本發(fā)明屬于皮膚學(xué)、藥劑和化妝品領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明屬于藥學(xué)、皮膚學(xué)或化妝品可適用物質(zhì)的生產(chǎn)領(lǐng)域及其使用和應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生物聚合物，如膠原，多糖或玻尿酸通常用于化妝品或護(hù)膚品組合物中。在許多情況下，這些生物聚合物用作保濕劑或抗氧化劑。常見(jiàn)的施用方式是面霜、精華液、片劑、面膜、香脂，液體或軟膏。

例如玻尿酸或透明質(zhì)酸是一種生物聚合物，其廣泛分布在人體組織中。它是一種陰離子，非硫酸化的糖胺聚糖，其包含以下結(jié)構(gòu)：

透明質(zhì)酸具有多種醫(yī)學(xué)用途，特別是在皮膚學(xué)中，通常用于化妝品，特別是所謂的抗衰老產(chǎn)品。

通常，生物聚合物如透明質(zhì)酸的生物活性直接取決于所述生物聚合物的平均分子量。以透明質(zhì)酸及其在皮膚學(xué)中的應(yīng)用為例，平均分子量決定了透明質(zhì)酸的皮膚滲透深度和潛在的皮膚學(xué)作用(參見(jiàn)圖1)。

眾所周知，生物聚合物的生物學(xué)功能取決于它們的平均分子量，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾種方法來(lái)生產(chǎn)具有確定平均分子量的生物聚合物。

ep2479194a2描述了透明質(zhì)酸在活性炭上的水解。ep2463309b1和ep1992645a1描述了幾種透明質(zhì)酸酸性水解的方法。其他方法包括使用酶水解和過(guò)濾(ep0138572b1)或使用高溫和強(qiáng)剪切力(ep1987153b1)。

所有這些方法的問(wèn)題在于，特別地，透明質(zhì)酸需要大量的純化步驟以除去可能促炎性的低分子量透明質(zhì)酸。

因此，提供一種具有確定分子量分布的純生物聚合物的高效生產(chǎn)方法是有必要的，特別是透明質(zhì)酸，使生物聚合物的平均分子量得以控制，并且不需要任何進(jìn)一步額外的純化步驟。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種包含至少一種生物聚合物的生物聚合物組合物的生產(chǎn)方法，其中所述至少一種生物聚合物具有確定的平均分子量和確定的分子量分布，所述方法包括：

(ⅰ)提供包含具有確定的ph值的生物聚合物的第一組合物；

(ⅱ)提供包含具有確定的ph值的生物聚合物的第二組合物；

(ⅲ)不通過(guò)實(shí)質(zhì)上地相互混合而將組合物在反應(yīng)容器中結(jié)合；

(ⅳ)可選地冷凍組合物；

(ⅴ)將包含生物聚合物的組合物凍干，

(ⅴ)可選地純化和/或分離生物聚合物；

其中凍干過(guò)程中的最高溫度選以促進(jìn)所述生物聚合物可控和限定的降解，并且其中第一和第二組合物的ph值至少相差0.1或其中第一和第二組合物包含不同的生物聚合物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生物聚合物是具有高分子量的生物聚合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是具有天然高分子量的生物聚合物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包含至少一種生物聚合物的生物聚合物組合物的生產(chǎn)方法，其中所述至少一種生物聚合物具有確定的平均分子量和確定的分子量分布，所述方法包括：

(ⅰ)提供第一組合物，其包含ph在1.5至8.5之間一確定值的具有高分子量的生物聚合物；

(ⅱ)提供第二組合物，其包含ph在1.5至8.5之間一確定值的具有高分子量的生物聚合物；

(ⅲ)不通過(guò)實(shí)質(zhì)上地相互混合將組合物在反應(yīng)容器中結(jié)合；

(ⅳ)可選地冷凍組合物；

(ⅴ)將包含生物聚合物的組合物凍干，

(ⅵ)可選地純化和/或分離生物聚合物；

其中凍干過(guò)程中溫度選以促進(jìn)所述生物聚合物可控和限定的降解，并且其中第一和第二組合物的ph值相差至少0.1或其中第一和第二組合物包含不同的生物聚合物。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，生物聚合物是具有高分子量的生物聚合物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是具有天然高分子量的生物聚合物。

本發(fā)明還涉及所述生物聚合物組合物的生產(chǎn)方法的應(yīng)用和由所述方法生產(chǎn)的生物聚合物組合物。

定義

本發(fā)明文中，生物聚合物是由生物體產(chǎn)生的聚合物。本發(fā)明僅涉及天然高分子量的生物聚合物，除了在生物體內(nèi)發(fā)生的常見(jiàn)的和天然的修飾外，其優(yōu)選不被技術(shù)上或化學(xué)上修飾。作為聚合物，它們的特征在于重復(fù)的單體動(dòng)機(jī)。

通常生物聚合物分為三大主要類別：多聚單核苷酸，多肽和多糖。本發(fā)明文中，術(shù)語(yǔ)“生物聚合物”僅指多肽和多糖。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“生物聚合物”包括生物聚合物的所有天然產(chǎn)生的修飾，例如糖基化，部分水解或?qū)⒅|(zhì)附著于多肽。

由生物單元組成但不在生物體中產(chǎn)生的聚合物如聚乳酸不被認(rèn)為是本發(fā)明含義內(nèi)的生物聚合物。根據(jù)上述定義如本發(fā)明制備的生物聚合物，是本發(fā)明的生物聚合物。

本發(fā)明的生物聚合物的非限制性實(shí)例包括：膠原，淀粉，纖維素衍生物，糖胺聚糖，多糖或巖藻多糖。

在本發(fā)明中，冷凍組合物是指固態(tài)的組合物，不管其在25℃下?tīng)顟B(tài)如何。在大多數(shù)實(shí)施方案中，冷凍組合物是在25℃下處于液態(tài)的組合物，其被冷卻至固態(tài)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)液氮沖擊冷凍進(jìn)行冷卻。冷卻的另一種方式是在冰箱中冷卻和冷凍。在優(yōu)選的實(shí)施例中，在-50℃至-4℃下進(jìn)行冷凍。

在本發(fā)明中，凍干或使凍干是指脫水過(guò)程，其中通過(guò)升華除去水。凍干通常被稱為冷凍干燥。一般凍干包括三個(gè)階段：

(ⅰ)冷凍待脫水的組合物，其中重要的是將組合物冷卻到低于其三相點(diǎn)溫度。合適的冷凍方法取決于組合物的組分。

(ⅱ)大部分水被除去的初級(jí)干燥階段，其中壓力降低到幾微巴(μbar)甚至更低。在這個(gè)階段通常調(diào)節(jié)溫度以使水升華。優(yōu)選地，但不是必須的，在這個(gè)階段，溫度保持在低于0℃。

(ⅲ)第二干燥階段，其中壓力可選地降低到微巴(μbar)的范圍，并且溫度優(yōu)選升高到0℃之上以除去更強(qiáng)結(jié)合的水。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在第二干燥階段期間控制溫度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在初級(jí)干燥階段期間控制溫度。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，使用僅一個(gè)干燥步驟干燥組合物，其中條件對(duì)應(yīng)于第二干燥步驟的條件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用僅一個(gè)干燥步驟干燥組合物，其中條件對(duì)應(yīng)于第一干燥步驟的條件。

在本發(fā)明的含義內(nèi)，“升華過(guò)程中的溫度”是指放置組合物的儲(chǔ)存板的溫度。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)水溶液是指溶劑是水的溶液。本發(fā)明中，該術(shù)語(yǔ)還指組分的粗粒或膠體懸浮體，例如非水溶性生物聚合物或不溶于水的化妝品添加物。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)乳液是指通常不互溶的液體的混合物。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)乳液特別指油包水或水包油乳液。優(yōu)選本發(fā)明中，通過(guò)使用乳化劑或乳化器使乳液穩(wěn)定。乳化劑的非限制性實(shí)例為卵磷脂，硬脂酰乳酸鈉，具有乳化功能的聚合物或洗滌劑。

本發(fā)明中，反應(yīng)容器是用于容納和處理組合物的任何合適的容器。所述容器優(yōu)選適于冷凍和凍干過(guò)程。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，生物聚合物可以在冷凍干燥過(guò)程中經(jīng)控制降解，生成具有確定的平均分子量的生物聚合物。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)在凍干過(guò)程中結(jié)合冷凍組合物影響被降解的生物聚合物的分子量分布。

本發(fā)明的第一方面涉及包含至少一種生物聚合物的生物聚合物組合物的生產(chǎn)方法，其中所述至少一種生物聚合物具有確定的平均分子量和確定的分子量分布，所述方法包括：

(ⅰ)提供包含具有確定的ph值的生物聚合物的第一組合物；

(ⅱ)提供包含具有確定的ph值的生物聚合物的第二組合物；

(ⅲ)不通過(guò)實(shí)質(zhì)上地相互混合將組合物在反應(yīng)容器中結(jié)合；

(ⅳ)可選地冷凍組合物；

(ⅴ)將包含生物聚合物的組合物凍干，

(ⅵ)可選地純化和/或分離生物聚合物；

其中凍干過(guò)程中的最高溫度選以促進(jìn)所述生物聚合物受控和限定的降解，并且其中第一和第二組合物的ph值至少相差0.1和/或其中第一和第二組合物包含不同的生物聚合物。

不通過(guò)實(shí)質(zhì)上地混合組合物將組合物結(jié)合是指一種方法，其中將組合物在一個(gè)反應(yīng)容器中結(jié)合，但保留化合物各自濃度和其它性質(zhì)，例如ph值。這可以通過(guò)提供和結(jié)合兩種冷凍組合物或采用交疊組合物并在冷凍干燥之前冷凍來(lái)結(jié)合具有高粘度的兩種組合物實(shí)現(xiàn)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將組合物冷凍，然后在一個(gè)反應(yīng)容器中結(jié)合。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是具有高分子量的生物聚合物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是具有天然高分子量的生物聚合物。

包含生物聚合物的組合物可以是任何種類的組合物，只要所述組合物除了所述生物聚合物外還至少包含少量水。所述組合物可以包含其他生物聚合物，即混合物。

第一和第二組合物可以包含不同的生物聚合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，兩種組合物都包含相同的生物聚合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二組合物各自僅包含一種生物聚合物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是具有高分子量的生物聚合物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是具有天然高分子量的生物聚合物。

該方法特別適用于選自透明質(zhì)酸，膠原，糖胺聚糖，多糖和巖藻多糖的生物聚合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是糖胺聚糖或多糖。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物選自藻酸鹽，根瘤菌膠，羧甲基纖維素鈉，支鏈淀粉，生物糖gum-1，葡甘露聚糖，β-葡聚糖，果膠，酸豆籽多糖類和透明質(zhì)酸中的一種或多種。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是藻酸鈉或透明質(zhì)酸。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是透明質(zhì)酸。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含至少一種生物聚合物的第一和/或第二組合物是水溶液或乳液。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含生物聚合物的兩種組合物都是水溶液或乳液。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，包含生物聚合物的第一和/或第二組合物是具有低粘度至高粘度的凝膠或液體。

特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，升華過(guò)程中控制的條件和組合物參數(shù)的控制，例如，鹽含量，ph值，真空，使用乳化劑，使被降解的生物聚合物的平均分子量得到控制。

特別地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，結(jié)合包含具有不同ph值的相同生物聚合物的組合物導(dǎo)致生物聚合物平均分子量的不同分布，其使不同特定的分子量分布依賴于組合物的ph值和/或體積。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含生物聚合物的第一和/或第二冷凍組合物的ph值選自1.5至8.5間。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該ph值選自2.5和6之間。

如果第一和第二組合物包含相同的生物聚合物，則優(yōu)選組合物的ph值至少相差0.1。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二組合物的ph值至少相差0.5。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二組合物的ph值至少相差1。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二冷凍組合物的ph值至少相差2。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ph值，升華過(guò)程中的溫度和生物聚合物的平均分子量之間是直接相關(guān)的。圖2顯示分析了透明質(zhì)酸的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)。

顯然，被制備的生物聚合物的最終產(chǎn)物的平均分子量直接取決于所選擇的溫度和ph值的組合。發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，堆疊或混合多個(gè)冷凍組合物以改變最終產(chǎn)品的分子量分布是可能的。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，升華過(guò)程中的最高溫度選自-40℃至150℃。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該溫度選自0至140℃。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該溫度選自60至130℃。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該溫度為120℃。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，升華過(guò)程中的溫度在凍干過(guò)程中是變化的。在優(yōu)選的第一實(shí)施方案中，升華在兩個(gè)溫度下進(jìn)行。優(yōu)選溫度曲線的示意圖如圖3所示。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，升華過(guò)程在兩個(gè)不同的溫度下進(jìn)行。優(yōu)選地，第一溫度選自-30℃至+40℃，第二溫度選自60至130℃。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一溫度選自-20至20℃，第二溫度選自80至120℃。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一溫度為10℃，第二溫度為120℃。

在另一個(gè)實(shí)施例中，溫度曲線包括超過(guò)兩個(gè)的不同溫度。在另一個(gè)實(shí)施例中，溫度曲線包括一個(gè)連續(xù)溫度梯度。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，升華步驟中的壓力在50μbar至800μbar之間。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，壓力在75μbar至600μbar之間，更優(yōu)選為100μbar至400μbar之間，甚至更優(yōu)選為150μbar至300μbar之間。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，升華步驟中的壓力為300μbar。

用該方法制備的生物聚合物組合物可以從組合物中純化或分離出來(lái)，然而優(yōu)選不進(jìn)行進(jìn)一步的純化或分離步驟。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物直接適用于進(jìn)一步的處理和/或使用。

本發(fā)明不僅涉及具有確定的平均分子量的生物聚合物組合物的生產(chǎn)方法，而且涉及所述具有確定的平均分子量的生物聚合物組合物的生產(chǎn)方法的應(yīng)用，以及涉及由所述方法生產(chǎn)的具有確定的平均分子量的生物聚合物組合物。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于生產(chǎn)具有確定的平均分子量的生物聚合物，該生物聚合物選自透明質(zhì)酸，膠原，糖胺聚糖，多糖和巖藻多糖。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物聚合物是糖胺聚糖。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于生產(chǎn)具有確定的平均分子量的生物聚合物，該生物聚合物選自藻酸鹽，根瘤菌膠，羧甲基纖維素鈉，支鏈淀粉，生物糖gum-1，葡甘露聚糖，β-葡聚糖，果膠，酸豆籽多糖類和透明質(zhì)酸。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于生產(chǎn)具有確定的平均分子量的生物聚合物，該生物聚合物選自藻酸鈉或透明質(zhì)酸。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于生產(chǎn)具有確定的平均分子量的透明質(zhì)酸。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明適用于生產(chǎn)復(fù)合組合物，包括生物聚合物。這些組合物包含至少一種具有確定的平均分子量的生物聚合物和其它可選的組分，例如護(hù)膚、藥物或化妝品成分，并且僅需要乳化或溶解即可使用。

復(fù)合組合物可以包含額外的生物聚合物或其它聚合物。任何組合物都是合適的，只要該組合物額外包含水即可。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一和/或第二組合物包含：

(ⅰ)一種生物聚合物，

(ⅱ)水，

(ⅲ)可選地，藥學(xué)、皮膚學(xué)和/或化妝品可接受的化合物和/或油；

(ⅳ)可選地，一種乳化劑

(ⅴ)可選地，額外的藥學(xué)、皮膚學(xué)或化妝品活性組分。

在另一實(shí)施方案中，第一和/或第二冷凍組合物是具有低粘度至高粘度的凝膠或液體。

第一和/或第二組合物優(yōu)選進(jìn)一步含有額外的化妝品、護(hù)膚品或藥學(xué)成分或添加劑。這些成分的非限制性實(shí)例是潤(rùn)膚劑，化妝品可接受的成分和染料，香料或藥用活性物質(zhì)如泛醇。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二冷凍組合物包含相同的化合物，除生物聚合物或ph值外。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一和第二冷凍組合物包含相同的化合物和相同的生物聚合物，僅ph值不同。

所述成分或添加劑的非限制性實(shí)例是：皮膚調(diào)理劑，皮膚潤(rùn)滑劑，皮膚水潤(rùn)劑，例如泛醇或泛醇酚，天然保濕因子，如甘油，乳酸或尿素。或者是物理或化學(xué)防曬劑，去角質(zhì)劑，例如α-或β-羥基酸，α-或β-酮酸。其他可能的成分包括自由基捕獲劑，抗老化劑，維生素或其衍生物，例如維生素c(抗壞血酸)或其酯或糖苷，抗氧化劑，如兒茶素類或黃酮類化合物。

其他潛在的成分包括白藜蘆醇，谷胱甘肽，阿魏酸，q10，多酚，神經(jīng)酰胺，飽和和/或不飽和脂肪酸，以及其甘油酯。此外，酯，例如蠟酯，例如霍霍巴油，一般的甘油三酯(中性油，阿甘果油，牛油果黃油)或植物油中的不能皂化的成分。

其他成分包括植物、生技或源于海產(chǎn)品的多糖，及其水解產(chǎn)物。其他成分可能包括酶，例如菠蘿蛋白酶，輔酶，酶抑制劑，氨基酸，天然和合成寡肽，多肽如膠原和彈性蛋白，以及其水解產(chǎn)物，神經(jīng)肽，生長(zhǎng)因子，生物堿。在一些實(shí)施方案中，所述成分可選地包括植物藥物，例如七葉素，人參皂苷，螺可吉寧或蘆薈素。其他聚合物是藻酸鹽，纖維素衍生物，淀粉，殼聚糖，硫酸軟骨素，具有生物功能或生物相容性的其他合成的生物聚合物。

化妝品添加劑的非限制性實(shí)例包括美白劑，無(wú)機(jī)或合成填料或裝飾物質(zhì)，例如著色顏料或染料或顆粒。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括眼睛，嘴唇或臉部的化妝美化物質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二冷凍組合物還包含治療活性劑，例如抗粉刺或抗紅斑痤瘡劑，抗菌劑如銀及其衍生物，碘或pvp-碘，止汗劑，止痛物質(zhì)如利多卡因或布洛芬，收斂物質(zhì)，除臭化合物，抗脂溢物質(zhì)或防腐劑。此外，細(xì)胞或細(xì)胞成分，如自體細(xì)胞，外源細(xì)胞，干細(xì)胞或富血小板血漿(prp)。

第一和/或第二組合物優(yōu)選含有其它成分，例如穩(wěn)定劑，防腐劑，以控制產(chǎn)品的最終參數(shù)，如溶解性或乳化性，機(jī)械穩(wěn)定性，產(chǎn)品粘度或觸感。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，第一和第二組合物在合適的容器中結(jié)合，該容器適用于冷凍和凍干過(guò)程，也可選地用于包裝所述凍干組合物，該凍干組合物包含至少一種具有確定的平均分子量和確定的分子量分布的生物聚合物。

本發(fā)明還涉及所述包含具有確定的平均分子量的生物聚合物的組合物的生產(chǎn)方法的應(yīng)用，和根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的包含生物聚合物的組合物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，最終組合物可用作含水液體，低粘度乳液，類精華液，面膜，面霜，面膜霜，片或局部使用的瓣的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1：透明質(zhì)酸的平均分子量、皮膚滲透性和生物活性的相關(guān)性。

圖2：當(dāng)根據(jù)本發(fā)明制備包括透明質(zhì)酸的組合物時(shí)，ph、溫度和獲得的平均分子量的相關(guān)性。

圖3：在凍干過(guò)程中隨時(shí)間的溫度分布示意。

圖4：確定根據(jù)本發(fā)明制備的透明質(zhì)酸的平均分子量的校準(zhǔn)曲線。

圖5：根據(jù)本發(fā)明制備的中性油(a)和sepinovemt-10(b)的洗脫和分子質(zhì)量曲線。

圖6：120℃冷凍干燥，天然透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸的洗脫曲線(a)和分子質(zhì)量曲線(b)的比較。

圖7：在不同溫度下凍干透明質(zhì)酸，sepinovemt-10和中性油的混合物的洗脫曲線(a)和分子量曲線(b)的比較。

圖8：ph調(diào)節(jié)至6.21-2.9的1wt％高分子量ha樣品的凍干樣品的分子質(zhì)量。

圖9：ph調(diào)節(jié)至6.21-2.9的1wt％高分子量ha樣品的凍干樣品的分子量分布。

圖10：在不同溫度下凍干的含有乳化劑的透明質(zhì)酸的分子量。

圖11：以不同體積比堆積的ph調(diào)節(jié)至6.21-2.9的1wt％高分子量ha樣品的凍干樣品的分子量分布。

圖12：以不同體積比堆積的ph調(diào)節(jié)至4.9-3.5的1wt％的支鏈淀粉樣品的凍干樣品的分子量分布。

圖13：以不同體積比堆積的ph調(diào)節(jié)至3.5和7.15的1wt％海藻酸鈉樣品的凍干樣品的分子量分布。

實(shí)施例

實(shí)施例1：透明質(zhì)酸的受控降解

將去離子水轉(zhuǎn)移至1升的實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器中并在75℃下攪拌。加入透明質(zhì)酸粉末，并在75℃，700rpm下攪拌15分鐘，直到物質(zhì)溶解。加入乳化劑組分并在50℃，1400rpm，減壓(200μbar)下攪拌15分鐘。加入油組分并以1400rpm/45℃/200μbar攪拌10分鐘，然后在2100rpm/45℃/200μbar下攪拌5分鐘。將得到的乳液冷卻至室溫并轉(zhuǎn)移到10ml玻璃小瓶中，并在環(huán)境條件下儲(chǔ)存過(guò)夜。將樣品在深冷凍室中冷凍至少16小時(shí)，隨后凍干至最高目標(biāo)溫度。

作為原理的證明，透明質(zhì)酸是按照本發(fā)明的方法制備的。本文中，純透明質(zhì)酸，以及透明質(zhì)酸與mct中性油和sepinovemt-10的組合物在不同溫度下凍干。

分析以下樣品：

1、中性油，未處理

2、sepinovemt-10，未處理

3、透明質(zhì)酸，未處理

4、sepinovemt-10，在120℃凍干

5、透明質(zhì)酸，在120℃凍干

6、混合物(透明質(zhì)酸，中性油和sepinovemt-10)，在40℃下凍干

7、混合物，在60℃下凍干

8、混合物，在80℃下凍干

9、混合物，在100℃下凍干

10、混合物，在120℃凍干

使用3個(gè)分析柱在hplc系統(tǒng)上使用尺寸排阻色譜法分析樣品。將樣品溶解在ph7.4的pbs緩沖液中，通過(guò)過(guò)濾除去不溶成分。

所述柱使用葡聚糖/支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)。樣品的分子量根據(jù)所述校準(zhǔn)曲線確定(校準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖4)。

只有純透明質(zhì)酸樣品是完全可溶的。sepinovemt-10或中性油的可溶成分在分析過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生任何問(wèn)題信號(hào)(參見(jiàn)圖5a和b)。

結(jié)果清楚地表明組合物和凍干溫度影響透明質(zhì)酸的平均分子量。雖然在高溫下凍干純透明質(zhì)酸的影響導(dǎo)致平均分子量的降低(見(jiàn)圖6a，b)，但在混合物中的影響更強(qiáng)(參見(jiàn)圖7a，b)。

從整體上看，凍干過(guò)程中參數(shù)的選擇適用于控制凍干后透明質(zhì)酸的平均分子量。

實(shí)施例2：ph值對(duì)降解的影響

在80℃下將分子量為1.478mioda的透明質(zhì)酸(contipro，mw，根據(jù)凝膠滲透色譜法)溶解在1wt％的蒸餾水溶液中5分鐘。用鹽酸調(diào)節(jié)ph在2.9-6.21的范圍內(nèi)。

將7.5mlha溶液置于10ml玻璃小瓶中，將樣品在-20℃下冷凍過(guò)夜，并置于christepsilon2-10dlscplusht裝置中，并根據(jù)如圖3所示的10/120℃溫度曲線處理約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并采用針對(duì)支鏈淀粉和葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)的凝膠滲透色譜法進(jìn)行分析。

根據(jù)調(diào)節(jié)的ph，所有樣品裂解，在ph6.21時(shí)顯示最大值為766kda，在ph2.9時(shí)最小值為84.75kda(圖7)。聚合物中游離酸官能團(tuán)的量越高聚合物裂解的傾向越高。圖8中示出了高分子量樣品和低分子量樣品的對(duì)應(yīng)電泳圖。

實(shí)施例3：具有不同分子量的透明質(zhì)酸的降解

在80℃下，將四種不同類型的透明質(zhì)酸(contipro/gfn3010(mw：1478kda)，principiumcube3(mw：733kda)，principiumsignal-10(mw：25kda)和fredamini-ha(mw：27kda))溶于1wt％的蒸餾水溶液中5分鐘。溶液按原樣使用或?qū)h調(diào)節(jié)至約3.5。

將7.5mlha溶液置于10ml玻璃小瓶中，將樣品在-20℃下冷凍過(guò)夜，并置于christepsilon2-10dlscplusht裝置中，并根據(jù)如圖3所示的10/120℃或可選地120℃溫度曲線處理約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并采用針對(duì)支鏈淀粉和葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)的凝膠滲透色譜法進(jìn)行分析。

高分子量和中等分子量的透明質(zhì)酸在原始ph下溶解于蒸餾水中顯示出分子量的適度衰減，而物質(zhì)的分子量在低ph下則衰減顯著，如下表所示。

實(shí)施例4：含有透明質(zhì)酸的乳液

將5g高分子量透明質(zhì)酸(gfn/contipro3010，1.5mda)溶解在465g蒸餾水中，加熱至80℃，并采用somakonmp-lb(11)混合裝置在1400rpm和環(huán)境壓力下攪拌15分鐘。

加入7.5gsepinovemt-10(inci名稱：丙烯酸羥乙酯(和)丙烯?；谆；撬徕c共聚物)，將ph調(diào)節(jié)至3.05，將混合物在80℃下以1400rpm/200μbar攪拌15分鐘。

加入25g作為模型油性化合物的中鏈甘油三酯(mct)，并以2100rpm/200μbar均質(zhì)化5分鐘。

將7.5ml所得乳液置于10ml玻璃小瓶中，將樣品在-20℃下冷凍過(guò)夜，并置于christepsilon2-10dlscplusht裝置中，并在最高40，60，80，100和120℃下處理大約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并通過(guò)gpc分析。圖9顯示透明質(zhì)酸的分子量(mw)隨著最大處理溫度的升高而降低的溫度相關(guān)性。

實(shí)施例5：不同生物聚合物的凍干

在80℃下，將聚合物在1wt％的蒸餾水溶液中溶解5分鐘。測(cè)量溶液的ph，并將樣品在pbs緩沖液(ph7.4)中稀釋至0.3wt％，采用針對(duì)支鏈淀粉和葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)的尺寸排阻色譜法，來(lái)測(cè)定未處理的聚合物溶液的分子量分布。

將7.5ml聚合物溶液置于10ml玻璃小瓶中，樣品在-20℃下冷凍過(guò)夜，并置于christepsilon2-10dlscplusht裝置中，并根據(jù)如圖3所示的10/120℃溫度曲線處理約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并通過(guò)gpc分析。結(jié)果如下表所示。

藻酸鈉：

多糖：

實(shí)施例6：采用交疊的透明質(zhì)酸溶液的ph和體積變化

在80℃下，將分子量為1.478mioda的透明質(zhì)酸(contipro，mw，根據(jù)凝膠滲透色譜法)在1wt％的蒸餾水溶液中溶解5分鐘。所述溶液的一部分在常規(guī)ph下使用，第二部分用鹽酸調(diào)節(jié)至ph2.9。

將ph6.21的ha溶液以0.75至6.75ml的不同體積分別置于10ml玻璃小瓶中。樣品在-20℃下冷凍，并分別用6.75至0.75ml的ph2.9ha溶液交疊，并再次冷凍，并在-20℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。相應(yīng)的體積比如下表所示：

將樣品置于christ2-10dlscplusht裝置中，根據(jù)圖3所示的10/120℃溫度曲線處理大約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并采用針對(duì)支鏈淀粉和葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)的凝膠滲透色譜法進(jìn)行分析。

根據(jù)體積比可以形成不同的分子量分布(參見(jiàn)圖10)，說(shuō)明根據(jù)體積分?jǐn)?shù)和體積分?jǐn)?shù)中調(diào)整的ph值，任何分子量分布都可以實(shí)現(xiàn)。根據(jù)靶向生物學(xué)功能，可以設(shè)計(jì)出最佳的分子量分布。

實(shí)施例7：采用交疊的支鏈淀粉溶液的ph和體積變化

將分子量為371kda的支鏈淀粉(hayashibara，mw，根據(jù)凝膠滲透色譜法)在80℃下在1wt％的蒸餾水溶液中溶解5分鐘。所述溶液的一部分在常規(guī)ph(4.9)下使用，第二部分用鹽酸調(diào)節(jié)至ph3.5。

將ph4.9的支鏈淀粉溶液以0.75至6.75ml的不同體積分別置于10ml玻璃小瓶中。樣品在-20℃下冷凍，并以6.75至0.75ml的ph2.9支鏈淀粉溶液交疊，并再次冷凍，-20℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。相應(yīng)的體積比如下表所示。

將樣品置于christ2-10dlscplusht裝置中，根據(jù)圖3所示的10/120℃溫度曲線處理大約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并采用針對(duì)支鏈淀粉和葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)的凝膠滲透色譜法進(jìn)行分析。

根據(jù)體積比可以形成不同的分子量分布(參見(jiàn)圖11)。分子量mw主要受低ph溶液的量的影響。

實(shí)施例8：采用交疊的藻酸鈉溶液的ph和體積變化

在80℃下，將分子量為881kda的藻酸鈉(cargill，mw，根據(jù)凝膠滲透色譜法)在1wt％的蒸餾水溶液中溶解5分鐘。所述溶液的一部分在常規(guī)ph(7.15)下使用，第二部分用鹽酸調(diào)節(jié)至ph3.5。

將ph7.15的藻酸鈉溶液以0.75至6.75ml的不同體積分別置于10ml玻璃小瓶中。樣品在-20℃下冷凍，并以6.75至0.75ml的ph3.5藻酸鈉溶液交疊，并再次冷凍，-20℃下儲(chǔ)存過(guò)夜。相應(yīng)的體積比如下表所示。

將樣品放置在christ2-10dlscplusht裝置中，并根據(jù)圖3所示的10/120℃溫度曲線處理大約20小時(shí)。

將經(jīng)凍干的樣品在濃度為0.3wt％的gpc緩沖液(ph7.4)中稀釋，并采用針對(duì)支鏈淀粉和葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)的凝膠滲透色譜法進(jìn)行分析。根據(jù)體積比可以形成不同的分子量分布(參見(jiàn)圖12)。分子量的變化主要受凍干條件的影響，大于受低ph溶液量的影響。