發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含nmda受體拮抗劑的組合物，其用于治療戈謝病的神經(jīng)病性形式。

發(fā)明背景

戈謝病

溶酶體貯積病(lsd)涵蓋約50種不同的遺傳疾病。它們由溶酶體酶或轉(zhuǎn)運蛋白的缺陷引起，導(dǎo)致未降解代謝物的溶酶體內(nèi)積累。雖然lsd是個體罕見的，但總體而言，它們在人群中具有約1/7000新生兒的非常高的流行率(fuller等人，2006)。這個頻率與最常見的遺傳疾病的頻率相當(walker，2007；ratjen和doring，2003)。

在lsd中，戈謝病(gd)是最普遍的，總體頻率為40000之一，而在阿什肯納茲猶太人中，多達500之一受影響(fuller等人，2006)。gd是由編碼β-葡糖腦苷脂酶(也稱為酸性β-葡糖苷酶、d-糖基-n-?；拾贝计咸撬饷福騡case)的gba1基因中的突變引起的，其是需要通過水解切割葡糖神經(jīng)酰胺(glccer，也稱為葡糖腦苷脂)的β-糖苷鍵的具有葡糖神經(jīng)酰胺酶活性的溶酶體酶，葡糖神經(jīng)酰胺是糖脂代謝中的中間體。因此，細胞積累大量的glccer，并最終死亡。

從臨床角度看，gd可以基于發(fā)病年齡和神經(jīng)系統(tǒng)參與的跡象分為三個亞型。1型的主要癥狀是脾和肝的腫大、貧血、血小板減少和骨骼病變。2型和3型是gd的神經(jīng)病性形式(ngd)，根據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)病時間和進展速率進行分類。2型，急性神經(jīng)病性形式，通常指在6個月齡之前顯示神經(jīng)系統(tǒng)異常并且在2-4歲年齡死亡的兒童。在3型中，即亞急性、慢性神經(jīng)病性形式，患者表現(xiàn)出與2型中觀察到的那些相似的癥狀，但具有較晚的發(fā)病和嚴重程度(cox，2010)。

戈謝病治療

1型患者可以用酶替代療法(ert)進行治療。該疾病最常見的形式gd1型的治療和藥物可能根據(jù)每位患者的疾病嚴重程度和由醫(yī)生確定的治療過程而變化。

有三種可用于治療gd的ert和一種口服藥物，其可以被18歲以上和/或具有g(shù)d的輕度形式的那些患者服用。在1991年，genzyme公司與nih合作開發(fā)了第一個獲fda批準的gd靶向ert。隨著1994年引入人β-葡糖腦苷脂酶的冷凍干燥類似物(商品名稱)及其即用型制劑(伊米苷酶(imiglucerase))，臨床醫(yī)生已經(jīng)能夠自己解決疾病過程本身，并因此緩解和甚至逆轉(zhuǎn)1型gd的許多影響。療法不是gd的治愈；也就是說，它不能糾正潛在的遺傳缺陷。為了繼續(xù)從治療中受益，有癥狀的患者在其剩下的生命中必須接受靜脈輸注。最近對和伊米苷酶在治療gd中的歷史和現(xiàn)有認識(deegan和cox，2012)進行了綜述。

用于注射的taliglucerasealfa(商品名elelyso^tm)是一種源自植物的水解溶酶體葡糖腦苷脂特異性酶，被指示用于確診為1型gd的成年人的長期ert。elelyso^tm于2012年5月1日被美國食品和藥物管理局(fda)批準，并且是第一種被指示用于治療1型gd的基于植物細胞的fda批準的ert。最近綜述了taliglucerasealfa在治療gd患者中的益處(hollak，2012)。

velaglucerasealfa(商品名)是水解溶酶體葡糖腦苷脂特異性酶，其被指示用于患有1型gd的兒科和成年患者的長期ert。velaglucerasealfa衍生自人細胞系，并且被設(shè)計為具有與天然存在的人β-葡糖腦苷脂酶蛋白類似的氨基酸序列。2010年2月26日被fda批準使用。最近發(fā)表了在gd中使用velaglucerasealfa的ert的一項隨機、雙盲、多國、第三期研究的結(jié)果(gonzalez等人，2013)。此研究中velaglucerasealfa的安全性和功效結(jié)果支持了在美國和歐洲對velaglucerasealfa的批準，和用于1型gd患者的有價值的治療方案的出現(xiàn)。

除了上述ert藥物之外，美格魯特(ogt918，n-丁基-脫氧野尻霉素，)是用于患有輕度至中度1型gd的成人口服的處方底物減少療法(srt)藥物。僅用于不能用ert治療的患者。通過減少身體產(chǎn)生的鞘糖脂(gsl)的量，來減少全身的gsl的有害積聚。用于1型gd的美格魯特的回顧性分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合療法可以為gd患者提供更好的疾病控制(通過使用多于一種的作用機制來抵抗葡糖神經(jīng)酰胺在細胞中的積累)，可以通過使用減少劑量的ert和美格魯特兩者而是成本有效的，并且可以提供可接受的生活質(zhì)量(machaczka等人，2012)。

全基因組關(guān)聯(lián)研究

基因型-表型相關(guān)性對于gd來說相當差，因此預(yù)測患者將要發(fā)展的gd的亞型是一個主要挑戰(zhàn)(goker-alpan等人，2005)；例如，具有相同基因型的兄弟姐妹可以呈現(xiàn)出廣泛不同的表型(eyal等人1991，amato等人2004)。因此，已提出修飾基因的作用作為表型變異的基礎(chǔ)(goker-alpan等人，2005)。

修飾基因可以通過至少兩個獨立的策略來鑒定：

i)檢索參與特定癥狀發(fā)展的基因的變化。使用這種策略，scarb2被鑒定為一對具有不一致癲癇表型的兄弟姐妹的gd的修飾基因(velayati等人，2011)；和

ii)全基因組關(guān)聯(lián)研究。全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwa研究或gwas)也被稱為全部基因組關(guān)聯(lián)研究(wga研究或wgas)，是對不同個體中許多常見遺傳變體的檢查，以了解任何變體是否與性狀相關(guān)。gwas通常關(guān)注于單核苷酸多態(tài)性(snp)與性狀如主要疾病之間的關(guān)聯(lián)。gwas通常比較兩組參與者的dna：患有疾病的人(病例)和沒有疾病的類似人群(對照)。每個人給出一個dna樣品，從中讀取數(shù)百萬個遺傳變體。如果一種類型的變體(一個等位基因)在患有該疾病的人中更頻繁，則認為該snp與該疾病“相關(guān)聯(lián)”。然后，將相關(guān)聯(lián)的snp視為標記影響疾病風險的人基因組區(qū)域。

gwas方法最近用于研究患有1型gd(gd1)的阿什肯納茲猶猶太gd患者，其中n370s突變是純合的。該研究揭示了cln8基因作為導(dǎo)致極端表型變異的遺傳修飾物的候選物(zhang，2012)。

nmda受體

nmda受體是兩個必要的glun1(也稱為nr1)和兩個區(qū)域局部化的glun2亞基(也稱為nr2)之間的異四聚體。具有不同腦分布和功能特性的多個受體同種型通過nr1轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接和nr2亞基的差異表達產(chǎn)生。雖然在無脊椎生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)了單個的nr2亞基，nr2亞基的四個不同同種型在脊椎動物中表達，并被命名為nr2a至d(分別由基因grin2a、grin2b、grin2c和grin2d編碼)。而nr2b在早期出生后的腦中占主導(dǎo)地位，nr2a亞基的數(shù)目增加，并最終nr2a亞基的數(shù)目超過nr2b。這被稱為nr2b-nr2a發(fā)育開關(guān)，并且由于每個nr2亞基對受體的動力學不同而顯著(liu等人，2004)。nr2b蛋白有幾個同義詞，如nmdar2b；谷氨酸[nmda]受體亞基ε-2；谷氨酸受體亞基ε-2；谷氨酸受體，離子型，n-甲基-d-天冬氨酸2b；grin2b；hnr3；mgc142178；mgc142180；n-甲基-d-天冬氨酸受體亞型2b；n-甲基-d-天冬氨酸受體亞基3；nmde2或nr3。該蛋白包含1484個氨基酸，其中前26個氨基酸被認為起潛在的信號肽的作用。

谷氨酸和nmda受體

谷氨酸是大腦中主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)(nicholls等人，2012)。在生理條件下，谷氨酸通過活化谷氨酸受體(glur)(traynelis等人，2010)在腦交流和可塑性中起著重要作用(bliss和collingridge1993；cooke和bliss2006)。神經(jīng)損傷過程中g(shù)lur的過度活化，主要通過稱為nmda受體的glur亞型產(chǎn)生過量的向細胞內(nèi)的鈣流入，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和最終細胞死亡，其稱為興奮性毒性的過程(mehta等人，2013)。nmda受體根據(jù)其在神經(jīng)元中的分布可以分為2組：突觸和突觸外。突觸受體促進存活信號級聯(lián)，而突觸外受體介導(dǎo)興奮性毒性的毒性作用(parsons和raymond，2014)。由于過量的谷氨酸釋放導(dǎo)致的興奮性毒性發(fā)生在幾種神經(jīng)性病癥中，如缺血性卒中(kostandy，2005)、自閉癥(essa等人，2013)、肌萎縮側(cè)索硬化(costa等人，2010)、帕金森病(caudle和zhang，2009)和阿爾茨海默病(kostandy，2005)。

美金剛和nmda受體

美金剛是通過阻斷nmda受體作用于谷氨酸能系統(tǒng)的新一類阿爾茨海默病藥物中的第一個。它是由elililly公司于1968年首次合成的。已顯示美金剛在中度至重度阿爾茨海默病和路易體癡呆中具有適度的作用，并被批準這些用于人。美國專利號5,061,703描述了美金剛(和其它金剛烷衍生物)在預(yù)防腦缺血性損害中的用途。美國專利號us8,168,209和us8,329,752描述了美金剛的延時釋放口服劑型。2003年，美國食品和藥物管理局(fda)批準美金剛(以商品名namenda)用于治療中度至重度阿爾茨海默型癡呆。

總之，ert目前靜脈內(nèi)施用于gd1型和3型的非神經(jīng)性表現(xiàn)，并且目前還沒有治療方法可用于2型，其為最致命的疾病形式，在嬰兒期呈現(xiàn)，并在首兩年至三年內(nèi)造成死亡。

因此，在治療模式的領(lǐng)域中仍然存在未能滿足的醫(yī)療需求，所述治療將延遲、改善或減少在gd的神經(jīng)病性形式中顯現(xiàn)其自身的神經(jīng)性癥狀。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供用于治療戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的組合物和方法，其包含作為活性成分的至少一種類型的nmda受體拮抗劑。本發(fā)明提供了有效地(至少部分地)改善疾病的神經(jīng)性發(fā)病和/或進展的組合物和方法。特別地，本發(fā)明的組合物減少或預(yù)防該疾病的神經(jīng)性癥狀。根據(jù)一些實施方案，nmda拮抗劑是谷氨酸能神經(jīng)傳遞的特異性抑制劑。根據(jù)一些實施方案，nmda拮抗劑可以是作用于其它神經(jīng)傳遞途徑的較不具特異性的拮抗劑。根據(jù)一些實施方案，nmda拮抗劑可具有另外的活性，例如5-羥色胺能、膽堿能或多巴胺能拮抗劑或激動劑活性。

本發(fā)明至少部分地基于近交小鼠中的gd模型，其首次公開了編碼nmda谷氨酸受體的亞基b的基因grin2b的多態(tài)性與gd進展相關(guān)聯(lián)。為了發(fā)現(xiàn)涉及gd進展的新基因，通過注射環(huán)己烯四醇b環(huán)氧化物(cbe)，其為一種不可逆的葡糖腦苷脂酶(gba)抑制劑，在近交小鼠品系中誘導(dǎo)gd，并進行全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwas)。gwas分析鑒定了編碼nmda谷氨酸受體的亞基b的基因grin2b作為gd進展的潛在修飾基因。

因此，在一個方面，本發(fā)明提供包含至少一種nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體的藥物組合物，用于治療戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了用于治療戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的nmda受體拮抗劑。

在另一方面，本發(fā)明進一步提供了治療在有其需要的患者中的gd的神經(jīng)病性形式的方法，其包括向患者施用包含至少一種nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體的藥物組合物的步驟，從而治療gd的神經(jīng)病性形式。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了治療在有其需要的患者中的戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的方法，包括向患者施用治療有效量的nmda受體拮抗劑，從而治療gd的神經(jīng)病性形式。

在一方面，本發(fā)明還提供至少一種nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體在制備用于治療gd的神經(jīng)病性形式的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了至少一種nmda受體拮抗劑在制備用于治療戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的藥物中的用途。

在另一方面，本發(fā)明進一步提供了一種試劑盒，其包含至少一個包含藥物組合物的容器，所述藥物組合物包含至少一種用于治療gd的神經(jīng)病性形式的nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，nmda受體拮抗劑或所述用途包括選自酶替代治療劑、底物減少治療劑和藥理學分子伴侶治療劑的藥劑。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，該方法包括向患者施用治療有效量的藥劑，所述藥劑選自酶替代治療劑、底物減少治療劑和藥理學分子伴侶治療劑。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了經(jīng)鑒定用于治療戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的試劑盒，其包含包裝nmda受體拮抗劑和選自酶替代治療劑、底物減少治療劑和藥理學分子伴侶治療劑的藥劑的包裝材料。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，nmda受體是突觸外nmda受體。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，nmda受體包含nr2b亞基。

在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑優(yōu)先結(jié)合突觸外nmda受體。在某些實施方案中，突觸外nmda受體包含nr2b亞基。

在某些實施方案中，相對于相應(yīng)的健康神經(jīng)元細胞，nmda受體拮抗劑與具有β-葡糖腦苷脂酶活性缺乏的神經(jīng)元細胞的nmda受體結(jié)合。在某些實施方案中，所述細胞包含gba1基因中的突變。在某些實施方案中，所述細胞表達突變的β-葡糖腦苷脂酶。在某些實施方案中，所述神經(jīng)元細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)神經(jīng)元。

在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑選自美金剛(memantine)、硝基美金剛(nitromemantine)、neramexane、氯胺酮(ketamine)、金剛烷胺(amantadine)、右美沙芬(dextromethorphan)、l-687,384、阿米替林(amitriptyline)、1-芐基-6’-甲氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]、艾芬地爾(ifenprodil)、奧芬那君(orphenadrine)、犬尿喹啉酸(kynurenicacid)、非氨酯(felbamate)、d(-)-ap-5、(±)-cpp、eaa-090、tcn-201、ap-5、azd6765、sdz220-581、(±)-去甲氯胺酮、依利羅地(eliprodil)、右啡烷(dextrorphan)、5,7-二氯犬尿喹啉酸一水合物、[glu3,4,7,10,14]-芋螺抑制肽g([glu3,4,7,10,14]-conantoking)、d-ap-7、md-ada、ap-7、ro8-4304、精胺(spermine)、ro25-6981、dcqx、曲索羅地(traxoprodil)、mdl105,519、法那帕奈(fanapanel)、metaphit、ro25-6981、naag、5-氟吲哚-2-羧酸、(s)-(-)-4-氧代-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、(s)-(-)-4-氧代-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸芐酯和(±)-α-氨基-3-甲酯基-5-甲基異噁唑-4-丙酸，及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑選自美金剛、硝基美金剛、neramexane、氯胺酮、金剛烷胺、右美沙芬、l-687,384、阿米替林、1-芐基-6’-甲氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]、依利羅地、艾芬地爾、奧芬那君、犬尿喹啉酸、非氨酯及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑選自美金剛、硝基美金剛、neramexane及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述nmda受體拮抗劑選自美金剛、依利羅地和艾芬地爾或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑是美金剛(3,5-二甲基-1-金剛烷胺鹽酸鹽)或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也具有5-羥色胺能活性。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也是5-ht3受體拮抗劑。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也具有膽堿能活性。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也是煙堿樣乙酰膽堿受體(nachr)拮抗劑。

在某些實施方案中，具有nachr拮抗劑活性的nmda受體拮抗劑選自金剛烷胺和右美沙芬及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也具有多巴胺能活性。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也是多巴胺d2受體激動劑。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也具有神經(jīng)保護活性。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也是σ-1受體激動劑。

在某些實施方案中，具有σ-1受體激動劑活性的nmda受體拮抗劑選自l-687,384、阿米替林和1-芐基-6’-甲氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑具有神經(jīng)保護活性。

在某些實施方案中，上述藥物組合物用于治療亞急性、慢性神經(jīng)病性gd3型。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述gd是亞急性、慢性神經(jīng)病性gd3型。

在某些實施例中，所述gd3型是gd3a型。

在某些實施例中，所述gd3型是gd3b型。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，將所述nmda受體拮抗劑配制成用于口服遞送。

在某些實施方案中，將上述藥物組合物配制成用于口服遞送。在某些實施方案中，用于口服遞送的組合物被配制用于持續(xù)釋放。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，將nmda受體拮抗劑配制成用于注射。

在某些實施方案中，將上述藥物組合物配制成用于注射。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了一種診斷患者中的戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的方法，所述方法包括在患者的生物樣品中確定影響grin2b基因的表達產(chǎn)物的量的序列變異和/或grin2b基因的表達產(chǎn)物的量，其中相對于健康患者或診斷患有g(shù)di型的患者的生物樣品，序列變異的存在、高于預(yù)定水平的表達產(chǎn)物的量和/或表達產(chǎn)物的增加的量指示gd的神經(jīng)病性形式，由此診斷患者中的gd的神經(jīng)病性形式。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，序列變異在grin2b基因的非編碼序列中。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，使用dna測序確定序列變異。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，使用rna和/或蛋白檢測方法確定表達量。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述檢測方法選自pcr、寡核苷酸微陣列、免疫沉淀法、蛋白印跡分析和facs。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，通過將患者的生物樣品或其部分或其提取物與寡核苷酸雜交來確定表達水平，所述寡核苷酸與由grin2b基因表達的多核苷酸特異性雜交，和/或通過使患者的生物樣品或其部分或其提取物與特異性結(jié)合由grin2b基因表達的多肽的抗體接觸來確定表達水平。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，患者被診斷患有g(shù)d。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了一種物質(zhì)的組合物，其包含被診斷患有戈謝病(gd)的患者的多核苷酸樣品；以及能夠與由grin2b基因表達的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸，并且任選地，其中所述寡核苷酸被標記。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供了一種物質(zhì)的組合物，其包含被診斷患有戈謝病(gd)的患者的多肽樣品；以及能夠特異性結(jié)合由grin2b基因表達的多肽的抗體和任選地第二抗體。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供了一種治療被診斷患有戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的患者的方法，該方法包括：

(a)按照該方法診斷患者；并且其中指示，相對于健康患者或診斷患有g(shù)di型的患者的生物樣品，存在序列變異和/或表達產(chǎn)物的量高于預(yù)定水平和/或增加的量的表達產(chǎn)物，

(b)用nmda受體拮抗劑治療患者，

從而治療被診斷患有g(shù)d的神經(jīng)病性形式的患者。

根據(jù)下文給出的詳細描述，本發(fā)明的其它實施方案和適用性的全部范圍將變得顯而易見。然而，應(yīng)當理解，在說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時的詳細描述和具體實施例僅以說明的方式給出，因為在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言通過該詳細的描述將是顯而易見的。

附圖的若干視圖的簡述

圖1a-c顯示不同的小鼠品系對cbe處理表現(xiàn)出不同的敏感性。圖1a是從kirby等人，genetics.2010年7月；185(3):1081-95改編的圖，顯示94個小鼠品系的系統(tǒng)樹。本申請中使用的品系以粗線突出顯示。圖1b是例示15種不同的經(jīng)cbe處理的小鼠品系的存活曲線的kaplan-meier存活曲線。從出生后第(p)8天開始每天用cbe(25mg/kg)處理小鼠。圖1c顯示pbs(對照，黑線)或cbe(灰線)施用后代表性小鼠品系中運動協(xié)調(diào)的進展，如通過吊線測試評估。數(shù)據(jù)以平均值±sem(n＝4-5)表示，*p<0.05。

圖2是象形圖，說明cbe誘導(dǎo)的腦病理學是品系特異性的。用cbe處理akr/j和btbrt^+itpr3tf/j小鼠。分別在p22和p208處死小鼠，并分析腦皮質(zhì)層v中cd68-陽性細胞的存在。akr/j小鼠發(fā)展出更快速的腦部疾病，而btbrt^+itpr3tf/j小鼠具有抗性。

圖3a-f顯示了大腦gba1活性和脂質(zhì)組學分析。圖3a是顯示在p18時收獲的pbs-處理(對照，黑條)或cbe-處理(灰色條)的小鼠腦中的gba1活性的條圖。數(shù)據(jù)以平均值±sem(n＝2，重復(fù))表示。圖3b是顯示cbe處理后的gba1活性與小鼠壽命之間缺乏相關(guān)性的圖。圖3c-f是顯示在p18時進行評估的pbs-處理(對照，黑條)和cbe-處理(灰色條)品系的腦中的glccer水平(圖3c)、glcso水平(圖3d)、galcer水平(圖3e)和galso水平(圖3f)的條圖。每個小組都有一個插圖，顯示cbe處理后各脂質(zhì)和小鼠壽命之間缺乏相關(guān)性。數(shù)據(jù)以平均值±sem(n＝2)表示。

圖4a是使用emma在15個不同小鼠品系中鑒定的snp產(chǎn)生的曼哈頓圖。圖4b是圖3a的曼哈頓圖的分解圖，集中在染色體6上的位置130000000至140000000。

圖5a顯示了通過qpcr評估的源自pbs-處理或cbe-處理的小鼠在p18時的皮質(zhì)勻漿中的grin2b的皮質(zhì)mrna水平。指示存在于grin2b基因內(nèi)的rs29869040中的snp的基因型。a/j和c57bl/6/jolahsd(表示為c57)代表短期存活品系，而nzw和fvb代表長期存活品系。結(jié)果表示為平均值±sem(n＝3)。循環(huán)閾值(ct)被歸一化為tata盒結(jié)合蛋白(tbp)的水平。短期和長期存活的品系之間*p<0.05，pbs和cbe-處理的組織之間#p<0.05。

圖5b顯示通過對照、1型gd和2型gd患者的額葉、枕葉、頂葉皮質(zhì)和小腦的蛋白印跡分析評估的nr2b蛋白水平。gapdh水平用作加載對照。

圖6是說明阻斷nmda受體如何延長c3h小鼠存活的線圖。從p8開始每天用cbe(25mg/kg天)(黑線)或cbe(25mg/kg天)加上mk-801(0.3mg/kg天)(灰線)處理來自c3h/hej(c3h)品系的雄性小鼠。

圖7顯示了說明活化nmda受體如何降低小鼠存活的線圖。從p8開始每天用cbe(25mg/kg天)(黑線)或cbe(25mg/kg天)加上d-環(huán)絲氨酸(200mg/kg天)(灰線)處理來自balb/cj、fvb/nj、129s1/svimj和btbrt⁺itpr3^tf/j品系的雄性小鼠。

圖8a-c顯示了說明nmda受體拮抗劑美金剛?cè)绾窝娱L神經(jīng)病性gd小鼠壽命的線圖。圖8a顯示了從p8開始每天用cbe(25mg/kg天)(cbe，黑線)或cbe(25mg/kg)加上美金剛(3mg/kg天)(cbe-m，灰線)處理的a/j(aj)、c3h/hej(c3h)、dba/2j(dba)和c57bl6/jolahsd(c57)品系的雄性小鼠的kaplan-meier存活曲線。圖8b-c顯示了從p8開始每天用cbe(50mg/kg天)(n＝5)或cbe(50mg/kg天)加上美金剛3mg/kg(表示為1x，n＝3)或cbe加上美金剛30mg/kg天(表示為x10，n＝4)處理的a/j小鼠的kaplan-meier存活曲線(圖8b)和平均存活時間(圖8c)。圖8c中的結(jié)果表示為平均值±sem。*p<0.05。

圖9a顯示a/jpbs-處理的小鼠(黑色連續(xù)線)(n＝5)、a/jcbe-處理的小鼠(灰點)(n＝4)和a/jcbe-美金剛(虛線)(n＝5)中的運動協(xié)調(diào)的進展，如通過吊線測試評估。結(jié)果為平均值±sem。與pbs對照相比*p<0.05。

圖9b是顯示在p18或p70時收獲的a/j小鼠腦中用pbs、cbe或cbe加上美金剛處理后的腦gba1活性的條圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，n＝2個生物重復(fù)和2個技術(shù)重復(fù)*p<0.001。

圖10a-b顯示了gba^flox/flox的kaplan-meier存活曲線(圖10b)和平均存活時間(圖10b)；從p8開始每天用pbs(對照，n＝9)、美金剛3mg/kg(表示為1x，n＝4)或美金剛30mg/kg天(表示為10x，n＝6)處理巢蛋白-cre小鼠。圖10b中的結(jié)果表示為平均值±sem。*p<0.05。

圖11顯示從p8開始每天用cbe(25mg/kg天，黑線)或cbe(25mg/kg天)加上艾芬地爾(灰線)處理的a/j小鼠的kaplan-meier存活曲線。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及用于治療被診斷處于發(fā)展為戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的風險或患有戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的受試者的手段和方法。本發(fā)明的方法包括向受試者施用有效抑制或阻斷nmda受體活性的治療有效量的nmda受體拮抗劑。本發(fā)明適用于gd的所有神經(jīng)病性形式，包括2型、3a型和3b型。

迄今為止可用于由酶缺乏引起的溶酶體貯積病(包括1型gd)的治療是非常昂貴的并且并不總是有效的。對于2型和3型gd，不存在用于治療這些病癥的有效治療方法。對于導(dǎo)致神經(jīng)病性(也稱為神經(jīng)元病變)gd(ngd)的病理事件的生物化學途徑知之甚少。

臨床上，gd是非常多種多樣的，并且在溶酶體葡糖腦苷脂酶(gba1)基因中具有相同突變的患者可呈現(xiàn)完全不同的表現(xiàn)形式，表明存在修飾基因。本發(fā)明的發(fā)明人在此首次顯示，編碼nmda谷氨酸受體的亞基b的grin2b基因與患有g(shù)d的小鼠的gd進展相關(guān)聯(lián)。此外，本發(fā)明現(xiàn)在顯示，當用nmda受體拮抗劑治療時，證實有g(shù)d的小鼠表現(xiàn)出壽命延長。因此，根據(jù)本發(fā)明，nmda的序列變異和mrna和/或蛋白水平可用于ngd診斷；和能夠抑制nmda受體活性的化合物適用于治療ngd。

如下文和下文實施例部分所示，本發(fā)明人表明，不同的小鼠品系不同地響應(yīng)于通過cbe的gd誘導(dǎo)，這是與其遺傳背景相關(guān)的響應(yīng)。此外，表現(xiàn)出短的壽命的小鼠品系也表現(xiàn)出腦病理學和運動功能障礙，并因此可用作神經(jīng)病性戈謝病(ngd)的小鼠模型(實施例1，圖1a-c和2和表2)。重要的是，小鼠的生存率與腦gba1活性以及與glccer、glcso、galcer和galso脂質(zhì)水平(實施例2，圖3a-f)之間沒有相關(guān)性，表明修飾基因參與了ngd病理學。gwas分析已經(jīng)將編碼nmda谷氨酸受體的亞基b的基因grin2b鑒定為ngd進展的潛在修飾基因(實施例4圖4a-b和5a-b)。具體而言，本發(fā)明人已經(jīng)揭示了與ngd相關(guān)的grin2b基因的非編碼序列中的單核苷酸變異(snpidrs29869040)。

本發(fā)明人進一步表明，nmda受體的激動劑(例如d-環(huán)絲氨酸)降低了gd小鼠的存活，和nmda受體的拮抗劑(例如mk801、美金剛和艾芬地爾)增加了ngd小鼠的期望壽命并延遲ngd小鼠的運動功能障礙的進展，而不影響腦gba1抑制(實施例4-5，圖6-7，8a-c，9a-b，10a-b和11)。

因此，本教導(dǎo)提供了包含用于治療戈謝病的神經(jīng)病性形式(ngd)的nmda受體拮抗劑的組合物和診斷ngd的方法。受這些令人驚奇的發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)，在一方面，本發(fā)明提供包含至少一種nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體的藥物組合物，用于治療gd的神經(jīng)病性形式。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療gd的神經(jīng)病性形式的nmda受體拮抗劑。

不希望受任何理論或作用機制的約束，所述nmda受體拮抗劑具有神經(jīng)保護活性。本文所用的術(shù)語“神經(jīng)保護活性”是指減少或改善神經(jīng)損傷，以及保護或恢復(fù)已遭受神經(jīng)損傷的神經(jīng)元細胞的作用。如本文所用，術(shù)語“神經(jīng)損傷”是指由諸如代謝、毒性、神經(jīng)毒性和化學原因的各種原因?qū)е碌膶ι窠?jīng)元細胞或組織的任何損害。

另一方面，本發(fā)明進一步提供了用于治療在有其需要的患者中的gd的神經(jīng)病性形式的方法，其包括向患者施用包含至少一種nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體的藥物組合物的步驟，從而治療gd的神經(jīng)病性形式。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療在有其需要的患者中的gd的神經(jīng)病性形式的方法，包括向患者施用治療有效量的nmda受體拮抗劑，從而治療gd的神經(jīng)病性形式。

在一方面，本發(fā)明還提供至少一種nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體在制備用于治療gd的神經(jīng)病性形式的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供至少一種nmda受體拮抗劑在制備用于治療gd的神經(jīng)病性形式的藥物中的用途。

在另一方面，本發(fā)明進一步提供了一種試劑盒，其包含至少一個包含藥物組合物的容器，所述藥物組合物包含至少一種用于治療gd的神經(jīng)病性形式的nmda受體拮抗劑或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。

本文所用的術(shù)語“治療”(treating)和“治療”(treatment)是指撤消、基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)病癥的進展，基本上延遲病癥的臨床癥狀的出現(xiàn)，基本上改善病癥的臨床癥狀或基本上防止出現(xiàn)病癥的臨床癥狀。本文所用的術(shù)語“治療”還指延長遭受病癥的患者的存活或延遲遭受病癥的患者的死亡。

如本文所使用的，在本文中可以互換使用的短語“有其需要的患者”和“有其需要的受試者”是指被診斷患有病癥(即神經(jīng)病性gd)的哺乳動物雄性或雌性受試者(例如，人)。在一個特定的實施方案中，該術(shù)語包括處于發(fā)展病癥的風險的個體?；颊呖梢允侨魏涡詣e或任何年齡，包括新生兒、嬰兒、少年、青年、成人和老年人。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，為了診斷目的，所述受試者進一步定義如下。

本文所用的術(shù)語“戈謝氏病(gd)”或“戈謝病”是指一種溶酶體貯積病(lsd)，其特征為細胞內(nèi)特別是單核細胞譜系的細胞內(nèi)的葡糖神經(jīng)酰胺(glccer，也稱為葡糖腦苷脂)的積累。葡糖神經(jīng)酰胺可以在脾、肝、腎、肺、腦和骨髓中聚集。這種疾病是由酶葡糖腦苷脂酶(也稱為β-葡糖苷酶、d-糖基-n-酰基鞘氨醇葡糖水解酶，gcd或gcase；ec3.2.1.45)的缺乏引起的，葡糖腦苷脂酶是具有葡糖神經(jīng)酰胺酶活性的溶酶體酶，其需要通過水解切割葡糖神經(jīng)酰胺的β-葡糖苷鍵。

gd根據(jù)疾病的具體癥狀分為兩種主要類型：神經(jīng)病性和非神經(jīng)病性疾病。在非神經(jīng)病性疾病中，大多數(shù)器官和組織都可以參與，而不是腦。在神經(jīng)病性疾病(ngd)中，腦也參與其中。

i型(或非神經(jīng)病性類型，gd1)是最常見的疾病形式，在大約50000活產(chǎn)之一中發(fā)生。它最常發(fā)生在具有猶太血統(tǒng)的人中。癥狀可能在生命早期或成年期開始，并且包括肝腫大和肉眼可見的脾腫大(共同稱為“肝脾腫大”)；脾可能破裂并引起另外的并發(fā)癥。脾腫大和骨髓替換導(dǎo)致貧血、血小板減少和白細胞減少。骨骼虛弱和骨病可能是廣泛的。腦不受病理影響，但可能有肺損害，以及很少有腎損害。該組患者通常容易產(chǎn)生青腫(由于血小板的低水平)，并且由于紅細胞數(shù)目少而經(jīng)歷疲勞。根據(jù)疾病的發(fā)病和嚴重程度，1型患者可能良好地活到成年期。一些患者有輕度形式的疾病或可能不會顯現(xiàn)任何癥狀。

本文所用的神經(jīng)病性gd(ngd)包括2型和3型gd兩者。

gd2型也稱為急性嬰幼兒神經(jīng)病性gd，通常在出生后6個月內(nèi)開始，并且具有約100000活產(chǎn)之一的發(fā)病率。癥狀包括肝和脾腫大、廣泛性和進行性腦損害、眼運動障礙、痙攣狀態(tài)、癲癇發(fā)作、肢體僵硬，以及吸吮和吞咽能力差。受影響的兒童通常到二歲時死亡。

根據(jù)特定的實施方案，所述神經(jīng)病性gd是gd2型。

gd3型也稱為慢性神經(jīng)病性gd，可以在兒童期或甚至成年期的任何時間開始，并在約100000活產(chǎn)之一中發(fā)生。與急性或2型形式相比，其特征是緩慢進行性，但較輕微的神經(jīng)性癥狀。gd3型已分為兩種變型，稱為3b型和3a型。3b型的大面積肝和脾的發(fā)病更早，并且患者也可能經(jīng)歷肺的直接參與和快速進行性骨疾病。主要癥狀包括脾和/或肝腫大、癲癇發(fā)作、協(xié)調(diào)不良、骨骼不規(guī)則、眼運動障礙、包括貧血在內(nèi)的血液病，以及呼吸問題?；颊咄ǔ；畹角嗌倌暝缙诤统赡昶?。

根據(jù)特定的實施方案，神經(jīng)病性gd是亞急性、慢性神經(jīng)病性gd3型。在某些實施方案中，所述gd3型是gd3a型。在某些實施方案中，所述gd3型是gd3b型。

在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑或包含nmda受體拮抗劑的藥物組合物用于治療與gd的神經(jīng)病性形式相關(guān)的至少一種癥狀。在某些實施方案中，所述癥狀選自驚厥、張力亢進、精神發(fā)育遲緩、呼吸暫停、廣泛性和進行性腦損傷、眼運動障礙、痙攣、癲癇發(fā)作、肢體僵硬、吸吮和吞咽能力差、協(xié)調(diào)不良、骨骼不規(guī)則、血液病、貧血、肌顫搐(肌陣攣)、驚厥、癡呆、眼肌失用癥、呼吸系統(tǒng)疾病及其任何組合。每個可能性代表本發(fā)明的不同實施方案。

如本文所用，術(shù)語“nmda受體”(也稱為n-甲基-d-天冬氨酸受體)是指谷氨酸受體和離子通道蛋白，其是具有至少一個nr1亞基(也稱為glun1)和至少一個nr2亞基(也稱為glun2)的異四聚體分子。nmda受體根據(jù)其在神經(jīng)元中的分布可以分為2組：突觸和突觸外。通常，突觸受體促進存活信號級聯(lián)，而突觸外受體介導(dǎo)興奮性毒性的毒性作用。根據(jù)特定的實施方案，所述nmda受體是突觸外nmda受體。

具有不同腦分布和功能特性的多種受體同種型通過nr1轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接和nr2亞基的差異表達產(chǎn)生。雖然在無脊椎生物中發(fā)現(xiàn)了單個的nr2亞基，nr2亞基的四個不同同種型在脊椎動物中表達，并被命名為nr2a至d(分別由基因grin2a、grin2b、grin2c和grin2d編碼)。

如下面的實施例部分所詳述，發(fā)現(xiàn)編碼nmda谷氨酸受體的亞基b(nr2b)的基因grin2b是gd進展的潛在修飾基因。因此，在某些實施方案中，所述nmda受體(突觸或突觸外)包含nr2b亞基。在特定的實施方案中，突觸外nmda受體包含nr2b亞基。

如本文所用，術(shù)語“nr2b”，也稱為nmdar2b；谷氨酸[nmda]受體亞基epsilon-2；谷氨酸受體亞基epsilon-2；谷氨酸受體、離子型、n-甲基d-天冬氨酸2b；grin2b；hnr3；mgc142178；mgc142180；n-甲基d-天冬氨酸受體亞型2b；n-甲基-d-天冬氨酸受體亞基3；nmde2，或nr3，是指grin2b基因的表達產(chǎn)物。根據(jù)特定的實施方案，所述grin2b基因是指如下列基因id號中提供的人基因：2904(seqidno：6)。根據(jù)其它特定的實施方案，所述grin2b基因是指如下列基因id號中提供的小鼠基因：14812(seqidno：7)。根據(jù)一個特定的實施方案，所述nr2b蛋白是指人蛋白，例如下列g(shù)enbank編號np_000825(seqidno：8)中提供的。根據(jù)一個特定的實施方案，所述nr2b蛋白是指小鼠蛋白，例如下列g(shù)enbank號np_032197(seqidno：9)中提供的。

如本文使用的術(shù)語“nmda受體拮抗劑”是指阻止和/或抑制n-甲基-d-天冬氨酸受體(nmdar)的生物學功能和/或表達的分子。

拮抗劑可以是可逆的或不可逆的拮抗劑。

拮抗劑可以是競爭性或非競爭性拮抗劑。

根據(jù)特定的實施方案，所述拮抗劑是非競爭性拮抗劑。

根據(jù)其它特定的實施方案，所述拮抗劑抑制受體的生物學功能(例如配體結(jié)合，離子通道的開放)，如通過例如電生理記錄、鈣染料或鈣信號傳導(dǎo)檢測。與不存在拮抗劑的情況相比，降低可以是至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少99％。根據(jù)特定的實施方案，所述拮抗劑完全阻止受體的生物學功能(例如配體結(jié)合，離子通道的開放)。

根據(jù)特定的實施方案，所述拮抗劑直接結(jié)合受體，從而阻止和/或抑制受體的活性和/或表達。結(jié)合測定法是本領(lǐng)域熟知的，且包括例如biacore、高效液相色譜法(hplc)或流式細胞術(shù)。

根據(jù)其它特定的實施方案，所述拮抗劑通過經(jīng)由中間分子的作用間接地結(jié)合nmda受體，例如拮抗劑結(jié)合或調(diào)節(jié)一分子，該分子又結(jié)合或調(diào)節(jié)nmda受體。

如上所述，已知nmda受體可以分為2組，突觸受體，其促進存活信號級聯(lián)；和突觸外受體，其介導(dǎo)興奮性毒性的毒性作用(parsons和raymond，2014)。因此，推測，不限于任何理論或機制，可以通過特異性靶向興奮性毒性促進的突觸外受體來實現(xiàn)神經(jīng)保護。因此，在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑優(yōu)先結(jié)合突觸外nmda受體。

因此，根據(jù)特定的實施方案，所述nmda受體拮抗劑經(jīng)由nmda受體阻止和/或抑制過量的鈣流入。

某些nmda受體拮抗劑，如mk-801，由于其相關(guān)的毒性，不能用于治療人患者，其不僅經(jīng)由突觸外受體阻斷了過量的鈣流入的毒性作用，而且阻斷了谷氨酸信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵正常功能。

因此，根據(jù)特定的實施方案，所述nmda受體拮抗劑不經(jīng)由nmda受體干擾谷氨酸信號傳導(dǎo)。

此外，確保使用沒有不可接受的副作用如引起幻覺作用的nmda受體拮抗劑。因此，由于其特異性和安全性，其它nmda受體拮抗劑，例如優(yōu)先阻斷突觸外nmda受體的美金剛是有利的。

如本文使用的術(shù)語“優(yōu)先結(jié)合突觸外nmda受體”是指任何nmda受體拮抗劑，其結(jié)合突觸外nmda受體而不干擾谷氨酸信號傳導(dǎo)的正常功能。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑優(yōu)先結(jié)合nr2亞基的子集。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑優(yōu)先結(jié)合nr2b亞基。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑特異性結(jié)合nr2b亞基，而與其它nr2亞基沒有交叉反應(yīng)性。

在某些實施方案中，相對于相應(yīng)的健康神經(jīng)元細胞，nmda受體拮抗劑與具有β-葡糖腦苷脂酶活性缺乏的神經(jīng)元細胞的nmda受體結(jié)合。本文所用的短語“具有β-葡糖腦苷脂酶活性缺陷的神經(jīng)元細胞”還指具有比正常健康神經(jīng)元細胞中β-葡糖腦苷脂酶活性顯著更低的β-葡糖腦苷脂酶活性的神經(jīng)元細胞。

使用干擾受體的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多種分子，阻止和/或抑制nmda受體的生物學功能可以在蛋白水平上實現(xiàn)，而且也可以在基因組和/或轉(zhuǎn)錄水平上實現(xiàn)。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案可以使用的拮抗劑的非限制性實例包括小分子、抗體、抑制肽、切割多肽的酶、適配體同源重組劑、位點特異性內(nèi)切核酸酶和rna沉默劑。

用于通過血腦屏障(bbb)的平臺技術(shù)是可利用的并且是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于定向脂質(zhì)體、納米顆粒、微泡、通過鼻施用的噬菌體、外來體、前藥和肽掩蔽。藥物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的其它示例性方法在下文進一步描述。

下面將詳細描述可用作拮抗劑的藥劑的非限制性實例。

在多肽水平抑制生物學功能

根據(jù)特定的實施方案，所述拮抗劑是通過結(jié)合和/或切割受體而干擾受體功能(例如催化或相互作用)的分子。這樣的分子可以是但不限于小分子、抑制肽、切割受體的酶、adnectin、親合體(affibody)、avimer、anticalin，四連接素(tetranectin)、darpin和經(jīng)工程改造的kunitz-型抑制劑，其中每種可能性是本發(fā)明的一個單獨的實施方案。

根據(jù)一個特定的實施方案，所述拮抗劑是小分子。

根據(jù)一個特定的實施方案，所述拮抗劑是肽分子。

將理解，抑制肽的至少催化或結(jié)合部分的非功能性類似物也可以用作拮抗劑。

用作nmda受體拮抗劑的許多化合物在本領(lǐng)域中是已知的，因此以下指定的特定的nmda受體拮抗劑絕不限制本發(fā)明的范圍。

表1提供了幾種已知的nmda受體拮抗劑的列表。

表1.

在某些實施方案中，所述至少一種nmda受體拮抗劑選自美金剛、硝基美金剛，neramexane、氯胺酮、金剛烷胺、右美沙芬、l-687,384、阿米替林、1-芐基-6’-甲氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]、艾芬地爾、奧芬那君、犬尿喹啉酸、非氨酯、d(-)-ap-5、(±)-cpp、eaa-090、tcn-201、ap-5、azd6765、sdz220-581、(±)-去甲氯胺酮、依利羅地、右啡烷、5,7-二氯犬尿喹啉酸一水合物、[glu3,4,7,10,14]-芋螺抑制肽g、d-ap-7、md-ada、ap-7、ro8-4304、精胺、ro25-6981、dcqx、曲索羅地、mdl105,519、法那帕奈、metaphit、ro25-6981、naag、5-氟吲哚-2-羧酸、(s)-(-)-4-氧代-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸、(s)-(-)-4-氧代-2-氮雜環(huán)丁烷羧酸芐酯和(±)-α-氨基-3-甲酯基-5-甲基異噁唑-4-丙酸，及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，至少一種nmda受體拮抗劑選自美金剛、硝基美金剛，neramexane、氯胺酮、金剛烷胺、右美沙芬、l-687,384、阿米替林、1-芐基-6’-甲氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’-噻吩并[3.2-c]吡喃]、艾芬地爾、依利羅地、奧芬那君、犬尿喹啉酸、非氨酯及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，至少一種nmda受體拮抗劑選自美金剛、硝基美金剛、neramexane及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

根據(jù)特定的實施方案，所述nmda受體拮抗劑選自選自美金剛、依利羅地和艾芬地爾或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑是美金剛(3,5-二甲基-1-金剛烷胺鹽酸鹽)或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

根據(jù)特定的實施方案，所述拮抗劑是抗體。根據(jù)特定的實施方案，所述拮抗性抗體特異性結(jié)合nmda受體的至少一個表位。根據(jù)特定的實施方案，所述抗體可以穿過bbb。

如本文所用，術(shù)語“表位”是指抗體的互補位與其結(jié)合的抗原上的任何抗原決定簇。表位決定簇通常由諸如氨基酸或碳水化合物側(cè)鏈的分子的化學活性表面分組組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。

如本發(fā)明中使用的術(shù)語“抗體”包括完整分子及其功能片段，例如fab、f(ab’)2、fv、scfv、dsfv或單結(jié)構(gòu)域分子，例如vh和vl，其能夠與抗原的表位結(jié)合。所述抗體可以是單特異性的(能夠識別一個表位或蛋白)、雙特異性(能夠結(jié)合兩個表位或蛋白)或多特異性(能夠識別多個表位或蛋白)。

用于實施本發(fā)明的一些實施方案的合適的抗體片段包括免疫球蛋白輕鏈(本文中稱為“輕鏈”)的互補決定區(qū)(cdr)、免疫球蛋白重鏈(本文中稱為“重鏈”)的互補決定區(qū)、輕鏈的可變區(qū)、重鏈的可變區(qū)、輕鏈、重鏈、fd片段，和包含輕鏈和重鏈兩者的基本上整個可變區(qū)的抗體片段，例如fv、單鏈fv(scfv)、二硫鍵穩(wěn)定的fv(dsfv)、fab、fab’和f(ab’)2。

如本文所用，術(shù)語“互補決定區(qū)”或“cdr”可互換使用，是指在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗原結(jié)合區(qū)。通常，抗體在每個vh中包含三個cdr(cdrhi或hi；cdrh2或h2；和cdrh3或h3)，并且每個vl中包含三個cdr(cdrli或li；cdrl2或l2；和cdrl3或l3)。

構(gòu)成可變區(qū)或cdr的特定抗體中的氨基酸殘基的同一性可以使用本領(lǐng)域熟知的方法確定，包括諸如由kabat等人定義的序列變異性的方法(參見例如kabat等人，1992，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nih，washingtond.c.)，由chothia等人定義的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)的位置(參見例如chothia等人，nature342：877-883,1989)，kabat和chothia之間的折衷使用oxfordmolecular'sabm抗體建模軟件(現(xiàn)參見martin等人，1989，proc.natlacadsciusa.86:9268；以及萬維網(wǎng)www.bioinf-org.uk/abs)，如接觸定義來定義的可用的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(參見maccallum等人，j.mol.biol.262:732-745,1996)，“構(gòu)象定義”(參見例如makabe等人，journalofbiologicalchemistry，283:1156-1166,2008)和imgt[lefrancmp等人(2003)imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomains.devcompimmunol27:55-77]。

如本文所用，“可變區(qū)”和“cdr”可以指由本領(lǐng)域已知的任何方法定義的可變區(qū)和cdr，所述方法包括方法的組合。

包含輕鏈和重鏈兩者的整個或基本上整個可變區(qū)的功能性抗體片段定義如下：

(i)fv，定義為由輕鏈(vl)的可變區(qū)和重鏈(vh)的可變區(qū)組成的經(jīng)基因工程改造的片段，其表示為兩條鏈；

(ii)單鏈fv(“scfv”)，包括輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)的經(jīng)基因工程改造的單鏈分子，通過合適的多肽接頭連接成為基因融合的單鏈分子。

(iii)二硫鍵穩(wěn)定的fv(“dsfv”)，其是經(jīng)基因工程改造的抗體，包括通過經(jīng)基因工程改造的二硫鍵連接的輕鏈的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)。

(iv)fab，含有抗體分子的單價抗原結(jié)合部分的抗體分子的片段，其可以通過用木瓜蛋白酶處理全抗體以產(chǎn)生完整的輕鏈和重鏈的fd片段獲得，所述重鏈的fd片段由其可變結(jié)構(gòu)域和ch1結(jié)構(gòu)域組成；

(v)fab’，含有抗體分子的單價抗原結(jié)合部分的抗體分子的片段，其可以通過用胃蛋白酶處理全抗體，然后通過還原(每個抗體分子獲得兩個fab'片段)來獲得；

(vi)f(ab’)2，含有抗體分子的單價抗原結(jié)合部分的抗體分子的片段，其可以通過用胃蛋白酶處理全抗體獲得(即，通過兩個二硫鍵將fab'片段的二聚體保持在一起)；和

(vii)單結(jié)構(gòu)域抗體或納米抗體由對抗原表現(xiàn)出足夠親和力的單個vh或vl結(jié)構(gòu)域組成。

所述抗體可以是單克隆或多克隆的。

生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體及其片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，harlow和lane，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，newyork，1988，通過引用并入本文)。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的抗體片段可以通過抗體的蛋白酶水解或通過在大腸桿菌或哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞培養(yǎng)物或其它蛋白表達系統(tǒng))中的編碼該片段的dna表達來制備。借助常規(guī)方法可以通過胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全抗體獲得抗體片段。例如，可以通過用胃蛋白酶酶切抗體來產(chǎn)生抗體片段，以提供表示為f(ab’)2的5s片段?？梢允褂昧虼歼€原劑和任選的由二硫鍵斷裂產(chǎn)生的巰基的封閉基團進一步切割該片段，以產(chǎn)生3.5sfab’單價片段?；蛘?，使用胃蛋白酶的酶切直接產(chǎn)生兩個單價fab’片段和fc片段。這些方法例如由goldenberg，美國專利號4,036,945和4,331,647以及其中包括的參考文獻描述，這些專利以其全部內(nèi)容通過引用并入本文。另見porter,r.r.[biochem.j.73:119-126(1959)]。也可以使用切割抗體的其它方法，例如分離重鏈以形成單價輕-重鏈片段，進一步切割片段，或其它酶學、化學或基因技術(shù)，只要該片段與被完整的抗體識別的抗原結(jié)合。

fv片段包含vh和vl鏈的締合。該締合可能是非共價的，如inbar等人[proc.nat'lacad.sci.usa69:2659-62(19720]中所述?；蛘?，可變鏈可通過分子間二硫鍵連接或通過諸如戊二醛的化學物質(zhì)進行交聯(lián)。優(yōu)選地，fv片段包含通過肽接頭連接的vh和vl鏈。通過構(gòu)建包含通過寡核苷酸連接的編碼vh和vl結(jié)構(gòu)域的dna序列的結(jié)構(gòu)基因來制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sfv)。將該結(jié)構(gòu)基因插入表達載體中，隨后將所述表達載體導(dǎo)入宿主細胞，例如大腸桿菌。重組宿主細胞合成具有橋接兩個v結(jié)構(gòu)域的接頭肽的單個多肽鏈。用于產(chǎn)生sfv的方法描述于例如[whitlow和filpula，methods2：97-105(1991)；bird等人，science242：423-426(1988)；pack等人，bio/technology11：1271-77(1993)；和美國專利號4,946,778，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

抗體片段的另一種形式是編碼單個互補決定區(qū)(cdr)的肽?？梢酝ㄟ^構(gòu)建編碼目標抗體的cdr的基因來獲得cdr肽(“最小識別單位”)。這樣的基因例如通過使用聚合酶鏈式反應(yīng)以從產(chǎn)生抗體的細胞的rna合成可變區(qū)來制備。參見例如larrick和fry[methods，2：106-10(1991)]。

應(yīng)當理解，對于人類治療或診斷，優(yōu)選使用人源化抗體。非人(例如，鼠)抗體的人源化形式是免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如fv、fab、fab’、f(ab’).sub.2或抗體的其它抗原結(jié)合子序列)的嵌合分子，其含有來自非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中形成接受體的互補決定區(qū)(cdr)的殘基被來自具有所需的特異性、親和力和容量的非人物種如小鼠、大鼠或兔的cdr(供體抗體)的殘基替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的fv框架殘基被相應(yīng)的非人殘基替代。人源化抗體還可以包含既不在接受體抗體中也不在輸入的cdr或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。通常，人源化抗體將包含至少一個，且通常為兩個可變結(jié)構(gòu)域的基本上所有，其中所有或基本上所有的cdr區(qū)域?qū)?yīng)于非人免疫球蛋白的那些，和所有或基本上所有的fr區(qū)域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最理想地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，通常為人免疫球蛋白的恒定區(qū)(fc)[jones等人，nature，321：522-525(1986)；riechmann等人，nature，332：323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.,2:593-596(1992)]。

用于人源化非人抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。通常，人源化抗體具有從非人的來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為輸入殘基，其通常取自輸入可變結(jié)構(gòu)域。人源化可以基本上按照winter和共事者的方法進行[jones等人，nature，321：522-525(1986)；riechmann等人，nature332：323-327(1988)；verhoeyen等人，science，239：1534-1536(1988)]，通過用嚙齒類動物cdr或cdr序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本上小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域已被來自非人物種的相應(yīng)序列所取代。在實踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些cdr殘基和可能的一些fr殘基被來自嚙齒類動物抗體中的類似位點的殘基取代。

也可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來生產(chǎn)人抗體，包括噬菌體展示文庫[hoogenboom和winter，j.mol.biol.，227:381(1991)；marks等人，j.mol.biol.，222:581(1991)]。cole等人和boerner等人的技術(shù)也可用于制備人單克隆抗體(cole等人，monoclonalantibodiesandcancertherapy，alanr.liss，p.77(1985)和boerner等人，j.immunol.，147(1):86-95(1991)]。類似地，人抗體可以通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物，例如其中內(nèi)源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的小鼠來制備。在攻擊時觀察到人抗體產(chǎn)生，其在所有方面都非常類似于人中所見，包括基因重排、裝配和抗體譜。這種方法描述于例如美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科學出版物：marks等人，bio/technology10：779-783(1992)；lonberg等人，nature368：856-859(1994)；morrison，nature368812-13(1994)；fishwild等人，naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger，naturebiotechnology14：826(1996)；和lonberg和huszar，intern.rev.immunol.13,65-93(1995)。

一旦得到抗體，就可以測試其活性，例如通過elisa。

可以用作本發(fā)明的一些實施方案的拮抗劑的另一種藥劑是適體。如本文所用，術(shù)語“適體”是指結(jié)合特定分子靶標(例如蛋白)的雙鏈或單鏈rna分子。本領(lǐng)域已知各種方法可用于設(shè)計蛋白特異性適體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以如stoltenburgr，reinemannc和strehlitzb(biomolecularengineering(2007)24(4)：381-403)中所述地使用selex(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)來進行有效的選擇。

在核酸水平抑制生物學功能

核酸水平的下調(diào)通常使用具有核酸主鏈、dna、rna、其模擬物或其組合的核酸藥劑來實現(xiàn)。該核酸藥劑可以從dna分子編碼或提供給細胞本身。

因此，本發(fā)明的一些實施方案的拮抗劑可以是rna沉默劑。如本文所用，短語“rna沉默”是指一組由rna分子介導(dǎo)的調(diào)節(jié)機制[例如，rna干擾(rnai)，轉(zhuǎn)錄基因沉默(tgs)，轉(zhuǎn)錄后基因沉默(ptgs)，壓制，共抑制和翻譯抑制]，其導(dǎo)致相應(yīng)的編碼蛋白的基因表達的抑制或“沉默”。已經(jīng)在許多類型的生物體包括植物、動物和真菌中觀察到rna沉默。

如本文所用，術(shù)語“rna沉默劑”是指能夠使靶基因表達特異性抑制或“沉默”的rna。在某些實施方案中，所述rna沉默劑能夠通過轉(zhuǎn)錄后沉默機制來阻止mrna分子的完全加工(例如全翻譯和/或表達)。rna沉默劑包括非編碼rna分子，例如包含配對鏈的rna雙鏈體，以及從其可產(chǎn)生這種小的非編碼rna的前體rna。示例性的rna沉默劑包括dsrna，例如sirna、mirna和shrna。

在一個實施方案中，所述rna沉默劑能夠誘導(dǎo)rna干擾。

在另一個實施方案中，所述rna沉默劑能夠介導(dǎo)翻譯抑制。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述rna沉默劑對靶rna(例如grin2b)是特異性的，并且不交叉抑制或沉默其它靶標或者剪接變體，所述剪接變體表現(xiàn)出與靶基因的99％或更小的總體同源性，例如與靶基因的小于98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％的總體同源性；如通過pcr、蛋白印跡、免疫組織化學和/或流式細胞術(shù)測定。

rna干擾是指由短干擾rna(sirna)介導(dǎo)的動物中序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過程。

以下是對可以根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案使用的rna沉默劑的詳細描述。

dsrna、sirna和shrna-細胞中長dsrna的存在刺激被稱為切酶的核糖核酸酶iii酶的活性。切酶參與將dsrna加工成稱為短干擾rna(sirna)的短小片段dsrna。衍生自切酶活性的短干擾rna通常長度為約21至約23個核苷酸并且包含約19個堿基對雙鏈體。rnai反應(yīng)還具有內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，通常稱為rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)，其介導(dǎo)具有與sirna雙鏈體的反義鏈互補的序列的單鏈rna的切割。靶rna的切割發(fā)生在與sirna雙鏈體的反義鏈互補的區(qū)域的中間。

因此，本發(fā)明的一些實施方案預(yù)期使用dsrna從mrna下調(diào)蛋白表達。

根據(jù)一個實施方案，使用長于30bp的dsrna。各種研究表明長的dsrna可用于使基因表達沉默而不誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)或引起顯著的脫靶效應(yīng)-參見例如[strat等人，nucleicacidsresearch，2006，第34卷，第13期3803-3810；bhargavaa等人brainres.protoc.2004；13:115–125；diallom.，等人，oligonucleotides.2003；13:381–392；paddisonp.j.，等人，proc.natl.acad.sci.usa.2002；99：1443-1448；trann.，等人，febslett.2004；573：127-134]。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，在干擾素途徑未被活化的細胞中提供dsrna，參見例如billy等人，pnas2001，第98卷，第14428-14433頁。和diallo等人，oligonucleotides，2003年10月1日，13(5)：381-392。doi：10.1089/154545703322617069。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，長dsrna被特異地設(shè)計為不誘導(dǎo)用于下調(diào)基因表達的干擾素和pkr途徑。例如，shinagwa和ishii[genes&dev.17(11)：1340-1345,2003]已開發(fā)了一種名為pdecap的載體，以從rna聚合酶ii(polii)啟動子表達長雙鏈rna。因為pdecap的轉(zhuǎn)錄物缺乏促進ds-rna輸出到細胞質(zhì)的5’-帽結(jié)構(gòu)和3’-聚(a)尾，所以來自pdecap的長ds-rna不會誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)。

在哺乳動物系統(tǒng)中逃避干擾素和pkr途徑的另一種方法是通過轉(zhuǎn)染或內(nèi)源表達引入小的抑制性rna(sirna)。

術(shù)語“sirna”是指誘導(dǎo)rna干擾(rnai)途徑的小的抑制性rna雙鏈體(通常在18-30個堿基對之間)。盡管最近已經(jīng)描述了25-30個堿基長度的化學合成的rna雙鏈體可以具有與同一位置的21聚體相比效力增加100倍之多，通常，sirna經(jīng)化學合成為具有中心19bp雙鏈體區(qū)域和在末端的對稱的2-堿基3’-突出端的21聚體。觀察到的使用更長的rna在觸發(fā)rnai中獲得的增加的效力被認為是由向切酶提供底物(27聚體)而不是產(chǎn)物(21聚體)產(chǎn)生的，并且這提高了sirna雙鏈體進入risc的速率或效率。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3’-突出端的位置影響sirna的效力和在反義鏈上具有3’-突出端的不對稱雙鏈體通常比在有義鏈上具有3'-突出端的那些更有效(rose等人，2005)。這可以歸因于不對稱鏈加載成risc，因為當靶向反義轉(zhuǎn)錄物時觀察到相反的功效模式。

雙鏈干擾rna(例如sirna)的鏈可以連接以形成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)(例如shrna)。因此，如上所述，本發(fā)明一些實施方案的rna沉默劑也可以是短發(fā)夾rna(shrna)。

如本文所用的術(shù)語“shrna”是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的rna藥劑，其包含互補序列的第一和第二區(qū)域，所述區(qū)域的互補性和定向足以使得堿基配對發(fā)生在所述區(qū)域，即由環(huán)區(qū)連接的第一和第二區(qū)域之間，所述環(huán)由環(huán)區(qū)內(nèi)的核苷酸(或核苷酸類似物)之間缺乏堿基配對而產(chǎn)生。環(huán)中的核苷酸數(shù)目為3至23，或5至15，或7至13，或4至9，或9至11之間(包括端點)的數(shù)字。環(huán)中的一些核苷酸可與環(huán)中其它核苷酸參與堿基對相互作用?？捎糜谛纬森h(huán)的寡核苷酸序列的實例包括5'-caagaga-3'和5'-uuacaa-3'(國際專利申請?zhí)杦o2013126963和wo2014107763)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，所得單鏈寡核苷酸形成包含能夠與rnai機構(gòu)相互作用的雙鏈區(qū)的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

適用于本發(fā)明一些實施方案的rna沉默劑的合成可如下實現(xiàn)。首先，將受體或受體亞基(例如grin2b)mrna序列在aug起始密碼子的下游掃描aa二核苷酸序列。每個aa和3'相鄰的19個核苷酸的出現(xiàn)記錄為潛在的sirna靶位點。優(yōu)選地，sirna靶位點從開放閱讀框中選擇，因為非翻譯區(qū)(utr)在調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點中更富集。utr結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可能干擾sirna內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合[tuschlchembiochem.2：239-245]。然而應(yīng)當理解，在非翻譯區(qū)引導(dǎo)的sirna也可以是有效的，如用于gapdh所證實的，其中定向在5'utr的sirna介導(dǎo)細胞gapdhmrna的約90％的降低并在蛋白水平完全消除(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。

其次，使用任何序列比對軟件(例如可從ncbi服務(wù)器獲得的blast軟件(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/))將潛在靶位點與適當?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫(例如，人，小鼠，大鼠等)進行比較。與其它編碼序列顯示顯著同源性的推定靶位點被過濾掉。

選擇合格的靶序列作為sirna合成的模板。優(yōu)選的序列是那些包括低g/c含量的序列，因為與g/c含量高于55％的那些相比，這些低g/c含量的序列被證明在介導(dǎo)基因沉默中更有效。優(yōu)選沿著靶基因的長度選擇幾個靶位點用于評價。為了更好地評估所選擇的sirna，優(yōu)選結(jié)合使用陰性對照。陰性對照sirna優(yōu)選包括與sirna相同的核苷酸組成，但與基因組缺乏顯著的同源性。因此，優(yōu)選使用sirna的加擾核苷酸序列，條件是其不顯示與任何其它基因的任何顯著的同源性。

例如，針對grin2b引導(dǎo)的合適的sirna可以從例如sigma獲得。

應(yīng)當理解，并且如上所述，本發(fā)明的一些實施方案的rna沉默劑不需要限于僅含有rna的那些分子，而是進一步包括經(jīng)化學修飾的核苷酸和非核苷酸。

根據(jù)另一個實施方案，所述rna沉默劑可以是mirna。

術(shù)語“微小rna”、“mirna”和“mir”是同義詞，是指約19-28個核苷酸長度的非編碼單鏈rna分子的集合，其調(diào)節(jié)基因表達。發(fā)現(xiàn)mirna在廣泛的生物體(病毒、fwdarw.人)中存在，并且已顯示在發(fā)育、體內(nèi)平衡和疾病病因?qū)W中起作用。

以下是mirna活性機制的簡要說明。

編碼mirna的基因被轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致產(chǎn)生稱為pri-mirna的mirna前體。pri-mirna可以形成具有莖和環(huán)的發(fā)夾。

pri-mirna的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被drosha識別，drosha是rnaseiii內(nèi)切核酸酶。drosha通常識別pri-mirna中的末端環(huán)，并以典型的rna酶iii內(nèi)切核酸酶的交錯切割來切割pri-mirna，產(chǎn)生具有5’磷酸和個核苷酸3'突出端的pre-mirna莖環(huán)。然后通過ran-gtp和輸出受體ex-portin-5將pre-mirna從細胞核活躍地轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)。

雙鏈莖或pre-mirna的莖環(huán)的基部處的5'磷酸和3'突出端然后被切酶識別，切酶也是rnaseiii內(nèi)切核酸酶。然后，切酶從莖環(huán)的基部切除末端環(huán)兩個螺旋轉(zhuǎn)角，留下另外的5'磷酸和個核苷酸3'突出端?？赡馨e配的所得sirna樣雙鏈體包含成熟mirna和稱為mirna*的相似大小的片段。mirna*序列可以在克隆的mirna的文庫中發(fā)現(xiàn)，但通常以比mirna更低的頻率存在。

盡管最初與mirna*作為雙鏈物種存在，但mirna最終作為單鏈rna并入被稱為rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)的核糖核蛋白復(fù)合物，而mirna*被去除和降解。

基于mirna和mrna之間的高水平互補性，特別是mirna的核苷酸2-7，risc鑒定靶核酸。一些研究已經(jīng)查看了mirna與其mrna靶標之間的堿基配對要求，以實現(xiàn)翻譯的有效抑制(bartel綜述，2004，cell116-281)。在哺乳動物細胞中，mirna的前8個核苷酸可能很重要(doench&sharp2004genesdev2004-504)。然而，微小rna的其它部分也可以參與mrna結(jié)合。此外，在3’處的充分的堿基配對可補償5'處的不充分配對(brennecke等人，2005plos3-e85)。分析在全基因組上的mirna結(jié)合的計算研究已表明，mirna的5’處的堿基2-7在靶結(jié)合上的特定作用，但是通常被發(fā)現(xiàn)是“a”的第一核苷酸的作用也被認可(lewis等人，2005cell120-15)。類似地，krek等人使用核苷酸1-7或2-8來鑒定和驗證靶標(2005，natgenet37-495)。

mrna中的靶位點可以在5’utr、3'utr中或編碼區(qū)中。

mirna可以通過以下兩種機制中的任一種來引導(dǎo)risc下調(diào)基因表達：mrna切割或翻譯抑制。如果mrna與mirna具有一定程度的互補性，則mirna可以指定mrna的切割。當mirna指導(dǎo)切割時，切口通常在與mirna的殘基10和11配對的核苷酸之間?；蛘撸绻鹠irna不具有與mirna的必要程度的互補性，則mirna可抑制翻譯。

從上文提供的描述可以理解，細胞與mirna的接觸可以通過用例如成熟的雙鏈mirna、pre-mirna或pri-mirna轉(zhuǎn)染/加載細胞來實現(xiàn)。

pre-mirna序列可以包含45-90、60-80或60-70個核苷酸。

pri-mirna序列可以包含45-30000、50-25000、100-20000、1000-1500或80-100個核苷酸。

反義-反義是設(shè)計用于通過與其mrna特異性雜交來阻止或抑制基因表達的單鏈rna?？梢允褂媚軌蚺c編碼受體或受體亞基(例如grin2b)的mrna轉(zhuǎn)錄物特異性雜交的反義多核苷酸來實現(xiàn)受體的下調(diào)。

必須在考慮對反義方法重要的兩個方面時實現(xiàn)可用于有效下調(diào)受體的反義分子的設(shè)計。第一方面是將寡核苷酸遞送到適當細胞的細胞質(zhì)中，而第二方面是以抑制其翻譯的方式特異性結(jié)合細胞內(nèi)的指定mrna的寡核苷酸的設(shè)計。

現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)可用于將寡核苷酸有效地遞送到多種細胞類型中的許多遞送策略[參見例如等人cellmolbiollett.(2002)7(2):236-7；gait,cellmollifesci.(2003)60(5):844-53；martino等人jbiomedbiotechnol.(2009)2009：410260；grijalvo等人expertopintherpat.(2014)24(7):801-19；falzarano等人，nucleicacidther.(2014)24(1)：87-100；shilakari等人biomedresint.(2014)2014:526391；prakash等人nucleicacidsres.-2014)42(13):8796-807和asseline等人jgenemed.(2014)16(7-8):157-65]。

另外，基于解釋靶mrna和寡核苷酸兩者中的結(jié)構(gòu)改變的力能學的熱力學循環(huán)，用于鑒定對其靶mrna具有最高預(yù)測結(jié)合親和力的那些序列的算法也是可用的[參見例如walton等人biotechnolbioeng65：1-9(1999)]。這些算法已成功地用于在細胞中實施反義方法。

此外，還公開了使用體外系統(tǒng)設(shè)計和預(yù)測特異性寡核苷酸的效率的幾種方法(matveeva等人，naturebiotechnology16：1374-1375(1998)]。

因此，產(chǎn)生高度準確的反義設(shè)計算法和多種寡核苷酸遞送系統(tǒng)能夠使普通技術(shù)人員設(shè)計和實施適用于下調(diào)已知序列表達的反義方法，而不必訴諸于不適當?shù)脑囼灪湾e誤實驗。

如下文所總結(jié)，核酸藥劑也可以在dna水平操作。

抑制受體的生物學功能還可以通過引入基因結(jié)構(gòu)中涉及功能喪失改變的靶向突變(例如點突變、缺失和插入)而使基因(例如，grin2b)失活來實現(xiàn)。

如本文所用，短語“功能喪失改變”是指基因的dna序列中的任何突變，其導(dǎo)致表達產(chǎn)物，即mrna轉(zhuǎn)錄物和/或翻譯的蛋白的表達水平和/或活性下調(diào)。這種功能喪失變化的非限制性實例包括錯義突變，即，使用另一個氨基酸殘基改變蛋白中的氨基酸殘基并由此消除該蛋白的酶活性的突變；無義突變，即，在蛋白中引入終止密碼子的突變，所述終止密碼子例如早期終止密碼子，其導(dǎo)致缺乏酶活性的較短的蛋白；移碼突變，即突變，通常為，改變蛋白的閱讀框架的核酸的缺失或插入，并且可能通過將終止密碼子引入閱讀框架來導(dǎo)致早期終止(例如，缺乏酶活性的截短蛋白)，或在影響蛋白的二級或三級結(jié)構(gòu)的較長氨基酸序列(例如，連續(xù)蛋白)中，并且導(dǎo)致缺乏非突變多肽的酶活性的非功能性蛋白；由于移碼突變或修飾的終止密碼子突變(即當終止密碼子被突變成氨基酸密碼子時)的連續(xù)突變，具有消除的酶活性；啟動子突變，即啟動子序列中的突變，通常為5’至基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，其導(dǎo)致特異性基因產(chǎn)物的下調(diào)；調(diào)節(jié)突變，即在上游或下游或基因內(nèi)的區(qū)域中的突變，其影響基因產(chǎn)物的表達；缺失突變，即缺失基因序列中的編碼核酸并且可能導(dǎo)致移碼突變或符合讀框的突變(在編碼序列內(nèi)，一個或多個氨基酸密碼子的缺失)的突變；插入突變，即，將編碼或非編碼核酸插入基因序列中，并且可能導(dǎo)致一個或多個氨基酸密碼子的移碼突變或符合讀框的插入的突變；倒位，即導(dǎo)致反向編碼或非編碼序列的突變；剪接突變，即導(dǎo)致異常剪接或剪接不良的突變；以及重復(fù)突變，即導(dǎo)致重復(fù)的編碼或非編碼序列的突變，其可能是符合讀框的或可能引起移碼。

根據(jù)特定的實施方案，基因的功能喪失改變可以包含該基因的至少一個等位基因。

如本文所用的術(shù)語“等位基因”是指基因座的一個或多個替代形式中的任何一個，所有這些等位基因都與性狀或特征有關(guān)。在二倍體細胞或生物體中，給定基因的兩個等位基因占據(jù)一對同源染色體上相應(yīng)的基因座。

根據(jù)其它特定的實施方案，基因的功能喪失改變包括基因的兩個等位基因。

將核酸改變引入目標基因的方法在本領(lǐng)域是熟知的[參見例如menked.genesis(2013)51：-188；capecchi，science(1989)244：1288-1292；santiago等人procnatlacadsciusa(2008)105：5809-5814；國際專利申請?zhí)杦o2014085593，wo2009071334和wo2011146121；美國專利號8,771,945、8,586,526、6,774,279和up專利申請公開號20030232410、20050026157、us20060014264；其內(nèi)容通過引用整體并入]，并且包括靶向同源重組(例如“命中和運行”，“雙重替換”)，位點特異性重組酶(例如cre重組酶和flp重組酶)，pb轉(zhuǎn)座酶(例如sleepingbeauty，piggybac，tol2或frogprince)，通過工程改造的核酸酶的基因組編輯(例如大范圍核酸酶，鋅指核酸酶(zfn)，轉(zhuǎn)錄活化劑如效應(yīng)子核酸酶(talen)和crispr/cas系統(tǒng))和使用重組腺伴隨病毒(raav)平臺的基因組編輯。用于向目標基因引入核酸改變的藥劑可以從公眾可獲得的來源設(shè)計，或者可以從transposagen、addgene和sangamobiosciences商業(yè)獲得。

用于定性功效和檢測序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的，且包括但不限于dna測序、電泳、基于酶的錯配檢測測定和雜交測定如pcr、rt-pcr、rna酶保護、原位雜交、引物延伸、dna印跡、rna印跡和斑點印跡分析。

特定基因中的序列改變也可以使用例如色譜法、電泳方法、免疫檢測測定法，如elisa和蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學在蛋白水平上確定。

gd的主要表現(xiàn)之一是大量葡糖神經(jīng)酰胺(glccer)在神經(jīng)元細胞中的病理積累。因此，在某些實施方案中，β-葡糖腦苷脂酶活性缺陷表現(xiàn)為glccer在神經(jīng)元中的升高和/或病理學積累。

gd2型和3型與gd1型區(qū)別的關(guān)鍵標準之一是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的參與和cns相關(guān)癥狀的出現(xiàn)。因此，在某些實施方案中，神經(jīng)元細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)神經(jīng)元。

如現(xiàn)在已知的是，甚至在載體中發(fā)現(xiàn)的gba1突變是帕金森氏病的高危因素，預(yù)期用根據(jù)本發(fā)明的nmda拮抗劑的治療甚至對于這類易患pd的具有g(shù)ba1突變的患者也是有益的。不希望受任何理論或作用機制的約束，預(yù)期這種治療可能會延緩疾病的發(fā)病。

根據(jù)特定的實施方案，nmda受體拮抗劑特異性結(jié)合nmda受體，與其它受體沒有交叉反應(yīng)性。

已知許多充當nmda受體拮抗劑的化合物具有其它生物活性(如例如上文表1中所示)。因此，根據(jù)其它特定的實施方案，所述nmda受體拮抗劑可以調(diào)節(jié)其它受體的活性。

如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指通過抑制(即拮抗劑)或通過活化(即激動劑)活性和/或受體表達來改變活性。

根據(jù)特定的實施方案，調(diào)節(jié)活性和/或表達是抑制活性和/或表達。

根據(jù)特定的實施方案，調(diào)節(jié)活性和/或表達是活化活性和/或表達。

因此，在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑也具有5-羥色胺能活性。如本文所用的術(shù)語“5-羥色胺能活性”是指nmda受體拮抗劑也調(diào)節(jié)5-ht受體家族的受體的活性的能力。

如本文所用，術(shù)語“5-ht受體家族”是指用作5-羥色胺受體的一組蛋白。該組含有由在推定的跨膜區(qū)域內(nèi)的它們的推斷的氨基酸序列中顯示彼此大于72％或更高的同源性的基因編碼的蛋白亞組(由帶電荷或極性氨基酸界定的疏水性氨基酸的線性連續(xù)的一段序列，足夠長以形成跨越脂質(zhì)雙層的二級蛋白結(jié)構(gòu))。迄今已知四種人5-ht受體亞家族：5-ht1、5-ht2、5-ht3和5-ht4。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也是5-ht3受體拮抗劑。

在某些實施方案中，具有5-ht3受體拮抗劑活性的nmda受體拮抗劑是氯胺酮或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也具有膽堿能活性。如本文所用的術(shù)語“膽堿能活性”是指nmda受體拮抗劑也能調(diào)節(jié)煙堿乙酰膽堿受體(nachr)家族的受體的活性的能力。在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也是煙堿乙酰膽堿受體(nachr)拮抗劑。

如本文所用，術(shù)語“煙堿乙酰膽堿受體(nachr)家族”是指用作乙酰膽堿受體的一組蛋白，其是在配體結(jié)合時肌肉收縮的信號。在某些實施方案中，具有nachr拮抗劑活性的nmda受體拮抗劑選自金剛烷胺和右美沙芬及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，所述nmda受體拮抗劑也具有多巴胺能活性。如本文所用的術(shù)語“多巴胺能活性”是指nmda受體拮抗劑也調(diào)節(jié)多巴胺受體家族的受體的活性的能力。

如本文所用，術(shù)語“多巴胺受體家族”是指用作多巴胺受體的一組蛋白。該組含有由在推定的跨膜區(qū)域(由帶電荷或極性氨基酸界定的疏水性氨基酸的線性連續(xù)的一段序列，足夠長以形成跨越脂質(zhì)雙層的二級蛋白結(jié)構(gòu))內(nèi)的它們的推斷的氨基酸序列中顯示出彼此大于65％的同源性的基因編碼的蛋白亞組。迄今已知三種人多巴胺受體亞家族：多巴胺d1受體、多巴胺d2受體和多巴胺d3受體。

在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑也是多巴胺d2受體激動劑。

在某些實施方案中，具有多巴胺d2受體激動劑活性的nmda受體拮抗劑是氯胺酮或其藥學上可接受的鹽、水合物或藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑也具有神經(jīng)保護活性。如本文所用的術(shù)語“神經(jīng)保護活性”是指減少或改善神經(jīng)損傷以及保護或恢復(fù)已遭受神經(jīng)損傷的神經(jīng)元細胞的作用。如本文所用，術(shù)語“神經(jīng)損傷”是指由諸如代謝、毒性、神經(jīng)毒性和化學原因的各種原因?qū)е碌膶ι窠?jīng)元細胞或組織的任何損害。在某些實施方案中，nmda受體拮抗劑也是σ-1受體激動劑。

如本文所用，術(shù)語“σ-1受體”是指sigmar1基因的表達產(chǎn)物，所述基因編碼通過ip3受體調(diào)節(jié)鈣信號傳導(dǎo)的在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)處的伴侶蛋白。

在某些實施方案中，具有σ-1受體激動劑活性的nmda受體拮抗劑選自l-687,384、阿米替林和1-芐基-6’-甲氧基-6’,7’-二氫螺[哌啶-4,4’噻吩并[3.2-c]吡喃]及其藥學上可接受的鹽、水合物和藥學上活性的對映異構(gòu)體。每個可能性代表本發(fā)明的單獨實施方案。

本發(fā)明還預(yù)期包含本文所述的nmda受體拮抗劑與治療gd的標準方法的組合療法。治療gd的標準方法的非限制性實例包括各種疼痛減輕療法、輸血，用于涉及骨和關(guān)節(jié)的矯形手術(shù)、骨髓移植、干細胞移植、脾切除術(shù)、基因治療、酶替代療法(ert)、底物減少療法(srt)和藥理學伴侶治療劑。

根據(jù)特定的實施方案，將nmda受體拮抗劑治療與選自酶替代治療劑、底物減少治療劑和藥理學伴侶治療劑的藥劑組合。

如本文所用“酶替代療法(ert)”是指外源性施用葡糖腦苷脂酶(gcd)。市場上可獲得許多衛(wèi)生監(jiān)管機構(gòu)批準的gcd形式。實例包括但不限于elelyso(taliglucerase)、cerezyme(伊米苷酶(imiglucerase))、vpriv(velaglucerase)和ceredase(阿糖腦苷酶(alglucerase))。

如本文所用，術(shù)語“底物減少治療(srt)劑”是指抑制gcd的天然底物，葡糖神經(jīng)酰胺(或gl1)的合成的藥劑(例如小分子)。市場上可獲得許多衛(wèi)生監(jiān)管機構(gòu)批準的srt形式。實例包括但不限于美格魯特(miglustat)和依利格魯司特(eliglustattartrate)。

如本文所用，術(shù)語“藥理學伴侶治療劑”(pct)是指可以促進正確折疊并穩(wěn)定突變形式的gcd的藥劑(例如小分子)，從而拯救突變的酶免于可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)或其它細胞蛋白降解/處置系統(tǒng)中的降解和/或阻止錯折疊的蛋白在細胞中的積累。藥理學伴侶可以設(shè)計用于穿過血腦屏障(bbb)，使其成為治療對ert無反應(yīng)的gd神經(jīng)元病性形式的候選藥物。

本發(fā)明一些實施方案的nmda拮抗劑和/或藥劑可以施用于生物體本身，或在藥物組合物中，其中與合適的載體或賦形劑混合。

如本文所用的術(shù)語“藥物組合物”是指包含至少一種藥學活性成分和至少一種藥學上可接受的載體的任何組合物。藥物組合物的目的是促進化合物施用于生物體。在本文中，術(shù)語“活性成分”是指起生物效應(yīng)作用的nmda受體拮抗劑。

在本文中，可以互換使用的術(shù)語“藥學上可接受的載體”和“生理上可接受的載體”是指任何類型的無毒固體、半固體或液體填料、載體稀釋劑或賦形劑，其不產(chǎn)生對生物體的顯著刺激并且不會消除所施用化合物的生物活性和性質(zhì)。這些短語包括佐劑。

本文中，術(shù)語“賦形劑”是指添加到藥物組合物中以進一步促進活性成分的施用的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖類和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。本文所用的術(shù)語“藥學上活性的對映異構(gòu)體”是指具有指定的生物活性或功能的指定分子的一種或多種立體異構(gòu)體。舉例來說，nmda受體拮抗劑可用作外消旋混合物，或作為富集或純化(s)或(r)手性藥物。每種立體異構(gòu)體的相對活性可以使用本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)來確定。

藥物的配制和施用技術(shù)可見“remington'spharmaceuticalsciences”，mackpublishingco.，easton，pa，最新版本，其通過引用并入本文。

合適的施用途徑可以例如包括口服、直腸、經(jīng)粘膜，特別是經(jīng)鼻、腸或胃腸外遞送，包括肌肉內(nèi)、皮下和髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、心內(nèi)，例如進入右心室或左心室，進入總冠狀動脈、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。

在某些實施方案中，將nmda受體拮抗劑和/或上述藥劑配制成用于口服遞送。在某些實施方案中，將nmda受體拮抗劑和/或藥劑配制成用于持續(xù)釋放。在某些實施方案中，將nmda受體拮抗劑和/或上述藥劑配制成用于注射。

用于藥物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的常規(guī)方法包括：神經(jīng)外科策略(例如腦內(nèi)注射或腦室內(nèi)輸注)；藥劑的分子操作(例如，包含對內(nèi)皮細胞表面分子具有親和性的轉(zhuǎn)運肽與本身不能穿過bbb的藥劑組合的嵌合融合蛋白的產(chǎn)生)，試圖利用bbb的內(nèi)源性轉(zhuǎn)運途徑之一；設(shè)計用于增加藥劑的脂質(zhì)溶解度的藥理學策略(例如，水溶性藥劑與脂質(zhì)或膽固醇載體的綴合)；以及通過高滲性破壞bbb的完整性的短暫破壞(由將甘露醇溶液注入頸動脈或使用生物活性劑如血管緊張素肽引起)。然而，這些策略中的每一個都具有局限性，例如與侵入性外科手術(shù)相關(guān)的固有風險，由內(nèi)源性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)固有的限制所限定的大小限制，與全身施用嵌合分子(由可能在cns外部有活性的載體基序組成)相關(guān)的潛在的不希望的生物學副作用，以及在bbb被破壞的腦區(qū)域內(nèi)的腦損傷的可能風險，這使得它不是最佳的遞送方法。

或者，可以以局部而非全身方式施用藥物組合物，例如通過將藥物組合物直接注射到患者的組織區(qū)域中。

本發(fā)明的一些實施方案的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備，例如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制成糖丸、研磨、乳化、包封、包埋或凍干工藝。

因此，使用包含賦形劑和助劑的一種或多種生理學上可接受的載體，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案使用的藥物組合物可以以常規(guī)方式配制，所述載體促進將活性成分加工成藥學上可使用的制劑。適當?shù)闹苿┤Q于所選擇的施用途徑。

對于注射，藥物組合物的活性成分可以配制在水溶液中，優(yōu)選在生理學上相容的緩沖液如hank’s溶液、‘林格氏液或生理鹽緩沖液中。對于經(jīng)粘膜施用，在制劑中使用適合滲透屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域中通常是已知的。

對于口服施用，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學上可接受的載體組合來容易地配制藥物組合物。這樣的載體使得藥物組合物可以配制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，用于患者的口服攝取?？诜褂玫乃幚韺W制劑可以使用固體賦形劑制備，任選地研磨所得混合物，并且如果需要，在加入合適的助劑之后，加工顆?；旌衔镆垣@得片劑或糖衣丸芯。合適的賦形劑特別是填料如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素制劑，諸如，例如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉；和/或生理上可接受的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽如藻酸鈉。

向糖衣丸芯提供合適的涂層。為此目的，可以使用濃縮糖溶液，其可以任選地含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物?？蓪⑷玖匣蝾伭霞尤氲狡瑒┗蛱且峦璋轮杏糜阼b定或表征活性化合物劑量的不同組合。

可以口服使用的藥物組合物包括由明膠制成的推入式膠囊以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇制成的軟的密封膠囊。推入式膠囊可以含有與填料如乳糖，粘合劑如淀粉，潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及任選的穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠囊中，所述活性成分可以溶解或懸浮在合適的液體中，例如脂肪油，液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可以加入穩(wěn)定劑。用于口服施用的所有制劑應(yīng)該是適合所選施用途徑的劑量。

對于口腔施用，組合物可以采用以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑的形式。

對于通過鼻吸入施用，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案使用的活性成分可以使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳從加壓包或霧化器呈遞的氣溶膠噴霧形式便利遞送。在加壓氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過提供閥來遞送計量的量來確定。用于分配器中的例如明膠的膠囊和藥筒可以配制成含有化合物和合適的粉末基質(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文所述的藥物組合物可以配制用于胃腸外施用，例如通過推注或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以以單位劑量形式存在，例如在任選添加防腐劑的安瓿或多劑量容器中。組合物可以是在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。

用于胃腸外施用的藥物組合物包括水溶性形式的活性制劑的水溶液。此外，活性成分的懸浮液可以適當?shù)刂苽錇橛托曰蛩⑸鋺腋∫?。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液還可含有合適的穩(wěn)定劑或藥劑，其增加活性成分的溶解度以允許制備高度濃縮的溶液。

或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用之前用合適的載體例如無菌、無致熱原的水基溶液構(gòu)成。

本發(fā)明的一些實施方案的藥物組合物還可以使用例如常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其它甘油酯以直腸組合物如栓劑或保留灌腸劑配制。

適用于本發(fā)明一些實施方案的情況的藥物組合物包括其中含有以有效達到預(yù)期目的的量的活性成分的組合物。更具體而言，治療有效量是指有效預(yù)防、減輕或改善病癥癥狀(例如gd，例如3型gd)或延長被治療的受試者的存活的活性成分(例如nmda受體拮抗劑)的量。

治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，特別是鑒于本文提供的詳細公開內(nèi)容。

對于用于本發(fā)明方法中的任何制劑，可以從體外和細胞培養(yǎng)測定法開始估算治療有效量或劑量。例如，可以在動物模型中配制劑量以達到所需濃度或滴度。這些信息可用于更精確地確定人中的有用劑量。

本文所述的活性成分的毒性和治療功效可以通過體外、細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉藴仕帉W方法來確定。從這些體外和細胞培養(yǎng)測定和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可用于配制用于人的劑量范圍。劑量可以根據(jù)使用的劑型和使用的施用途徑而變化。鑒于患者的病癥，個體醫(yī)師可以選擇確切的配方、施用途徑和劑量。(參見例如，fingl等人，1975，“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”，第1章第1頁)。

可以分別調(diào)整劑量和間隔，以提供活性成分的水平足以誘導(dǎo)或抑制生物效應(yīng)(最小有效濃度，mec)。mec將因每種制劑而異，但可以從體外數(shù)據(jù)估算。實現(xiàn)mec所需的劑量將取決于個體特征和施用途徑。檢測測定法可用于確定血漿濃度。

取決于待治療的病癥的嚴重性和反應(yīng)性，給藥可以是單次或多次施用，治療過程持續(xù)數(shù)天至數(shù)周或直到實現(xiàn)治愈或達到疾病狀態(tài)的減少。

當然，待施用的組合物的量將取決于被治療的受試者、痛苦的嚴重程度、施用方式、處方醫(yī)師的判斷等。

如果需要，本發(fā)明的一些實施方案的組合物可以存在于包裝或分配器裝置中，例如fda批準的試劑盒中，其可以包含含有活性成分的一種或多種單位劑型。所述包裝可以例如包括金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。包裝或分配器裝置可以附有用于施用的說明書。包裝或分配器也可以由管理制造、使用或銷售藥物的政府機構(gòu)規(guī)定的形式的容器相關(guān)聯(lián)的通知來容納，該通知反映了該機構(gòu)批準的組合物形式或人或獸醫(yī)管理。例如，這種通知可以是美國食品和藥物管理局批準的用于處方藥的標簽或批準的產(chǎn)品插頁。也可以制備包含配制在相容的藥物載體中的本發(fā)明的制劑的組合物，放置在適當?shù)娜萜髦校擞浻糜谥委熤付ǖ牟“Y，如上文進一步詳述。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了鑒定用于治療戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的試劑盒，其包含包裝nmda受體拮抗劑和選自酶替代治療劑、底物減少治療劑和藥理學伴侶治療劑的藥劑的包裝材料。

如以下實施例部分的實施例4進一步所示，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，grin2b基因的非編碼序列中單核苷酸變異(snpidrs29869040)中鳥嘌呤的存在與ngd相關(guān)，而腺嘌呤在該snp中的存在與gd的相對cbe不敏感性和更緩和的表型相關(guān)；此外，grin2bmrna和蛋白表達水平與嚴重的ngd相關(guān)。

因此，本發(fā)明的教導(dǎo)也可用于通過確定grin2b基因中的序列變異或grin2b基因的表達產(chǎn)物的量來診斷患者的gd的神經(jīng)病性形式。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種診斷患者中戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的方法，所述方法包括

在患者的生物樣品中確定影響grin2b基因的表達產(chǎn)物的量的序列變異和/或grin2b基因的表達產(chǎn)物的量，且其中相對于健康患者或診斷患有g(shù)di型的患者的生物樣品，存在序列變異、表達產(chǎn)物的量高于預(yù)定水平和/或表達產(chǎn)物的增加的量指示gd的神經(jīng)病性形式，從而診斷患者的gd的神經(jīng)病性形式。

根據(jù)特定的實施方案，所述患者或受試者被診斷患有g(shù)d。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療被診斷患有戈謝病(gd)的神經(jīng)病性形式的患者的方法，該方法包括：

(a)根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的方法診斷患者；并且其中指出，相對于健康患者或診斷患有g(shù)di型的患者的生物樣品，存在序列變異和/或表達產(chǎn)物的量高于預(yù)定水平的和/或增加的量的表達產(chǎn)物，

(b)用nmda受體拮抗劑治療患者，

從而治療診斷患有g(shù)d的神經(jīng)病性形式的患者。

為了測定序列變異，首先從測試對象的生物樣品獲得dna。根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案可以使用的生物樣品包括但不限于體液，例如全血、血清、血漿、腦脊液、尿液、淋巴液和呼吸道、腸道和生殖泌尿道的各種外部分泌物，眼淚，唾液，乳汁以及白細胞，惡性組織，羊水和絨毛膜絨毛，以及細胞或組織活檢(例如腦活檢)。

一旦獲得樣品，使用本領(lǐng)域熟知的方法提取dna。如上所述，檢測序列變異的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于dna測序、電泳、基于酶的錯配檢測測定和雜交測定如pcr、rt-pcr、rna酶保護、原位雜交、引物延伸、dna印跡、rna印跡和斑點印跡分析。特定基因的序列變異也可以在蛋白水平上使用例如色譜法、電泳方法、免疫檢測測定，如elisa和蛋白印跡分析和免疫組織化學來確定。根據(jù)特定的實施方案，使用基因組序列分析確定序列變異(例如snp)。

根據(jù)本發(fā)明的特定實施方案，通過將生物樣品、細胞或其部分或其提取物與探針(例如寡核苷酸探針或引物)雜交來進行序列變異的檢測，所述探針與包含該序列變異(例如snp)的多核苷酸特異性雜交。以下進一步提供可用于本發(fā)明的探針的詳細描述。根據(jù)特定的實施方案，雜交在允許形成包含含有存在于細胞中的序列變異(例如snp)的dna和探針的復(fù)合物的條件下實現(xiàn)。

根據(jù)本發(fā)明的其它特定的實施方案，通過使生物樣品、細胞或其部分或其提取物與特異性結(jié)合包含序列變異(例如snp)的多肽的抗體接觸來進行序列變異的檢測。根據(jù)特定的實施方案，接觸在允許形成包含含有存在于細胞中的序列變異(例如snp)的多肽和抗體的復(fù)合物(即免疫復(fù)合物)的條件下實現(xiàn)。

核苷酸/探針復(fù)合物或免疫復(fù)合物可以在多種溫度、鹽濃度和ph值下形成，所述溫度、鹽濃度和ph值可以根據(jù)所使用的方法和生物樣品而變化，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)適合于形成每個復(fù)合物的條件。

根據(jù)特定的實施方案，序列變異是snp。

根據(jù)特定的實施方案，序列變異是在grin2b基因的非編碼序列中。

如本文所用的短語“表達水平”和“表達量”是指生物樣品中基因表達和/或基因產(chǎn)物活性的程度。例如，各種基因的上調(diào)或下調(diào)可以影響基因產(chǎn)物的水平(即rna和/或蛋白)。

應(yīng)當注意，表達水平可以以任意絕對單位或以歸一化單位(相對于對照參考的已知表達水平)來確定。例如，當使用dna芯片時，表達水平根據(jù)芯片的內(nèi)部對照或通過使用分位數(shù)歸一化如rma進行歸一化。

根據(jù)特定的實施方案，使用rna和/或蛋白檢測方法確定表達量。

根據(jù)特定的實施方案，所述檢測方法選自pcr、寡核苷酸微陣列、免疫沉淀法、蛋白印跡分析和facs。

根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，從受試者的細胞中提取rna或蛋白分子。因此，根據(jù)特定的實施方案，該方法還包括在比較之前從細胞中提取rna或蛋白。

從受試者的細胞中提取rna或蛋白分子的方法是本領(lǐng)域熟知的。提取的rna可以進一步加工成cdna。用于將rna轉(zhuǎn)化為cdna的方法和商業(yè)可得的試劑盒是本領(lǐng)域熟知的，包括例如使用酶逆轉(zhuǎn)錄酶。一旦獲得，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來表征rna、cdna或蛋白分子的各種rna、cdna和/或蛋白分子的表達和/或活性水平。

根據(jù)特定的實施方案，可以使用rna或dna檢測方法在核酸水平確定grin2b基因的表達。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，通過將生物樣品、細胞或其部分或其提取物與探針(例如寡核苷酸探針或引物)雜交來進行g(shù)rin2b途徑的rna的表達水平的檢測，所述探針與由grin2b基因(例如，包括本領(lǐng)域已知的任何可選剪接形式)表達的多核苷酸特異性雜交。這樣的探針可以是任何大小，例如短多核苷酸(例如，15-200個堿基)，100-2000個堿基的中等多核苷酸和多于2000個堿基的長多核苷酸。

本發(fā)明使用的探針可以是任何直接或間接標記的rna分子[例如，rna寡核苷酸(例如，17-50個堿基)，體外轉(zhuǎn)錄的rna分子]，dna分子(例如寡核苷酸，例如15-50個堿基，cdna分子，基因組分子)和/或其類似物[例如肽核酸(pna)]，其對grin2b基因的rna轉(zhuǎn)錄物有特異性。根據(jù)特定的實施方案，所述探針與可檢測部分結(jié)合。

根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)設(shè)計的寡核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何寡核苷酸合成方法生成，例如酶促合成或固相合成。

根據(jù)特定的實施方案，雜交在允許形成包含存在于細胞中的grin2b基因的mrna或cdna和探針的復(fù)合物的條件下進行。所述復(fù)合物可以在各種溫度、鹽濃度和ph值下形成，所述溫度、鹽濃度和ph值可根據(jù)所使用的方法和生物樣品而變化，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)適合于形成每個核苷酸/探針復(fù)合物的條件。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種物質(zhì)的組合物，其包含被診斷患有戈謝病(gd)的患者的多核苷酸樣品，以及能夠與由grin2b基因表達的多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸，并且任選地其中所述寡核苷酸被標記。

在細胞樣品中檢測rna和/或cdna分子的方法的非限制性實例包括rna印跡分析、rt-pcr[例如，半定量rt-pcr，使用例如lightcycler^tm(roche)的定量rt-pcr]，rna原位雜交(使用例如dna或rna探針用以雜交存在于細胞或組織切片中的rna分子)，原位rt-pcr(例如，如nuovogj等人，amjsurgpathol.1993，17：683-90；komminothp，等人patholrespract.1994,190：1017-25所述)和寡核苷酸微陣列(例如，通過將衍生自樣品的多核苷酸序列與附著于具有可尋址的位置的固體表面[例如，玻璃晶片)，例如affymetrix微陣列(santaclara，ca)]的寡核苷酸雜交。

如上所述，根據(jù)特定的實施方案，可以使用蛋白檢測方法在氨基酸水平確定grin2b基因的表達。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，通過使生物樣品、細胞或其部分或其提取物與特異性結(jié)合由grin2b基因(例如，包括本領(lǐng)域已知的其任何變體)表達的多肽的抗體接觸來進行g(shù)rin2b的蛋白的表達水平的檢測。根據(jù)特定的實施方案，所述接觸在允許形成包含存在于細胞中的grin2b基因涉及的多肽和抗體的復(fù)合物(即免疫復(fù)合物)的條件下實現(xiàn)。

所述免疫復(fù)合物可以在各種溫度、鹽濃度和ph值下形成，所述溫度、鹽濃度和ph值可以根據(jù)所使用的方法和生物樣品而變化，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠調(diào)節(jié)適合于形成每種免疫復(fù)合物的條件。

因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種物質(zhì)的組合物，其包含物質(zhì)的組合物，其包含被診斷患有戈謝病(gd)的患者的多肽樣品，以及能夠特異性結(jié)合由grin2b基因表達的多肽的抗體和任選的第二抗體。

檢測細胞樣品中特異性蛋白分子的水平和/或活性的方法的非限制性實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、蛋白印跡分析、免疫沉淀法(ip)、放射免疫測定(ria)、熒光活化細胞分選(facs)、免疫組織化學分析、原位活性測定(使用例如施加在含有活性酶的細胞上的顯色底物)、體外活性測定(其中特定的酶的活性在提取自細胞的蛋白混合物中測量)和基于分子量的方法。例如，在需要檢測分泌蛋白的表達水平的情況下，可以對從受試者獲得的含有細胞分泌的內(nèi)容物的流體樣品(例如血清)進行elisa測定。

根據(jù)特定的實施方案，本發(fā)明使用的抗體可以是任何直接或間接標記的抗體。根據(jù)特定的實施方案，寡核苷酸與可檢測部分結(jié)合。

本發(fā)明的一些實施方案使用的可檢測部分可以是但不限于熒光化學品(熒光團)，磷光化學品、化學發(fā)光化學品、放射性同位素(例如^[125]碘)、酶、熒光多肽、親和標記物，以及可通過正電子發(fā)射斷層成像術(shù)(pet)或磁共振成像(mri)檢測的分子(造影劑)。

如上所述，將患者生物樣品中的grin2b基因的表達水平與健康患者或被診斷患有g(shù)di型的患者的生物樣品中的至少一種基因的表達水平進行比較。

如本文所用，術(shù)語“健康患者”是指不患有g(shù)d的患者。

如上所述，相對于健康患者或被診斷患有g(shù)di型的患者的生物樣品，影響grin2b基因的表達產(chǎn)物的量的序列變異的存在，所述表達產(chǎn)物的量高于預(yù)定水平和/或所述表達產(chǎn)物的增加的量，指示gd的神經(jīng)病性形式。

如本文所用，短語“高于預(yù)定閾值的量”或“增加的量”是指相對于使用相同的定量方法的健康受試者的類似生物樣品中發(fā)現(xiàn)的量的至少統(tǒng)計學顯著的上調(diào)。

根據(jù)特定的實施方案，所述增加的量為相對于對照樣品增加至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少100％或更多，高于約2倍，高于約3倍，高于約4倍，高于約5倍，高于約6倍，高于約7倍，高于約8倍，高于約9倍，高于約20倍，高于約50倍，高于約100倍，高于約200倍，高于約350倍，高于約500倍，高于約1000倍或更多。

預(yù)期在從本申請成熟的專利期限內(nèi)，將會開發(fā)許多相關(guān)的nmda受體拮抗劑，并且術(shù)語“nmda受體拮抗劑”的范圍意在包括所有這些推理的新技術(shù)。

如本文所用，術(shù)語“約”是指±10％術(shù)語“包含”、“含有”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有”和它們的結(jié)合物意味著“包括但不限于”。

術(shù)語“由...組成”是指“包括但限于”。

術(shù)語“基本上由...組成”是指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可以包括另外的成分、步驟和/或部分，但是只有當所述另外的成分、步驟和/或部分不會實質(zhì)上改變所要求保護的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新特征時。

如本文所用，單數(shù)形式“一”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語“一種化合物”或“至少一種化合物”可以包括多種化合物，包括它們的混合物。

在本申請中，本發(fā)明的各種實施方案可以以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)當理解，范圍格式的描述僅僅是為了方便和簡潔，并且不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明的范圍的僵化限制。因此，對范圍的描述應(yīng)被認為已經(jīng)具體公開所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的各個數(shù)值。例如，諸如從1到6的范圍的描述應(yīng)被認為已經(jīng)具體公開子范圍諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3到6等，以及該范圍內(nèi)的各個數(shù)字，例如1、2、3、4、5和6。不管范圍的寬度這都適用。

本文無論何時顯示數(shù)值范圍，都意味著包括在指定范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)字(分數(shù)或整數(shù))。短語“范圍在第一指示數(shù)值和第二指示數(shù)值之間”和“范圍從第一指示數(shù)值至第二指示數(shù)值”在本文中可互換使用，并且意在包括所述第一和第二指示數(shù)值以及它們之間的所有分數(shù)和整數(shù)數(shù)字。

如本文所使用的，術(shù)語“方法”是指完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和工序，包括但不限于已知或者以已知方式、手段、技術(shù)和工序由化學、藥理學、生物學、生物化學和醫(yī)學領(lǐng)域的從業(yè)者容易開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和工序。

當提及特定的序列表時，這樣的參考應(yīng)被理解為也包括基本上對應(yīng)于其互補序列的序列，包括由于例如測序錯誤、克隆錯誤或?qū)е聣A基置換、堿基缺失或堿基添加的其它改變而導(dǎo)致的較小序列變異，條件是這些變異的頻率為50個核苷酸中少于1個，或者100個核苷酸中少于1個，或者200個核苷酸中少于1個，或者500個核苷酸中有少于1個，或者1000個核苷酸中少于1個，或者5000個核苷酸中少于1個，或者10000個核苷酸中少于1個。

應(yīng)當理解，為了清楚起見，在單獨實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征也可以在單個實施方案中組合提供。相反，為了簡潔起見，在單個實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征也可以單獨提供或以任何合適的子組合提供或合適的在本發(fā)明的任何其它描述的實施方案中提供。在各種實施方案的上下文中描述的某些特征不應(yīng)被認為是那些實施方案的基本特征，除非該實施方案在沒有那些元素的情況下不起作用。

如上所述和如下權(quán)利要求部分所要求保護的本發(fā)明的各種實施方案和方面在以下實施例中找到實驗支持。然而，它們絕對不被解釋為限制本發(fā)明的廣泛范圍。

實施例

現(xiàn)在參考以下實施例，其與上述描述一起以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實施方案。

通常，本文使用的命名法和本發(fā)明中使用的實驗室工序包括分子、生物化學、微生物學和重組dna技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有詳細解釋。參見例如“molecularcloning：alaboratorymanual”sambrook等人，(1989)；“currentprotocolsinmolecularbiology”第i-iii卷ausubel，r.m.，編(1994)；ausubel等人，“currentprotocolsinmolecularbiology”，johnwiley和sons，baltimore，maryland(1989)；perbal，“apracticalguidetomolecularcloning”，johnwiley&sons，newyork(1988)；watson等人，“recombinantdna”，scientificamericanbooks，newyork；birren等人(編)“genomeanalysis：alaboratorymanualseries”，第1-4卷，coldspringharborlaboratorypress，newyork(1998)；方法如美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述；“cellbiology：alaboratoryhandbook”，第i-iii卷cellis，j.e.，編(1994)；“cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique”，freshney，wiley-liss，n.y.(1994)，第三版；“currentprotocolsinimmunology”第i-iii卷coliganj.e.，編(1994)；stites等人(編)，“basicandclinicalimmunology”(第8版)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishell和shiigi(編)，“selectedmethodsincellularimmunology”，w.h.freemanandco.，newyork(1980)；可用的免疫測定法在專利和科學文獻中廣泛描述，參見例如美國專利號3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“oligonucleotidesynthesis”gait，m.j.，編(1984)；“nucleicacidhybridization”hames，b.d.和higginss.j.，編(1985)；“transcriptionandtranslation”hames，b.d.和higginss.j.，編(1984)；“animalcellculture”freshney，r.i.，編(1986)；“immobilizedcellsandenzymes”irlpress，(1986)；“apracticalguidetomolecularcloning”perbal，b.，(1984)和“methodsinenzymology”第1-317卷，academicpress；“pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications”，academicpress，sandiego，ca(1990)；marshak等人，“strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual”cshlpress(1996)；所有這些通過引用并入，如在本文中完整闡述。在本文件全文中提供其它一般性參考文獻。其中的工序被認為是本領(lǐng)域熟知的，并為了讀者的方便而提供。其中包含的所有信息通過引用并入本文。

材料和方法

小鼠-從jackson實驗室(usa)、harlanuk和harlan以色列獲得純種近交小鼠品系。具體來說，btbrt⁺itpr3^tf/jc3h/hej、dba/2j、mrl/mpj、wsb/eij、molf/ei、pwd/phj、kk/hij、bpl/1j、i/lnj、bpn/3j和lp/j獲自jackson；a/j、akr/j、nzw/lacj、129s1/svimj獲自英國的harlan實驗室；和c57bl/6jolahsd、balb/cj和fvb/nj均獲自以色列的harlan實驗室。如在vitner等人naturemedicine(2014)20：204-208；和enquist,i.b.等人proc.natl.acad.sci.usa(2007)104:17483–17488中所述地產(chǎn)生gba^flox/flox；巢蛋白-cre小鼠，一種gd的小鼠模型。這些小鼠總結(jié)了人ngd的許多特征，盡管它們的gba1缺陷僅限于神經(jīng)和大膠質(zhì)譜系。小鼠在特定的無病原體條件下維持，并根據(jù)國際指南通過魏茨曼研究所動物保護委員會批準的方案處理。

cbe注射-環(huán)己烯四醇-β-環(huán)氧化物(cbe)獲自calbiochemmillipore(darmstadt，德國)。從出生后第8天(p8)開始每天向小鼠腹膜內(nèi)施用每天25mg或50mg/kg體重的劑量的cbe或pbs(對照)。

用nmda受體激動劑和拮抗劑處理-所有激動劑和拮抗劑從p8起每天施用。每天以200mg/kg/天的劑量施用d-環(huán)絲氨酸(sigma)。每天以0.3mg/kg/天的劑量施用mk-801(sigma)。美金剛(sigma)每天以3或30mg/kg/天的劑量施用。每天以9mg/kg/天的劑量施用艾芬地爾(sigma)。

免疫組織化學-處死小鼠，將全腦在4％多聚甲醛：pbs中在4℃下固定過夜。將組織在pbs中洗滌并用薄片切片機切片。通過所有阻斷、抗體孵育和洗滌步驟，將40微米冠狀切片在2％bsa、0.2％tritonx-100、pbs中自由漂浮處理。將切片在4℃下用初級抗大鼠cd68(abdserotec，oxford，uk；1:1000)孵育過夜。洗滌后，將切片用二次cy2-綴合的驢抗大鼠抗體(1:200，jackson)孵育。使用落射熒光顯微鏡(zeiss)分析腦皮質(zhì)層v中cd68-陽性細胞的存在。

rna提取和定量pcr處理后，處死小鼠，并取出它們的腦，置于小鼠腦切片器(youngmousebrainslicermatrix)(bsmys001-1，zivicinstruments，pittsburgh，pa，usa)上，并切成1mm冠狀切片。使用刮鏟將大腦皮質(zhì)分離并在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃下。根據(jù)制造商的說明書，使用rneasymini試劑盒(qiagengmbh，hilden，德國)分離總rna。使用perfectasybrgreenfastmix(quantabiosciences，gaithersburg，md，usa)和abiprism7300序列檢測系統(tǒng)(appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)進行定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-pcr)。引物濃度為在20μl的反應(yīng)體積中的13nm，且cdna相當于2ng的總rna。每個反應(yīng)都以三個生物重復(fù)和四個技術(shù)一式三份進行。熱循環(huán)參數(shù)如下：步驟1，95℃10分鐘；步驟2，95℃15秒，60℃30秒和68℃30秒。重復(fù)步驟2進行40個循環(huán)，和然后進行解離步驟。使用tata盒結(jié)合蛋白(tbp)進行歸一化的比較循環(huán)閾值法計算mrna水平的折疊變化。使用雙尾、雙獨立樣本學生t檢驗計算p值。引物序列如下：

grin2b正向引物(seqidno：2)：5'-cgcccagatcctcgatttca-3'；

grin2b反向引物(seqidno：3)：5'-ctggaagaacatggaggactca-3'。

tbp正向引物(seqidno：4)：5'-tgctgttggtgattgttggt-3'；和

tbp反向引物(seqidno：5)：5'-ctggcttgtgtgggaaagat-3'；

gba1活性測定-如前所述進行g(shù)ba1活性測定(farfel-becker等人，hummolgenet.2014；23(4)：843-54)。簡言之，將冷凍的半腦樣品在mcilvaine緩沖液(0.1m檸檬酸，ph4.2，0.2mna2hpo4，29:21，體積:體積)中超聲處理。將含有50μg蛋白的組織勻漿物在37℃下用在25μl最終體積的mcilvaine緩沖液中的8μmc6-nbd-glccer(avantipolarlipids，alabaster，al，usa)孵育30分鐘。提取脂質(zhì)并使用氯仿：甲醇：9.8mmcacl2(60:35:8，體積:體積:體積)作為顯影溶劑通過薄層色譜法分離較低相。使用typhoon9410可變模式成像儀，用真實的標準鑒定c6-nbd-神經(jīng)酰胺，并通過image-quanttl(gehealthcare，chalfontstgiles，uk)量化條帶。

鞘脂分析-使用如前所述的abi4000四極線性離子阱質(zhì)譜儀進行l(wèi)c-esi-ms/ms(farfel-becker等人，hummolgenet.2014；23(4)：843-54)。鞘脂內(nèi)標獲自avantipolarlipids(alabaster，al，usa)。

全基因組關(guān)聯(lián)研究-通過高效混合模型關(guān)聯(lián)(emma)，使用如前所述的單個單核苷酸多態(tài)性(snp)關(guān)聯(lián)，對定量壽命表型進行g(shù)wa作圖(kang等人，2008)。emma校正遺傳相關(guān)性和人口結(jié)構(gòu)，最大限度地減少假關(guān)聯(lián)。為了確保小鼠基因組的高度作圖分辨率，使用4000000個snp/品系進行關(guān)聯(lián)。在嚴格的bonferroni校正之后，全基因組顯著性的閾值為1.25×10^-8。雖然以前已經(jīng)證明，在雜交小鼠多樣性組(hmdp)中使用emma的gwa的p<0.05全基因組等同物為p＝4.1×10^-6(kang等人，2008)，為避免假關(guān)聯(lián)，p值≤1×10^-7被認為是顯著的。曼哈頓圖是使用r包生成的(turnersd.qqman：用于使用q-q和曼哈頓圖可視化gwas結(jié)果的r包。biorxivdoi:://dx.doi.org/10.1101/005165)。

運動檢測-通過吊線測試，一種lsd小鼠模型的驗證測試，每周對處理的品系中的運動協(xié)調(diào)進行評估(alvarez等人，2008)。簡而言之，將小鼠的前爪放在水平桿(3mm直徑；35mm長)的中心處。觀察動物的身體位置30秒，并如前所述進行評分(alvarez等人fasebj.2008；22(10)：3617-27)：0＝在10秒內(nèi)脫落；1，＝通過兩個前爪掛在桿上；2＝試圖爬上桿；3＝通過兩個前爪加一個或兩個后爪掛在桿上；4＝所有四只爪掛著，加上尾巴卷繞在桿上；和5＝主動逃生到桿的末端。

人樣品和wb-人腦樣品通過知情同意書獲得。按照描述(vitner等人，2014)制備勻漿物。印跡用抗nr2b(1:1000，millipore，06-600)和gapdh(1:10000，chemicon，mab374)抗體孵育。

統(tǒng)計分析-所有數(shù)據(jù)顯示為平均值±sem。使用雙尾學生t檢驗進行兩個樣品之間的比較。p<0.05被認為是統(tǒng)計學顯著的。

實施例1.選擇神經(jīng)病性戈謝病(ngd)的小鼠模型

為了研究不同小鼠品系作為2/3型gd的可靠模型的潛力，選擇了15種不同的近交小鼠品系。cbe已經(jīng)被用于在小鼠中誘導(dǎo)gd多年(mumford等人，1975)，并且它被用于產(chǎn)生gd疾病的第一動物模型。cbe是水溶性的，并穿過血腦屏障。所選擇的15種小鼠品系具有不同的系統(tǒng)發(fā)育起源，并且它們的snp分布可以自由獲得(圖1a)。在出生后第8天開始和在其剩下的生命中，每天向小鼠腹腔注射25mg/kg/天的cbe(vitner等人，2014)。如下圖1b和表2中總結(jié)的，15種小鼠品系的存活延續(xù)超過200天。獲得的結(jié)果表明，每種小鼠品系對cbe的gd誘導(dǎo)反應(yīng)不同。品系可分為兩組：第一組小鼠的行為非常均一；它們發(fā)展了一種非常有侵襲性的疾病，壽命短。第二組品系表現(xiàn)出具有更廣泛的表型的更長的預(yù)期壽命。在每個品系中，壽命變化性低，表明每種品系對cbe處理的反應(yīng)是遺傳背景的結(jié)果。

為了進一步表征cbe處理對不同品系的影響，每周使用吊線試驗，從出生后第21天開始，持續(xù)2個月追蹤運動行為。掛線測試評估協(xié)調(diào)和運動功能，其中高分意味著更好的協(xié)調(diào)。如圖1c所示，存活短的經(jīng)cbe處理的品系在非常早期的時間點也顯示差的運動行為；而存活長的品系呈現(xiàn)較高的運動行為值。呈現(xiàn)長壽命的一些品系，如sv129和balb/c，在后期階段表現(xiàn)出較差的運動行為，而其它品系如kk/hij在所有測試時間點都具有高的運動得分。與品系無關(guān)，經(jīng)pbs處理的小鼠顯示出高掛線測試得分，表明由于cbe處理而導(dǎo)致運動行為的差異(圖1c)。值得注意的是，pwd/phj和wsb/eij品系由于其野性行為而被排除在運動行為分析中。

為了驗證實施例1的結(jié)果，在兩個示例性品系akr/j(在第24天的平均死亡率)和btbrt^+itpr3tf/j(在第199天的100％死亡率)中分析腦的皮質(zhì)層v中cd68-陽性細胞的存在。如圖2所示，通過cbe處理更容易死亡的akr/j小鼠也顯示明顯的腦病理學，表明它們可以用作2型和/或3型gd的良好模型，而btbrt^+itpr3tf/j小鼠在死亡率和腦病理學方面對cbe敏感性較低。

總之，在測試的品系中，發(fā)現(xiàn)a/j、akr/j、c3h/hej、dba/2j、mrl/mpj、c57bl/6j、wsb/eij和molf/eij對cbe最敏感，為2/3型gd提供良好的小鼠模型。

實施例2.不同小鼠品系的腦中的gba1活性和脂質(zhì)水平與存活率差異無關(guān)

為了消除在不同小鼠品系中觀察到的表型差異是由腦中不同的cbe代謝引起的可能性，測量用cbe或pbs(對照)處理10天的小鼠的gba1酶活性。如圖3a所示，在所有測試的品系中cbe以相同程度顯著降低了大腦gba1活性?？傮w而言，剩下的gba1活性為對照的5-10％(圖3a)。在pbs(r²＝0.126，未顯示數(shù)據(jù))和cbe條件(r²＝0.0581，圖3b)中，腦中的gba1活性和壽命之間無相關(guān)性。另外，根據(jù)品系進行評估時，gba1活性的抑制和壽命之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(r²＝0.0085，數(shù)據(jù)未顯示)。

在下一步中，分析了gba1抑制、glccer積累的后果。如預(yù)期，與對照相比，cbe處理的小鼠在腦中呈現(xiàn)更高水平的glccer。與pbs處理的小鼠相比，cbe處理的腦中g(shù)lccer水平的平均升高為3.7倍(圖3c)。腦中最豐富的glccer種類c18是提高的主要glccer種類(未顯示)。重要的是，在pbs(r²＝0.1441，未顯示數(shù)據(jù))或cbe條件下(r²＝0.0569，圖3c)，腦中g(shù)lccer水平與壽命之間無相關(guān)性。每個品系的glccer水平的變化與壽命之間也沒有相關(guān)性(r²＝0.0311，數(shù)據(jù)未顯示)。另外，在pbs和cbe條件下，在各種glccer亞種(c14，c16，c18:1，c18，c20，c22，c24:1，c24，c26:1和c26)和壽命之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(數(shù)據(jù)未示出)。

糖基鞘氨醇(glcso)是已知在gd中升高的另一種脂質(zhì)，并且已被提出作為gd生物標志物(rolfs等人，plosone.2013nov20；8(11)：e79732)。與對照相比，cbe處理的腦中發(fā)現(xiàn)glcso水平平均升高約36倍(圖3d)。探討了glcso水平與小鼠壽命之間的潛在相關(guān)性-在pbs(r²＝0.068，未顯示數(shù)據(jù))或cbe處理的腦(r²＝0.0013，圖3d)中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。與其它脂質(zhì)類似，glcso水平變化與小鼠壽命之間沒有相關(guān)性(r²＝0.0775，數(shù)據(jù)未顯示)。

另外，在處理的小鼠的腦中分析galcer和galso水平(圖3e-3f)。cbe處理的小鼠顯示這些脂質(zhì)沒有升高，且脂質(zhì)水平與小鼠壽命之間沒有相關(guān)性(對于galcer和galso分別為r²＝0.0975和6×10^-5)。

綜合來看，gba1活性或脂質(zhì)水平與小鼠壽命之間缺乏相關(guān)性表明，在測試品系中觀察到的表型差異不是由于cbe的差異代謝或glccer或glcsph水平的差異積累，表明修飾基因的參與。

實施例3.全基因組關(guān)聯(lián)研究

為了發(fā)現(xiàn)涉及gd進展的新基因，對上述15種近交系進行全基因組關(guān)聯(lián)研究(gwas)。模型生物體中的gwas具有很大的潛力來識別與人疾病相關(guān)的復(fù)雜性狀的風險因素(frazeret等人，2007；peters等人，2007)。模型生物體-關(guān)聯(lián)作圖可能比人關(guān)聯(lián)作圖更強大，因為通過在基因相同的生物體中復(fù)制表型測量可以減少環(huán)境因素的影響(peters等人，2007)。此外，在模型生物體中許多正在進行的基因分型項目中產(chǎn)生的信息是可自由獲得的，允許在模型生物體內(nèi)對復(fù)雜性狀進行計算機作圖。例如，基因組序列分析和snp發(fā)現(xiàn)的最新進展導(dǎo)致大量近交系小鼠的密集snp作圖的可用性(kirby等人，2010)。這些小鼠snp分布是對復(fù)雜性狀作圖的豐富資源，已廣泛用于gwas作圖(liu等人2007)。

為了避免由于品系之間的遺傳相關(guān)性引起的潛在的假關(guān)聯(lián)，使用了基于高效混合模型關(guān)聯(lián)(emma)的新型生物信息學工具。emma是模型生物體關(guān)聯(lián)作圖的統(tǒng)計檢驗，用于校正人口結(jié)構(gòu)和遺傳相關(guān)性的混雜效應(yīng)(kang等人，2008)。避免由于人口結(jié)構(gòu)引起的假關(guān)聯(lián)的另一種方法是從不同的系統(tǒng)發(fā)生起源選擇小鼠品系(clarke等人，2011)。

使用4000000個snp/品系來允許基因組的良好覆蓋。圖4a-b顯示了曼哈頓圖，其表明每個染色體中標記的關(guān)聯(lián)幾率的對數(shù)。gwas分析確定了編碼nmda谷氨酸受體亞基b(nmdar2b或nr2b)的基因grin2b(p值＝6.58e^-08)作為gd進展的潛在修飾基因。具體來說，在grin2b基因的非編碼序列(位于grin2bmrna的內(nèi)含子區(qū)域)中，在染色體6(染色體位置136080931)上鑒定了單核苷酸變異(snpidrs29869040)，其中鳥嘌呤與cbe-敏感性和早期gd的表型相關(guān)，而腺嘌呤與相對cbe-不敏感性和gd的更緩和的表型相關(guān)(關(guān)聯(lián)p值＝1.73×10^-10)。

測試的15種小鼠品系的平均存活時間和grin2bsnp變異總結(jié)在下表2中。

表2.

基于上述預(yù)測研究，評估grin2b參與神經(jīng)病性gd的發(fā)病機制。內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)重要的關(guān)聯(lián)snp。由于非編碼snp可以調(diào)節(jié)定量性狀基因座(qtl)的表達，所以通過qpcr確定grin2b的mrna水平。使用的樣品取自大腦皮層，因為grin2b在腦中表達，且該區(qū)域顯示出病理學。在pbs或cbe處理后10天，測定2個短期存活品系(a/j和c57bl6/jolahsd)和2個長期存活品系(nzw和fvb)的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)不同的基因表達模式-在cbe處理后，grin2b表達水平僅在短期存活品系中增加，表明在應(yīng)激條件下表達水平的調(diào)節(jié)(圖5a)。

此外，通過蛋白印跡評估了對照、1型和2型gd患者中病原性腦區(qū)、額葉皮層的死后活組織檢查中nr2b蛋白的水平。類似于在小鼠組織中獲得的qpcr結(jié)果，檢測到1型gd患者組織中的nr2b水平?jīng)]有變化，而觀察到神經(jīng)病性患者中的水平升高，表明nr2b在ngd中起病理作用(圖5b)。

在過去，本發(fā)明的發(fā)明人之一已經(jīng)表明，glccer積累誘導(dǎo)功能性鈣儲存的變化(korkotian等人，1999，pelled等人，2005)。此外，本發(fā)明人證明用cbe處理的大鼠海馬神經(jīng)元對體外高濃度谷氨酸的毒性作用更敏感(pelled等人，2000)，表明谷氨酸受體的高度活化?？偠灾?，這表明目前的gwas分析可能已揭示了可能參與gd病理級聯(lián)修飾的重要候選基因；和nmda受體在長期存活品系中的激動劑應(yīng)減少它們的壽命，并且nmda受體的拮抗劑應(yīng)增加短期存活品系的壽命。

實施例4.nmda拮抗劑mk-801相比nmda激動劑d-環(huán)絲氨酸對ngd進展的作用

為了研究神經(jīng)病性戈謝病(gd)中谷氨酸興奮性毒性的生物相關(guān)性，采用藥理學方法。首先研究了有效的nmda拮抗劑mk-801在gd發(fā)病機制中的作用。mk-801是現(xiàn)存的最具特異性的nmda阻斷劑之一。它以非競爭性的方式在幾個結(jié)構(gòu)域處結(jié)合受體的離子通道，從而阻止ca²⁺通過通道流入。mk-801已被廣泛研究用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動物模型(lipton，2006)。然而，它拮抗突觸和突觸外nmda受體(parsons和raymond，2014)。

圖6例示使用mk-801(0.3mg/kg/天)阻斷nmda信號傳導(dǎo)如何延長cbe-處理的(25mg/kg/天)c3h小鼠的存活，這表明nmda受體是抗-gd藥劑的良好治療靶標。

相反，施用于4種長期存活小鼠品系(balb/cj、fvb/nj、129s1/svimj和btbrt⁺itpr3^tf/j)的有效nmda激動劑d-環(huán)絲氨酸減少了cbe-處理的小鼠的壽命(圖7)。

實施例5.用于治療ngd的其它nmda拮抗劑的實施例

盡管mk-801在延長gd小鼠的壽命方面有積極的作用，但由于其對受體的高親和力和低解離動力學(off-ratekinetics)，不僅阻斷經(jīng)突觸外受體的過量鈣流入的毒性作用，還阻斷谷氨酸信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵正常功能(lipton，2004)，它不能用于治療患者。因此，測試美金剛(一種反競爭性的開放通道阻斷劑)，其比mk-801提供了更快的與受體的解離結(jié)合動力學，并優(yōu)先阻斷突觸外nmda受體(lipton，2006，parsons和raymond，2014)。美金剛比mk-801較少特異性。它用作5-ht3受體和α-7nachr的非競爭性拮抗劑(rammes等人，2001；aracava等人，2005)，并且用作多巴胺d2受體的激動劑(seeman等人，2008)。美金剛被美國fda和ema批準用于治療中度至重度阿爾茨海默病(reisberg等人，2003)和路易體癡呆(aarsland等人，2009)。

如圖1b和上文表2所示地，使用cbe發(fā)展神經(jīng)病性gd的幾種小鼠品系[a/j(aj)、c3h/hej(c3h)、dba/2j(dba)和c57bl6/jolahsd(c57)]用cbe(25mg/kg天)或cbe加美金剛(3mg/kg天)處理。如圖8a所示，在所有測試品系中，用美金剛治療顯著延長了小鼠的壽命。

即使在更高的50mg/kg/天的cbe處理劑量的情況下，更高劑量的30mg/kg/天的美金剛治療顯著延長了aj小鼠的存活(圖8b-c)。

用美金剛治療使得神經(jīng)病性gd小鼠的壽命比mk-801更大程度地增加，可能是因為美金剛優(yōu)先阻斷突觸外nmda受體，而mk-801阻斷突觸和突觸外nmda受體兩者(parsons和raymond，2014)。

以類似的方式，如通過吊線測試評估，用美金剛治療延遲了由cbe誘導(dǎo)的運動功能障礙的進展(圖9a)。在出生后第49天，美金剛-治療的小鼠呈現(xiàn)與cbe-處理的小鼠在p21時相同的得分，表明美金剛是治療ngd的最具侵襲性形式的潛在藥物。

重要的是，用美金剛治療并不干擾腦中的gba1抑制，所述gba1在出生后第70天(p70)，小鼠疾病的最后階段幾乎檢測不到(圖9b)。

由于cbe可以抑制除gba1以外的其它酶，所以在ngd的遺傳小鼠模型中進一步評價美金剛的作用，其中g(shù)ba1缺失發(fā)生在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中。值得注意的是，如圖10a-b所示，美金剛治療顯著延長了ngd小鼠的存活。

在最后階段，在cbe-處理的小鼠模型中測試了另一種nmda受體拮抗劑艾芬地爾。根據(jù)其它mk801和美金剛，該藥物在cbe-處理的小鼠的壽命中也顯示增加(圖11)。

總之，數(shù)據(jù)表明，nmda受體拮抗劑可以用作ngd的新型治療靶標。

參考文獻

(整個申請中引用了其它參考文獻)

aarslandd.,ballardc,walkerz.,bostromf.,alvesg.,kossakowskik.,leroi,i.pozo-rodriguezf.,minthonl.,londose.,memantineinpatientswithparkinson'sdiseasedementiaordementiawithlewybodies:adouble-blind,placebo-controlled,multicentretrial(美金剛在帕金森病癡呆或路易體癡呆患者中：雙盲、安慰劑對照、多中心試驗).lancet,neurology,8,613-618(2009).

aracavay.,pereirae.f.,maelickea.,albuquerquee.x.memantineblocksalpha7*nicotinicacetylcholinereceptorsmorepotentlythann-methyl-d-aspartatereceptorsinrathippocampalneurons.(美金剛在大鼠海馬神經(jīng)元中比阻斷n-甲基-d-天冬氨酸受體更有效地阻斷α7*煙堿乙酰膽堿受體)j.pharmacol.exp.ther.,312,1195-1205(2005).

beavanm.s.和schapiraa.h.v.,glucocerebrosidasemutationsandthepathogenesisofparkinsondisease.(葡糖腦苷脂酶突變和帕金森病的發(fā)病機制)annalsofmedicine,45,511-521(2013).blisst.v.和collingridge,g.l.,asynapticmodelofmemory:long-termpotentiationinthehippocampus.(記憶的突觸模型：海馬中的長時程增強)nature,361,31-39(1993).

caudlew.m.,zhangj.,glutamate,excitotoxicity,andprogrammedcelldeathinparkinsondisease.(帕金森病中的谷氨酸、興奮性毒性和程序性細胞死亡)exp.neurol.,220,230-233(2009).clarkeg.m.等人,basicstatisticalanalysisingeneticcase-controlstudies.(遺傳病例對照研究中的基礎(chǔ)統(tǒng)計分析)nat.protoc,6,121-133(2011).

cookes.f.和blisst.v.,plasticityinthehumancentralnervoussystem.(人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性)brain,129,1659-1673(2006).

costaj.,gomesc,decarvalhom.,diagnosis,pathogenesisandtherapeutictargetsinamyotrophiclateralsclerosis.(肌萎縮性側(cè)索硬化癥的診斷、發(fā)病機制和治療靶標)cnsneurol.disord.drugtargets,9,764-778(2010).

coxt.m.,gaucherdisease:clinicalprofileandtherapeuticdevelopments.(戈謝病：臨床特征和治療進展)biologics,4,299-313(2010).

deeganp.b.和coxt.m.,imigluceraseinthetreatmentofgaucherdisease:ahistoryandperspective.(治療戈謝病中的伊米苷酶：歷史與認識)drugdesign,developmentandtherapy,6,81-106(2012).

essam.m.,braidyn.,vijayank.r.,subashs.,guilleming.j.excitotoxicityinthepathogenesisofautism.(自閉癥發(fā)病機制中的興奮性毒性)neurotox.res.,23,393-400(2013).

frazerk.a.等人,asequence-basedvariationmapof8.27millionsnpsininbredmousestrains.(近交小鼠品系中827萬個snp的基于序列的變異圖譜)nature,448,1050-1053(2007).

fullerm.,meiklep.j.和hopwoodj.j.,epidemiologyoflysosomalstoragediseases:anoverview.(溶酶體貯積病流行病學：概述)fabrydisease:perspectivesfrom5yearsoffos(2006).

gonzalezd.e等人,enzymereplacementtherapywithvelaglucerasealfaingaucherdisease:resultsfromarandomized,double-blind,multinational,phase3study.(在戈謝病中使用velagluceraseα的酶替代療法：隨機、雙盲、多國、3期研究的結(jié)果)am.j.hematol.,88,166-171(2013).

hollakc.e.m.,anevidence-basedreviewofthepotentialbenefitsoftaliglucerasealfainthetreatmentofpatientswithgaucherdisease.(循證回顧talglucerasealfa在治療戈謝病患者中的潛在益處)coreevidence,7,15-20(2012).

kangh.m.等人,efficientcontrolofpopulationstructureinmodelorganism

associationmapping.(模型生物體關(guān)聯(lián)作圖中人口結(jié)構(gòu)的有效控制)genetics,178,1709-1723(2008).

korkotiane.,schwarza.,pelledd.,schwarzmanng.,segalm.,futermana.h.,elevationofintracellularglucosylceramidelevelsresultsinanincreaseinendoplasmicreticulumdensityandinfunctionalcalciumstoresinculturedneurons.(細胞內(nèi)葡糖神經(jīng)酰胺水平的升高導(dǎo)致培養(yǎng)神經(jīng)元中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密度和功能性鈣儲存增加)j.biol.chem.,274,21673-21678(1999).

kostandyb.b.,theroleofglutamateinneuronalischemicinjury:theroleofsparkinfire.(谷氨酸在神經(jīng)元缺血性損傷中的作用：火花在火中的作用)neurol.sci.,33,223-37(2012).

liptons.a.,failuresandsuccessesofnmdareceptorantagonists:molecularbasisfortheuseofopen-channelblockerslikememantineinthetreatmentofacuteandchronicneurologicinsults.(nmda受體拮抗劑的失敗和成功：使用美金剛等開放通道阻斷劑在治療急性和慢性神經(jīng)損傷中的分子基礎(chǔ))neurorx.,1,101-110(2004).

liptons.a.,paradigmshiftinneuroprotectionbynmdareceptorblockade:

memantineandbeyond.(nmda受體阻斷對神經(jīng)保護作用的范例轉(zhuǎn)換：美金剛及更多)nat.rev.drugdiscov.,5,160-70(2006).

liux.b.等人,switchingofnmdareceptor2aand2bsubunitsatthalamicandcorticalsynapsesduringearlypostnataldevelopment.(nmda受體2a和2b亞基在早期出生后發(fā)育期間的丘腦和皮層突觸的切換)thejournalofneuroscience,24,40,8885-8895(2004).

machaczkam.等人,substratereductiontherapywithmiglustatfortype1gaucherdisease:aretrospectiveanalysisfromasingleinstitution.(采用美格魯特的1型戈謝病移植物的底物減少療法：來自單一機構(gòu)的回顧性分析)upsalajournalofmedicalsciences,117,28-34(2012).mehtaa.,prabhakarm.,kumarp.,deshmukhr.,sharmap.l.,excitotoxicity:bridgetovarioustriggersinneurodegenerativedisorders.(興奮性毒性：通往神經(jīng)變性疾病中的各種觸發(fā)因素的橋梁)eur.j.pharmacol.,698,6-18(2013).

mumfordr.a.等人,thegauchermouse(戈謝小鼠).biochem.biophys.res.commun.,67,1,85-90(1975).

nichollsj.g.,martina.r.,fuchsp.a.,brownd.a.,diamondm.e.,weisblatd.,(2012).fromneurontobrain(從神經(jīng)元到腦)(第五版).sunderland,ma:sinauerassociates.

parsonsm.p.,raymondl.a.extrasynapticnmdareceptorinvolvementincentralnervoussystemdisorders.(突觸外nmda受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病)neuron,82,279-293(2014).

pelledd.,shogomorih.,futermana.h.,theincreasedsensitivityofneuronswithelevatedglucocerebrosidetoneurotoxicagentscanbereversedbyimiglucerase.(具有升高的葡糖腦苷脂的神經(jīng)元對神經(jīng)毒性劑的敏感性增加可被伊米苷酶逆轉(zhuǎn))j.inh.met.dis.,23,175-184(2000).

pelledd.,trajkovic-bodennecs.,lloyd-evanse.,sidranskye.,schiffmannr.,futermana.h.enhancedcalciumreleaseintheacuteneuropathicformofgaucherdisease.(在戈謝病急的性神經(jīng)病性形式中的增強的鈣釋放)neurobiol.dis.,18,83-88(2005).

petersl.l.等人,themouseasamodelforhumanbiology:aresourceguideforcomplextraitanalysis(小鼠作為人生物學的模型：復(fù)雜性狀分析的資源指南).nat.rev.genet.,8,58-69(2007).

rammesg.,rupprechtr.,ferrariu.,zieglgansbergerw.,parsonsc.g.,then-methyl-d-aspartatereceptorchannelblockersmemantine,mrz2/579andotheramino-alkyl-cyclohexanesantagonise5-ht(3)receptorcurrentsinculturedhek-293andn1e-115cellsystemsinanon-competitivemanner(n-甲基-d-天冬氨酸受體通道阻斷劑美金剛、mrz2/579和其它氨基-烷基-環(huán)己烷以非競爭性方式拮抗培養(yǎng)的hek-293和n1e-115細胞系統(tǒng)中的5-ht(3)受體電流).neurosci.lett.,306,81-84(2001).

ratjenf.和doringg.,cysticfibrosis(囊性纖維化).lancet,361,681-689(2003).

reisbergb.,doodyr.,stofflera.,schmittf.,ferriss.,mobiush.j.,memantinestudygroup.memantineinmoderate-to-severealzheimer'sdisease(美金剛研究組.在中度至重度阿爾茨海默病中的美金剛).newengl.j.med.,348,1333-1341(2003).

seemanp.,carusoc,lasagam.,memantineagonistactionatdopamined2highreceptors(在多巴胺d2高受體處的美金剛激動劑作用).synapse,62,149-153(2008).

sidranskye.等人,multicenteranalysisofglucocerebrosidasemutationsin

parkinson'sdisease(帕金森病中葡糖腦苷脂酶突變的多中心分析),n.engl.j.med.361,1651-1661(2009).

trayneliss.f.,wollmuthl.p.,mcbainc.j.,mennitif.s.,vancek.m.,ogdenk.k.,hansenk.b.,yuanh.,myerss.j.和dinglediner.,glutamatereceptorionchannels:structure,regulation,andfunction(谷氨酸受體離子通道：結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)和功能).pharmacologicalreviews,62,405-496(2010).

vitner等人,ripk3asapotentialtherapeutictargetforgaucher'sdisease(ripk3作為戈謝病的潛在治療靶標).nat.med.,20,2,204-208(2014).

walkerf.o.,huntington'sdisease(亨廷頓氏病).lancet,369,218-228(2007).

zhangc.k.等人,genome-wideassociationstudyofn370shomozygousgaucherdiseaserevealsthecandidacyofcln8geneasageneticmodifiercontributingtoextremephenotypicvariation(n370s純合子戈謝病的全基因組關(guān)聯(lián)研究揭示了cln8基因作為導(dǎo)致極端表型變異的遺傳修飾物的候選資格).am.j.hematol.,87,4,377-383(2012).