例如可能的SRIF激動(dòng)劑和拮抗劑)以合宜濃度被加至混合物，監(jiān)測候選物質(zhì)與受體多肽的相互作用。本發(fā)明肽基本上僅強(qiáng)力結(jié)合至SSTR2，并且它們的結(jié)合表現(xiàn)出高親和力。
受體結(jié)合分析針對克隆的SRIF受體進(jìn)行，競爭性分析用于產(chǎn)生指示從50％結(jié)合位點(diǎn)替換飽和濃度的測量靶配體所必須的競爭性配體的濃度的IC50值。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面，手術(shù)期間檢測健康情況下不含有實(shí)質(zhì)量的SSTR2的人體組織中惡性腫瘤的方法，包括(i)以足以被γ檢測探針檢測的量為這樣的人施用包含SSTR2-選擇性肽的組合物，所述肽例如用111Tc、161Tb、90Y、177Lu、123I或125I放射性標(biāo)記，和(ii)在使活性物質(zhì)在所述腫瘤中被結(jié)合并攝取后以及在血液清除放射性后，使這樣的人接受在機(jī)體相關(guān)區(qū)域使用γ檢測探針的放射檢測技術(shù)。
本發(fā)明SRIF拮抗劑對SSTR2是高度選擇性的，并且它們以比對SSTR2僅部分特異性的早期SRIF肽激動(dòng)劑更大量被攝取。更重要的是，SRIF拮抗劑被認(rèn)為可用于使用放射療法抵抗表達(dá)SSTR2的癌癥，其中放射療法的成功直接取決于腫瘤攝取放射的量；因此，它們預(yù)期比已知激動(dòng)劑更有效用于腫瘤放射療法。當(dāng)然，它們也被認(rèn)為特別用于閃爍掃描法以測定表達(dá)SSTR2的細(xì)胞和組織在全身的分泌，通過放射性掃描或通過磁共振的外部成像的使用允許在體內(nèi)半定量檢測。它們進(jìn)一步用于選擇性阻斷由SSTR2介導(dǎo)的某些藥理效應(yīng)，在過去20年已經(jīng)確定了SRIF的許多效應(yīng)。
更具體說，這些放射性拮抗劑被認(rèn)為特別用于治療性治療人體組織中的惡性腫瘤，所述組織在健康情況下不含油實(shí)質(zhì)量的SSTR2。這樣的SSTR2-選擇性肽拮抗劑以包括有效用于閃爍掃描法或抗擊或控制腫瘤的量的組合物施用，并且可以用選自下述組的同位素標(biāo)記186Re、188Re、111In、113mIn、71As、90Y、64Cu、67Cu、99mTc、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、66Ga3、67Ga、68Ga、72Ga、127Te、195Pt、211At、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh、111Ag、124I和131I。
本發(fā)明的標(biāo)記SRIF類似物還被認(rèn)為用于藥物篩選分析，以篩選與SSTR2高親和力結(jié)合并可能是高選擇性拮抗劑的新的有效的肽和非肽藥劑。使用對受體SSTR2選擇性的本發(fā)明配體，可以獲得重組生成的受體的基線活性。然后使用SSTR2、標(biāo)記配體和候選物進(jìn)行競爭性結(jié)合以確定其相對結(jié)合親和力?？蛇x地，受體功能抑制劑或修飾劑(即，拮抗劑)的有前景的候選物可以直接加入測試混合物以測試這種候選物對受體的作用。通過比較在候選物質(zhì)存在或不存在下的受體活性程度，則可以獲得有關(guān)候選物質(zhì)對受體正常功能的作用信息，并因此確定其與已知SSTR2選擇性類似物相比較作為激動(dòng)劑或拮抗劑的功能。下述實(shí)施例中描述的環(huán)狀SRIF肽是拮抗劑，并且它們用于介導(dǎo)SSTR2的正常功能。
本發(fā)明的肽可通過經(jīng)典液相合成方法合成，但是酰胺化的肽優(yōu)選通過固相技術(shù)合成，如在本領(lǐng)域公知的甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂或BHA樹脂上。具有游離羧基C末端的肽優(yōu)選按照美國專利第7,019,109號的教導(dǎo)合成。具有酰胺化的C末端的肽可以按照美國專利第5,874,227號合成。固相合成以在C末端開始的鏈中逐步添加氨基酸的方式進(jìn)行，方式提出于那些美國專利的任何一個(gè)中，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。本領(lǐng)域公知的側(cè)鏈保護(hù)基優(yōu)選包括為具有特定反應(yīng)性側(cè)鏈的任何氨基酸的部分，并任選可用于其他情況，例如當(dāng)這種氨基酸偶聯(lián)至構(gòu)建于樹脂上的鏈上時(shí)的Trp。這樣的合成提供完全保護(hù)的中間體肽樹脂。一般而言，在氧化產(chǎn)生Cys側(cè)鏈之間二硫鍵之前分離保護(hù)劑并使肽從樹脂支持體裂解。
本發(fā)明的SRIF類似物一般在小于100毫克/千克體重的水平上是有效的。對于延長作用，可能需要使用約0.1至約2.5毫克/千克體重的劑量水平。這些類似物可溶于水并因此可以相對濃縮的施用溶液制備。
下述實(shí)施例示例說明實(shí)施本發(fā)明各個(gè)特征的多種SRIF肽拮抗劑的提供。在每種肽中，位置3和14的半胱氨酸通過環(huán)化二硫鍵結(jié)合。
實(shí)施例1 合成生長抑素類似物DOTA-des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，Tyr7，D-4Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2，具有結(jié)構(gòu)
使用采用BOC策略的固相方法以逐步方式在MBHA樹脂上合成八肽，大體上如’277專利實(shí)施例II所述。Boc-D-4Aph(Cbm)-OH如Jiang早期公布所述預(yù)制備并在位置8偶聯(lián)。
通過HF從樹脂裂解肽并同時(shí)去除側(cè)鏈保護(hù)劑(除了來自Lys的Fmoc)后，通過添加10％碘甲醇溶液直至得到的溶液保持橙色，然后攪拌40分鐘并用抗壞血酸淬滅，肽在75％乙酸中被氧化產(chǎn)生二硫鍵。粗肽通過制備型RP-HPLC純化，使用從基線％B(洗脫劑A＝0.1％TFA，洗脫劑B＝60％CH3CN，40％A)以100ml/min的流速1％B/1min增量的線性梯度。然后通過向干N，N-二甲基酰胺(DMF，3.5ml)中的純化肽(32mg-20μM)添加在DMF(1ml)中的DOTA-NHS.3TFA.HPF6(Macrocyclics，Dallas，TX)(198mg，-20μM)和N，N’-二異丙基乙胺(DIPEA)(36μl，-22μM)，在N末端偶聯(lián)作為螯合劑的DOTA?；旌衔镌谑覝?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)過程之后是分析HPLC，MS分析顯示，已經(jīng)獲得了想要的產(chǎn)物，純DOTA-des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，Tyr7，D-4Aph(Cbm)8，Lys(Fmoc)9]-SRIF-2Nal-NH2。反應(yīng)結(jié)束后，通過添加20％哌啶的DMF溶液4ml并等待30分鐘而實(shí)現(xiàn)從Lys9側(cè)鏈去除Fmoc保護(hù)基。DOTA-des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，Tyr7，D-4Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2，使用上述相同條件通過制備型RP-HPLC去鹽。最終環(huán)狀DOTA-肽-軛合物的純度通過分析型CZE測定。其是94％純的。
MS分析顯示，1583.72Da的[M+H]+質(zhì)量與1583.62Da計(jì)算質(zhì)量很相當(dāng)。該肽在下文稱為1號肽。
實(shí)施例2 重復(fù)實(shí)施例1中描述的初始合成，有兩處改變；4Aph(Cbm)和D-Trp用于7-和8-位以提供八肽-樹脂；des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，4Aph(Cbm)7，D-Trp8，Lys(Fmoc)9]-SRIF-2Nal-MBHA樹脂。
通過HF從樹脂裂解肽為酰胺并同時(shí)去除側(cè)鏈保護(hù)劑(除了來自Lys的Fmoc)后，通過添加10％碘甲醇溶液直至得到的溶液保持橙色，然后攪拌40分鐘并用抗壞血酸淬滅，肽在75％乙酸中被氧化產(chǎn)生二硫鍵。粗肽通過制備型RP-HPLC純化，使用從基線％B(洗脫劑A＝0.1％TFA，洗脫劑B＝60％CH3CN，40％A)以100ml/min的流速1％B/1min增量的線性梯度。然后通過向干N，N-二甲基酰胺(DMF，3.5ml)中的純化肽(34mg-24μM)添加在DMF(150μl)中的DOTA-NHS.3TFA.HPF6(Macrocyclics，Dallas，TX)(24mg，24.2μM)和N，N’-二異丙基乙胺(DIPEA)(40μl，24μM)，在N末端偶聯(lián)作為螯合劑的DOTA。混合物在室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)過程之后進(jìn)行分析HPLC，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)混合物添加1ml哌啶以從Lys9側(cè)鏈去除Fmoc保護(hù)基，持續(xù)30分鐘，產(chǎn)生DOTA-des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，4Aph(Cbm)7，D-Trp8]-SRIF-2Nal-NH2，其具有下式
該肽使用上述相同條件通過制備型RP-HPLC去鹽。最終環(huán)狀DOTA-肽-軛合物的純度通過分析型CZE測定為約98％純。MS分析顯示1606.50Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1606.64Da很相當(dāng)。其被稱為2號肽。
實(shí)施例3 重復(fù)實(shí)施例1中提出的合成，省去C末端的2Nal并用4Aph(Hor)替代Tyr7。按照G.Jiang，J.Stalewski等，(2001).″GnRHantagonistA new generation of long acting analoguesincorporating urea functions at positions 5and 6″，J.Med.Chem.44(3)453-467早先公布中描述的預(yù)制備Boc-4Aph(Hor)-OH。按照實(shí)施例1進(jìn)行肽的裂解、去保護(hù)、環(huán)化和純化。純化的環(huán)狀肽具有下式
根據(jù)CZE其純度為約98％。其被稱為3號肽。MS分析顯示1525.68Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1525.58Da很相當(dāng)。
實(shí)施例4 重復(fù)實(shí)施例1中提出的合成，具有一個(gè)改變，使用pNO2-Phe替代N末端的pCl-Phe。按照實(shí)施例1進(jìn)行肽的裂解、去保護(hù)、環(huán)化和純化。純化的環(huán)狀肽具有下式
根據(jù)CZE其純度為約98％。其被稱為4號肽。MS分析顯示1594.17Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1594.65Da很相當(dāng)。
實(shí)施例5 重復(fù)實(shí)施例1中描述的初始合成，具有一個(gè)改變；使用Aph(Hor)替代7位的Tyr以提供八肽-樹脂des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，4Aph(Hor)7，D-Aph(Cbm)8，Lys(Fmoc)9]-SRIF-2Nal-MBHA樹脂。然后按照實(shí)施例2進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生DOTA-des-AA1，4，5，6，11，12，13[Cpa2，D-Cys3，4Aph(Hor)7，D-Aph(Cbm)8]-SRIF-2Nal-NH2，，其具有下式
最終環(huán)狀DOTA-肽-軛合物的純度通過分析型CZE測定為約98％純。其被稱為5號肽。MS分析顯示1722.56Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1722.65Da很相當(dāng)。
實(shí)施例6 重復(fù)實(shí)施例5中提出的合成，用D-Tyr替代C末端的2Nal。按照實(shí)施例1進(jìn)行肽的裂解、去保護(hù)、環(huán)化和純化。純化的環(huán)狀肽具有下式

根據(jù)CZE其純度為約98％。其被稱為6號肽。MS分析顯示1688.83Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1688.64Da很相當(dāng)。
實(shí)施例7 重復(fù)實(shí)施例4中提出的合成，用D-Tyr替代C末端的2Nal。按照實(shí)施例1進(jìn)行肽的裂解、去保護(hù)、環(huán)化和純化。純化的環(huán)狀肽具有下式
根據(jù)CZE其純度為約98％。其被稱為7號肽。MS分析顯示1560.63Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1560.83Da很相當(dāng)。
實(shí)施例8 重復(fù)實(shí)施例7中描述的合成，具有兩個(gè)改變；在7位使用Ityr并在8位使用D-Trp以提供八肽-樹脂de s-AA1，4，5，6，11，12，13[pNO2-Phe2，D-Cys3，ITyr7，D-Trp8，Lys(Fmoc)9]-SRIF-D-Tyr-MBHA樹脂。
從樹脂裂解肽為酰胺并進(jìn)行大體上如實(shí)施例2所述反應(yīng)之后，獲得具有下式的肽

最終環(huán)狀DOTA-肽-軛合物的純度通過分析型CZE測定為約98％純。其被稱為8號肽。MS分析顯示1667.74Da的[M+H]+質(zhì)量，與計(jì)算值1667.52Da很相當(dāng)。
體外生物分析體外測試了各種生物抑素類似物的效應(yīng)，它們結(jié)合分離克隆的、CHO-K1細(xì)胞和CCL39細(xì)胞上表達(dá)的受體的能力。在37℃下含有5％CO2的增濕空氣中，CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)于Ham’s F-12培養(yǎng)基，CCL39細(xì)胞培養(yǎng)于添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/Ham’s F-12(1∶1)混合物。
編碼多種生長抑素受體亞型的基因的分子克隆允許這些受體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的個(gè)體表達(dá)并鑒定它們各自的藥理學(xué)特征。被稱為SSTR1至SSTR5的五種這樣的受體亞型已經(jīng)被克隆并被報(bào)道和描述于Raynor等，Molecular Pharmacology，43，838-844(1993)和Raynor等，Molecular Pharmacology，44，385-392(1993)。這些參考文獻(xiàn)描述了可以用于確定特定SRIF類似物是否特異性結(jié)合5種受體型的一種或多種的結(jié)合分析。因?yàn)槟壳耙呀?jīng)大體上鑒定了這些受體型的藥理學(xué)特征，所述結(jié)合研究的結(jié)果信息以及這些受體在體內(nèi)的獨(dú)特分布模式信息說明，每種受體亞型可以介導(dǎo)不同但交錯(cuò)的SRIF藥理效應(yīng)。因此，特異性結(jié)合受體SSTR2的化合物例如可以用于調(diào)節(jié)特定的SRIF生理功能，而不可能具有其他SRIF受體介導(dǎo)的另一種SRIF生理功能所產(chǎn)生的不想要的效應(yīng)。
細(xì)胞用冰冷0.05M Tris-HCl(pH 7.4)洗滌兩次并刮入冰冷0.05M Tris-HCl(pH 7.4)，離心收集，使用旋轉(zhuǎn)器/定子/系統(tǒng)在相同緩沖液中勻化。4℃下120g離心5分鐘后，收集上清液并在4℃下48,000g再次離心30分鐘。得到的沉淀重懸于冰冷Tris緩沖液，轉(zhuǎn)入微量離心管，在4℃下20,000g離心15分鐘。抽掉上清液后，膜沉淀-80℃保存。
對固定在顯微鏡載玻片上的所述膜沉淀的20μm厚冷凍切片進(jìn)行受體放射自顯影，然后-20℃保存。對于每種測試化合物，使用強(qiáng)親和力結(jié)合所有五種受體的通用生長抑素配體放射性配體125I-[Leu8，D-Trp22，Tyr25]-生長抑素28進(jìn)行完整的替代實(shí)驗(yàn)。使用范圍0.1-1000nM的漸增的未標(biāo)記肽濃度。使用相同的漸增濃度平行運(yùn)行未標(biāo)記的生長抑素-28，作為對照。使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)輔助圖像處理系統(tǒng)量化數(shù)據(jù)后計(jì)算IC50值。濃度為100nM時(shí)，1號肽對SRIF-28放射性配體與SSTR1、SSTR3、SSTR4和SSTR5結(jié)合的影響最小。相比之下，它特異性結(jié)合SSTR2，替代放射性配體與人SSTR2的結(jié)合，IC50值約1.8nM。
某些SRIF類似物抑制125I-[Leu8，D-Trp22，Tyr24]SRIF-28與各種克隆人SRIF受體結(jié)合的潛力示于下表，其中IC50值以納摩爾濃度給出。括號中的數(shù)字表示特定結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行的次數(shù)。
表
而且，所有被測試并報(bào)告于上表中的肽顯示沒有明顯的內(nèi)化入細(xì)胞，同時(shí)拮抗奧曲肽誘導(dǎo)的內(nèi)化。1號肽和4至8號肽在體內(nèi)表現(xiàn)出非常好的結(jié)合性質(zhì)和優(yōu)良的腫瘤靶向性質(zhì)，即在4h和24h大量攝取入sst2腫瘤，以及優(yōu)良的腫瘤腎臟比率；因此，腫瘤攝取可以被過量的冷肽阻斷。
本發(fā)明肽不僅提供更選擇性結(jié)合SSTR2的配體，而且提供了標(biāo)記肽(例如放射性標(biāo)記的1號肽形式)促進(jìn)藥物篩選甚至更有效拮抗劑的用途。篩選分析是本領(lǐng)域公知的，其采用直接來自重組宿主的受體多肽SSTR2，可以用于鑒定用于按需要阻斷或模擬的生長抑素的某些方面、同時(shí)消除可能產(chǎn)生于其他受體活化或阻斷的不希望的激素方面的物質(zhì)。就這點(diǎn)而言，如果需要放射性配體用于篩選目的，則Tyr可以在N末端添加而替代DOTA，或者Tyr可以用于2位而替代Cpa，或者適合的放射性配體可以通過DOTA螯合劑連接。候選化合物的競爭性結(jié)合分析可以首先以該方式對SSTR2進(jìn)行以尋找高結(jié)合親和力；然后通過篩選多種SRIF受體，可以確認(rèn)是否如預(yù)期僅對該受體選擇性結(jié)合。本發(fā)明的非放射性標(biāo)記肽可以用于治療所有已知表達(dá)SSTR2的器官的疾病，包括肺、胃腸道和腎。
因?yàn)槿缟纤?，向SRIF類似物的N末端添加沒有表現(xiàn)出負(fù)面影響選擇性結(jié)合，應(yīng)該清楚，這些化合物可以與放射性核素絡(luò)合以使這些物質(zhì)運(yùn)載至希望凋亡的腫瘤或其他組織。例如，如上文所述，可以使用適合的螯合劑(例如DOTA或DTPA或其他)使SRIF類似物與高放射性金屬絡(luò)合。用于螯合放射性金屬原子的適合螯合基團(tuán)的一些例子是四齒螯合劑或基團(tuán)，衍生自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺戊乙酸(DTPA)、環(huán)己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-0，0’-雙(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、N，N-雙(羥基芐基)-乙二胺-N，N’-二乙酸(HBED)、三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)，1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N’”-四乙酸(DOTA)、羥基乙基二胺三乙酸(HEDTA)、1，4，8，11-四氮雜環(huán)-十四烷-N，N’，N″，N’″-四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA。其他螯合劑以及放射性物質(zhì)公開于WO 95/22341和WO 04/082722以及美國專利公布2004/0242842和2005/0070470，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。優(yōu)選的螯合劑衍生自EDTA和DOTA。一些適合的鹽是111In-8-羥基喹啉鹽和99mTc-酒石酸鹽，其一般可以在對肽拮抗劑無害的條件下以簡單方式生成，并且99mTc(CO)3可以經(jīng)Tyr或適合的三齒螯合劑偶聯(lián)。
如果需要，SRIF拮抗劑的溶解度可以通過以下方式提高使用親水化合物(例如氫乳清酸(Hor)或類似物)對N末端氨基酰化，或者與適合異氰酸酯(例如異氰酸甲酯或異氰酸異丙酯)反應(yīng)以在N末端產(chǎn)生脲部分。其他試劑也可以是N末端連接的，如本領(lǐng)域已知的，這將增加SRIF拮抗劑作用的持續(xù)時(shí)間。
這些SRIF拮抗劑或其非毒性鹽與藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體混合生成藥物組合物，可以靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮(例如鼻內(nèi))、腦髓內(nèi)或口服施用至動(dòng)物，包括人和其他哺乳動(dòng)物。被設(shè)計(jì)用于檢測人類組織中的惡性腫瘤(包括其轉(zhuǎn)移)的這樣的藥物組合物可以包括藥學(xué)可接受的載體物質(zhì)和任選的藥學(xué)可接受佐劑，作為活性物質(zhì)的足以外部成像、γ檢測探針檢測或抗擊或控制腫瘤的量的標(biāo)記肽拮抗劑。肽拮抗劑應(yīng)該至少約90％純，并且優(yōu)選應(yīng)該具有至少約98％的純度；然而，更低的純度是有效的，并且可以很好地用于非人的哺乳動(dòng)物。該純度指想要的肽構(gòu)成存在的所有類似肽和肽片段的所述重量％。對人的施用應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師判斷以抗擊特定腫瘤和癌癥或介導(dǎo)其中SSTR2受體發(fā)揮控制功能的其他狀態(tài)，例如偶聯(lián)至酪氨酸磷酸酶以便可以刺激該酶以介導(dǎo)SRIF的抗增殖效應(yīng)。需要的劑量將隨待治療的特定狀態(tài)、狀態(tài)的嚴(yán)重度和需要治療的持續(xù)時(shí)間而改變。
最近已確定，腫瘤經(jīng)常表達(dá)幾種類型的肽受體(Reubi，J.C；Waser，B.Concomitant expression of several peptide receptorsin neuroendocrine tumoursmolecular basis for in vivomultireceptor tumour targeting.Eur.J.Nucl.Med.Molec.Imaging 2003，30，781-793.)。這樣的多種肽受體組可以包括sst2受體以及蛙皮素受體、CCK受體、VIP受體、GLP-1受體、神經(jīng)緊張肽受體、胰泌素受體、神經(jīng)介素B受體和CRF受體等。在這種情況下，SSTR2拮抗劑與這些各種受體的一種或多種放射性標(biāo)記的拮抗劑作為混合物組合的施用應(yīng)該非常明顯提高所述腫瘤的體內(nèi)靶向。
這樣的肽拮抗劑經(jīng)常以藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的非毒性鹽形式施用，所述鹽形式例如酸加成鹽或金屬絡(luò)合物，例如與鋅、鐵、鈣、鋇、鎂、鋁或類似金屬的絡(luò)合物。所述非毒性鹽的示例有鹽酸鹽、溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、鞣酸鹽、草酸鹽、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、藻酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、抗壞血酸鹽等。
可能需要在延長的時(shí)期遞送這些SRIF拮抗劑，例如從單次施用持續(xù)一周至一年的時(shí)期，可以如本領(lǐng)域公知的使用緩釋、貯藏或植入劑量形式。例如，劑量形式可以含有在體液中具有低溶解度的化合物的藥學(xué)上可接受的非毒性鹽，例如與多元酸的酸加成鹽；與多價(jià)金屬陽離子的鹽；或兩種鹽的組合。相對不溶的鹽可以配制成凝膠，例如硬脂酸鋁凝膠。適合的緩釋貯藏注射制劑也可以含有SRJF拮抗劑或其鹽，分散或包封入緩慢降解的非毒性或非抗原性聚合物，例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物，例如美國專利3,773,919所描述的。
治療有效量的肽拮抗劑應(yīng)該在醫(yī)師指導(dǎo)下施用，藥物組合物通常含有與常規(guī)藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體結(jié)合的肽。治療有效量被認(rèn)為是經(jīng)計(jì)算達(dá)到預(yù)期效果的預(yù)定量。所需劑量將隨特定治療和所需治療的持續(xù)時(shí)間而變化；然而，預(yù)期約10微克至約1毫克/千克體重/每天的劑量將用于治療性治療?？赡芴貏e有利的是施用諸如早期所述的貯藏或長效形式的化合物。治療有效量通常是SRIF拮抗劑以生理學(xué)可接受組合物外周施用(例如靜脈內(nèi))時(shí)足以實(shí)現(xiàn)其約0.1μg/ml至約100μg/ml、優(yōu)選約1μg/ml至約50μg/ml、更優(yōu)選至少約2μg/ml和通常5至10μg/ml的血漿濃度的量。在這些量中，它們可以用于按需要影響胃分泌。
當(dāng)組合物用于成像或治療性治療時(shí)，放射性標(biāo)記化合物和/或短半衰期的放射性核素的差貯存期限可能要求使用者在臨床醫(yī)院或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行放射性核素標(biāo)記反應(yīng)。在這種情況下，各種反應(yīng)成分可以所謂“試劑盒”形式提供給使用者。進(jìn)行預(yù)期反應(yīng)所必需的操作應(yīng)該盡可能簡單以使使用者能夠從試劑盒制備放射性標(biāo)記的組合物，使用正常是一次性的設(shè)施。因此，制備放射性藥物組合物、檢測和定位組織中的惡性腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶的試劑盒可以包括(i)SSTR2選擇性肽、惰性藥學(xué)可接受載體和/或配制劑，以及任選佐劑，(ii)放射性金屬同位素的鹽或螯合物溶液，和(iii)帶有使試劑盒中存在的成分反應(yīng)的指令的使用說明書。
優(yōu)選地，用作所述試劑盒的肽拮抗劑已經(jīng)通過與螯合劑(例如上文定義的螯合劑)的反應(yīng)而衍生。得到的肽軛合物提供以簡單方式緊固連接放射性核素的設(shè)施。用于修飾肽的適合螯合劑詳細(xì)描述于上文。含N的二乙酸或聚乙酸或它們的衍生物(例如上文提到的化合物)已經(jīng)被證實(shí)主要適合連接各種金屬放射性核素(例如111In和113mIn)至肽分子。提供給使用者的試劑盒還可以包括其他上述成分以及使用說明書，而具有有限的貯存期限的放射性核素的鹽或螯合物溶液可以分開提供給使用者。
例如，制備用99mTc、186Re或188Re標(biāo)記的放射性藥物組合物的試劑盒可以包括上文(i)和(ii)中所述的成分以及還原劑和按需要的螯合劑，和(iii)使用說明書，有使試劑盒成分與高锝酸鹽溶液形式的99mTc或與高錸酸鹽溶液形式的186Re或188Re反應(yīng)的指令。如果需要，試劑盒的各種成分可以混合，條件是它們是相容的。試劑盒應(yīng)該包括還原高锝酸鹽或高錸酸鹽的還原劑，例如連二亞硫酸鹽、金屬還原劑或穩(wěn)定絡(luò)合物的還原劑，例如SnCl2、酒石酸鹽錫(II)、膦酸錫(II)或焦磷酸錫(II)、或葡庚酸錫(II)。高锝酸鹽溶液和高錸酸鹽溶液可以簡單地從適合銷售者獲得。試劑盒本身存在放射性核素時(shí)，與肽的絡(luò)合物生成反應(yīng)可以簡單地通過使中性介質(zhì)組分混合并使它們反應(yīng)而產(chǎn)生。為此目的，如前所述，放射性核素可以與結(jié)合比較弱的螯合劑的螯合物形式的肽反應(yīng)。
當(dāng)試劑盒包括上文所述的衍生肽并預(yù)期用于制備標(biāo)記有99mTc、Re或Re的放射性藥物組合物時(shí)，放射性核素將優(yōu)選以高锝酸鹽溶液和高錸酸鹽溶液的形式單獨(dú)添加。在這種情況下，試劑盒將包括適合的還原劑和按需要的螯合劑，前者還原高锝酸鹽或高錸酸鹽。作為還原劑，可以使用例如連二亞硫酸鹽或金屬還原劑。所述成分可以任選被混合，條件是它們是相容的。其中混合的成分優(yōu)選凍干的單組份試劑盒特別適合由使用者與放射性溶液反應(yīng)?？梢允褂媒饘龠€原劑，例如Sn(II)、Ce(III)、Fe(II)、Cu(I)、Ti(III)或Sb(III)；Sn(II)。上述試劑盒的肽組分可以作為溶液提供，例如以生理鹽水溶液或一些緩沖溶液的形式，但是優(yōu)選以干狀態(tài)存在，例如為凍干狀態(tài)。當(dāng)作為注射液體組分使用時(shí)，應(yīng)該是無菌的，其中當(dāng)干狀態(tài)的組分時(shí)，使用者應(yīng)該優(yōu)選使用無菌生理鹽水溶液作為溶劑。如果需要，上述組分可以用適合的穩(wěn)定劑以常規(guī)方式穩(wěn)定化，所述穩(wěn)定劑例如抗壞血酸、龍膽酸或這些酸的鹽。
盡管已經(jīng)參考構(gòu)成發(fā)明人目前已知的最佳實(shí)施方式的優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，可以做出對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言明顯的各種變化和調(diào)整，而不背離所附權(quán)利要求中提出的本發(fā)明范圍。盡管權(quán)利要求以肽序列方式不同地限定了本發(fā)明，但應(yīng)理解，這預(yù)期包括公知為其完全等同物和最頻繁施用的其非毒性的鹽。
上文提出的所有專利和公布的專利申請的公開內(nèi)容明確通過引用并入本文。本文使用的溫度是℃，所有比率按體積計(jì)。液體物質(zhì)的百分比也是按體積計(jì)。
本發(fā)明的各種特征在所附權(quán)利要求中被強(qiáng)調(diào)。
權(quán)利要求
1.一種選擇性結(jié)合SRIF受體SSTR2而不引發(fā)內(nèi)化入細(xì)胞的環(huán)狀生長抑素(SRIF)肽拮抗劑，所述肽包括氨基酸序列(環(huán)3-14)Xaa1-Xaa2-D-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14-Xaa15，其中Xaa1是des-Xaa；Xaa2是Trp(A)、Phe(B)、Nal或Tyr，其中A是H、Cl、F、Br、Me、NO2、OMe或N-甲?；褺是H、鹵素、CH3、NO2或OCH3；D-Xaa3是D-Cys、D-Pen、D-HCys或具有SH側(cè)鏈的另一種D-異構(gòu)體α-氨基酸Xaa4、Xaa5和Xaa6是des-Xaa；Xaa7是APh(Q1)、Tyr(X)、Ala(噻吩基)或Trp(A)，其中Q1是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm、OEt-Cbm、Cbm-Et(OEt)2或Hor，且X是H或鹵素；Xaa8是D-Trp(A)、Trp(A)、Tyr、D-Tyr、Phe(B)、D-Phe(B)、L或D-BzlHis、L或D-(DNP)His、L或D-Aph(Cbm)；Xaa9是Lys、NαMeLys、hLys、NαMehLys、Orn或NαMeOrn；Xaa10是Thr、Ser或Val；Xaa11、Xaa12和Xaa13是des-Xaa；Xaa14是Cys、Pen、hCys或具有SH側(cè)鏈的另一種L-異構(gòu)體α-氨基酸；并且Xaa15是2Nal、D-2Nal、Aph(Q2)、D-Aph(Q2)、(R1)Cha、(R1)D-Cha、(R1)Leu、(R1)D-Leu、Tyr、D-Tyr、Trp、D-Trp或des-Xaa；其中R1是H或CαMe，且Q2是Cbm、OH-Cbm、CH3-Cbm、OCH3-Cbm或OEt-Cbm。
2.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa7是Aph(Q1)、Ala(噻吩基)或Trp(A)，且D-Xaa3是D-Cys。
3.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa7是Aph(Hor)、Aph(Cbm)、Tyr或Ityr。
4.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa8選自Trp(A)、D-Trp(A)和D-Aph(Cbm)，其中A是5F、5Cl、5Br、5Me、50Me、6F、6Cl或6Br。
5.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa7是Aph(Hor)，Xaa8是D-Aph(Cbm)，且Xaa15是2Nal或D-Tyr。
6.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa2是Cpa；Xaa7是Aph(Hor)；Xaa8是D-Aph(Cbm)；Xaa9是Lys；且Xaa15是2Nal或D-Tyr。
7.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa2是4Cl(Phe)或4NO2(Phe)。
8.權(quán)利要求1的肽，其中Xaa2是4Cl(Phe)或4NO2(Phe)；Xaa7是Tyr(X)；Xaa8是D-Aph(Cbm)或D-Trp；且Xaa15是2Nal或D-Tyr。
9.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的肽，其中在N末端還存在為螯合劑、絡(luò)合劑、軛合劑或標(biāo)記的部分Z。
10.權(quán)利要求9的肽，其中Z選自基于DOTA和DTPA的螯合劑、基于NOTA的螯合劑、羰基化合物、2肼基尼克酰胺、N4-螯合劑、去鐵胺和NxSy-螯合劑，并且其中所述部分Z任選通過連接體L連接至Xaa2。
11.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的肽與至少一種藥學(xué)可接受載體的混合物。
12.一種選擇性結(jié)合SRIF受體SSTR2的環(huán)狀生長抑素(SRIF)類似肽，該肽包括氨基酸序列環(huán)(3-14)Xaa1-Xaa2-D-Cys-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Cys-Xaa15-NH，其中Xaa1是des-Xaa；Xaa2是氯代或硝基Phe；Xaa4、Xaa5和Xaa6是des-Xaa；Xaa7是Aph(Hor)、Tyr或ITyr；Xaa8是D-Aph(Cbm)或D-Trp；Xaa9是Lys、Orn、hLys、NαMeLys或NαMeOrm；Xaa10是Thr；Xaa11、Xaa12和Xaa13是des-Xaa；且Xaa15是2Nal或D-Tyr。
13.權(quán)利要求12的肽，其具有其中C末端被酰胺化的下述氨基酸序列之一
14.權(quán)利要求12或13任一項(xiàng)的肽，其中存在連接至Xaa2的部分(Z)，部分(Z)選自基于DOTA的螯合劑、基于DTPA的螯合劑、基于NOTA的螯合劑、羰基、2肼基尼克酰胺、N4-螯合劑、去鐵胺和NxSy-螯合劑。
15.權(quán)利要求14的肽，其中Xaa2是4Cl(Phe)或4NO2(Phe)，并且DOTA螯合劑與其共價(jià)連接。
全文摘要
SRIF肽拮抗劑相對于其他克隆SRIF受體對SSTR2具有選擇性，并以高親和力結(jié)合克隆的人類受體SSTR2，但不活化該受體，具有許多有用功能。因?yàn)樗鼈儾灰燥@著親和力結(jié)合SSTR1、SSTR3、SSTR4或SSTR5，所以它們的施用避免了潛在不希望的副作用。因?yàn)樗鼈冏钄嗍荏w功能，所以它們可以在治療上用于阻斷某些SSTR2介導(dǎo)的生理效應(yīng)。通過在這些SSTR2-選擇性SRIF拮抗劑摻入放射性碘或類似物，提供了用于藥物篩選方法的標(biāo)記化合物?？蛇x地，為了用于治療，可以在其N末端偶聯(lián)、絡(luò)合或螯合高放射性部分。
文檔編號C07K14/655GK101631801SQ200780038652
公開日2010年1月20日 申請日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月16日
發(fā)明者J·E·F·瑞維爾, J·爾學(xué)藝, J·C·儒貝, H·R·馬克夫 申請人:索爾克生物學(xué)研究院, 伯爾尼大學(xué), 巴塞爾醫(yī)學(xué)院