一種生長抑素的合成工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于多肽藥物合成【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種十四肽生長抑素固相合成工藝的改進，步驟如下：步驟1，將經(jīng)溶脹處理的樹脂和溶于DCM的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH和DIEA加入反應(yīng)罐，攪拌反應(yīng)以形成Fmoc‐Cys(Acm)‐樹脂；步驟2，向上一步驟所得的Fmoc‐Cys(Acm)‐樹脂中加入DMF溶液，使物料脫去保護基團，加入溶解于DMF中的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH和縮合劑，攪拌反應(yīng)以形成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐樹脂；步驟3，循環(huán)步驟2去保護基團、保護氨基酸活化、偶聯(lián)反應(yīng)的操作，以形成十四肽樹脂；步驟4，對上一步驟所得的十四肽樹脂進行收縮處理，然后經(jīng)裂解液裂解，除去樹脂，得還原型粗肽固體；步驟5，加水溶解粗肽固體，加碘的乙醇溶液氧化，形成環(huán)化十四肽；環(huán)肽溶液上制備液相純化，再經(jīng)冷凍干燥后，制得精肽。
【專利說明】一種生長抑素的合成工藝

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽藥物合成【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種十四肽生長抑素固相合成工藝 的改進。

【背景技術(shù)】
[0002] 生長抑素是人工合成的環(huán)狀十四氨基酸肽，其英文名為：Somatostatin，結(jié)構(gòu)式 為：

【權(quán)利要求】
1. 一種生長抑素的合成方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1，將經(jīng)溶脹處理的樹脂和溶于DCM的Fmoc - Cys (Acm) - OH和DIEA加入反應(yīng)罐 (DIEA :Fmoc -Cys(Acm) -OH = 2?3 :1，摩爾比），偶聯(lián)溫度0?35°C，通入惰性氣體，攪拌 反應(yīng)12?36h以形成Fmoc - Cys (Acm)-樹脂； 步驟2,向上一步驟所得的Fmoc - Cys(Acm)-樹脂中加入重量濃度為18?25% PIP的DMF溶液，溫度0?35°C，通入惰性氣體，使物料脫去保護基團，加入溶解于DMF中 的Fmoc - Ser (tBu) - OH和縮合劑，反應(yīng)溫度0?35°C，通入惰性氣體，攪拌反應(yīng)以形成 Fmoc - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 步驟3,循環(huán)步驟2去保護基團、保護氨基酸活化、偶聯(lián)反應(yīng)的操作，依次偶聯(lián)Fmoc - Thr (tBu) - OH、Fmoc - Phe - OH、Fmoc - Thr (tBu) - OH、Fmoc - Lys(Boc) - 0H、 Fmoc - Trp (Boc) - OH、Fmoc - Phe - OH、Fmoc - Phe - OH、Fmoc - Asn (Trt) - 0H、 Fmoc - Lys (Boc) - OH、Fmoc - Cys (Acm) - OH、Fmoc - Gly - OH、Fmoc - Ala - 0H，以形成十四 肽樹脂； 步驟4,對上一步驟所得的十四肽樹脂進行收縮處理，然后經(jīng)裂解液（TFA :TIS = 95 : 5, V/V)裂解，除去樹脂，得還原型粗肽固體； 步驟5,加水溶解粗肽固體，加碘的乙醇溶液氧化，形成環(huán)化十四肽；環(huán)肽溶液上制備 液相純化，再經(jīng)冷凍干燥后，制得精肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步驟1使用2 - CTC樹脂為起 始原料，F(xiàn)moc - Cys (Acm) - OH為起始保護氨基酸，合成Fmoc - Cys (Acm)-樹脂，其方法如 下：取固相合成樹脂2 -CTC加入到反應(yīng)器內(nèi)，加入DCM浸泡洗滌3次，每次lOmin，加入 DCM，攪拌溶脹；取Fmoc - Cys(Acm) - OH加入到溶解罐，加入DCM攪拌溶解，加入DIEA溶 解澄清，之后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，依次加入DMF、DCM洗滌；其中DIEA與 Fmoc - Cys(Acm) - OH的摩爾比為2?3 :1 ;氨基酸與樹脂偶聯(lián)溫度為O?25°C，攪拌反應(yīng) 12?36h，并通入惰性氣體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，步驟IDIEA與Fmoc - Cys(Acm) - OH 的摩爾比為2 :1 ;偶聯(lián)溫度為20?25°C，攪拌反應(yīng)24h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步驟2合成 Fmoc-Ser (tBu)-Cys(Acm)-樹脂方法如下： 脫保護基團：洗滌完畢的Fmoc -Cys(Acm)-樹脂中加入重量濃度為20% PIP的DMF溶 液，攪拌反應(yīng)15min ;脫保護結(jié)束，依次加入DMF、DCM洗滌； 保護氨基酸活化：保護氨基酸Fmoc - Ser (tBu) - OH、Cl - HOBt加入到溶解罐，加入DMF 攪拌溶解，加入DIC溶解澄清； 偶聯(lián)反應(yīng)：氨基酸活化結(jié)束后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)攪拌反應(yīng)3h ;偶聯(lián)結(jié)束，依次加入DMF、DCM 洗漆。 其中，去保護溫度O?25°C，通入惰性保護氣體；氨基酸活化溫度O?25°C，活化過程 通入惰性保護氣體；偶聯(lián)反應(yīng)溫度〇?25°C，通入惰性保護氣體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步驟3合成十四肽樹脂方法如 下： 第一循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc-Thr(tBu) - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc- 保護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第二循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Phe - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護 基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys (Acm)-樹脂； 第三循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Thr (tBu) - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Cys (A cm)-樹脂； 第四循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Lys (Boc) - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Lys (Boc) -Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (t Bu) - Cys(Acm)-樹脂； 第五循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Trp (Boc) - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Trp (Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe-ThrCt Bu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第六循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Phe - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護 基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到 Fmoc-Phe-Trp (Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe-Thr (t Bu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第七循環(huán),重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Phe - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護 基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到 Fmoc-Phe-Phe-Trp (Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe-T hr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第八循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc -Asn(Trt) - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Asn (Trt) -Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc) -T hr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第九循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Lys (Boc) - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Lys (Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe-Trp(Boc) -L ys (Boc) - Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第十循，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc -Cys (Acm) -OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保 護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Cys (Acm) -Lys(Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe-Trp (Boc) - Lys(Boc) - Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第i 循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Gly - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保 護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Gly-Cys (Acm) -Lys(Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe -Trp(Boc) - Lys(Boc) - Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 第十二循環(huán)，重復(fù)4所述操作，加入Fmoc - Ala - OH作為保護氨基酸，通過去Fmoc -保 護基團，活化保護氨基酸，偶聯(lián)反應(yīng)得到Fmoc-Ala-Gly-Cys (Acm) -Lys(Boc) -Asn(Trt) -Phe -Phe - Trp(Boc) - Lys(Boc) - Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂； 其中，各步驟去保護溫度0?25°C，通入惰性保護氣體，攪拌反應(yīng)15min ;氨基酸活化溫 度0?25°C，活化過程通入惰性保護氣體；偶聯(lián)反應(yīng)溫度0?25°C，通入惰性保護氣體，攪 拌反應(yīng)3h。
6.根據(jù)權(quán)利要求4、5所述的方法，其特征在于，去保護溫度為10?20°C，活化保護氨 基酸溫度為〇?KTC，偶聯(lián)溫度為20?25°C ;投料比值為， 具有保護基團氨基酸：2 - CTC樹脂=2?3 :1摩爾， Cl - HOBt :2 - CTC 樹脂=2 ?3 :1 摩爾， DIC :2 - CTC樹脂=2?3 :1摩爾； 具有保護基團的Cys為Fmoc - Cys(Acm) - OH。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步驟4采用裂解液（TFA :TIS = 95 :5，V/V)對樹脂進行十四肽裂解處理，同步進行切肽和脫除Acm以外的側(cè)鏈保護基團，方 法如下： 用甲醇洗滌步驟3所得十四肽樹脂，抽干；干燥后的肽樹脂按Ig :10ml的比例加入裂 解液（TFA :TIS = 95 :5, V/V)，攪拌反應(yīng)2h，抽濾，除去樹脂，濾液加入乙醚內(nèi)沉降3h，離心 得到粗肽固體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步驟5所述的用I2環(huán)化粗肽， 同步除去Cys (Acm)的Acm保護基團，方法如下： 取粗肽固體加水溶解成lmg/mL的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完畢后攪拌，檢 測反應(yīng)結(jié)束后加入過量的硫代硫Ife納，中和過量的鵬。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步驟5所述的環(huán)化粗肽分離提 純方法如下： 初純：流動相A :TFA/純化水，B :乙腈（色譜純），波長：230nm 洗脫梯度如下：流動相B用5%平衡2min，在Imin內(nèi)升到35%，保持35%直到洗脫結(jié) 束；循環(huán)上樣洗脫進行操作，收集主峰溶液， 精純一步：流動相A相：HAC/TEA/純化水，B相：乙腈，波長：230nm 洗脫梯度：流動相B用5%平衡2min，在Imin內(nèi)升到26%，在40min內(nèi)升到28%，保持 直到洗脫結(jié)束，循環(huán)上樣洗脫進行操作，收集主峰溶液， 精純二步：流動相A相：HAC/純化水，B相：乙腈，波長：230nm 洗脫梯度：流動相B用5%平衡2min，在Imin內(nèi)升到19%，在20min內(nèi)升到22%，在 22%保持20min洗脫結(jié)束，循環(huán)上樣洗脫進行操作，收集主峰溶液，轉(zhuǎn)鹽：流動相A相：醋酸 銨/純化水，B相：乙腈，波長：230nm 洗脫梯度：流動相B用5%轉(zhuǎn)鹽20min，洗脫流動相C 3% HAC水溶液，洗脫梯度：流 動相B用5%平衡15min，在Imin內(nèi)升到25%，在25%保持20min洗脫結(jié)束， 收集所需要的流出液，去鹽，除盡乙腈，凍干獲得精生長抑素。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成方法，其特征在于，步驟如下： (1) 合成 Fmoc - Cys(Acm)-樹脂 稱取 0? 83kg 的 2 -CTC 樹脂（100 -200 目，0? 6mmol/g)，加入 DCM 洗滌 3 次，每次 lOmin， 加入DCM，室溫攪拌溶脹；加入用DCM溶解的Fmoc -Cys (Acm) -OH (摩爾量為樹脂的2倍）， 加入330ml DIEA(摩爾量為樹脂的4倍），通入惰性氣體，于22. 5±2. 5°C條件下反應(yīng)24小 時，偶聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，得到肽偶合樹脂； (2) 合成 Fmoc - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入DMF溶解的Fmoc - Ser (tBu) - OH(摩爾量為樹脂的 2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于 7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián) 結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (3) 合成 Fmoc - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入DMF溶解的Fmoc - Thr (tBu) - OH(摩爾量為樹脂的 2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于 7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián) 結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (4) 合成 Fmoc - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入DMF溶解的Fmoc - Phe - OH (摩爾量為樹脂的2倍）、 Cl -HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于7. 5±2. 5°C 攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián)結(jié)束后，DMF 洗滌3次，DCM洗滌3次； (5) 合成 Fmoc - Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Thr (tBu) - 0H(摩爾量為樹脂 的2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍）， 于7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶 聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (6) 合成 Fmoc - Lys(Boc) - Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Lys (Boc) - 0H(摩爾量為樹脂 的2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍）， 于7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶 聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (7) 合成 Fmoc-Trp (Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Cys (Ac m)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Trp (Boc) - 0H(摩爾量為樹脂 的2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍）， 于7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶 聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (8) 合成Fmoc-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc) -Thr(tBu) -Phe-Thr(tBu) -Ser(tBu) -Cys(Ac m)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié) 束后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Phe - OH(摩爾量為樹脂的 2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于 7. 5 ±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5 ±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián) 結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (9) 合成Fmoc-Phe-Phe-Trp (Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Cys (Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié) 束后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Phe - OH(摩爾量為樹脂的 2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于 7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián) 結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (10) 合成Fmoc -Asn(Trt) -Phe -Phe -Trp(Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe -Thr (tBu) -Se r (tBu) -Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Asn (Trt) - 0H(摩爾量為樹脂 的2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍）， 于7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶 聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (11) 合成Fmoc-Lys (Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc) -Thr (tBu) -Phe-Th r (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Lys (Boc) - 0H(摩爾量為樹脂 的2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍）， 于7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶 聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (12) 合成Fmoc-Cys (Acm) -Lys(Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc) -Thr (tB u) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Cys (Acm) - 0H(摩爾量為樹脂 的2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍）， 于7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶 聯(lián)結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (13) 合成Fmoc-Gly-Cys (Acm) -Lys(Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc) -Th r (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié) 束后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc - Gly - OH(摩爾量為樹脂的 2倍）、Cl - HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于 7. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián) 結(jié)束后，DMF洗滌3次，DCM洗滌3次； (14) 合成Fmoc-Ala-Gly-Cys (Acm) -Lys(Boc) -Asn(Trt) -Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys (Boc )-Thr (tBu) - Phe - Thr (tBu) - Ser (tBu) - Cys(Acm)-樹脂 再加入重量濃度為20% PIP的DMF溶液，于17. 5±2. 5°C攪拌反應(yīng)15min，脫保護結(jié)束 后，DMF洗滌6次，DCM洗滌2次；加入用DMF溶解的Fmoc -Ala -0 (摩爾量為樹脂的2倍）、 Cl -HOBT (摩爾量為樹脂的2倍），加入DIC溶解澄清（摩爾量為樹脂的2倍），于7. 5±2. 5°C 攪拌反應(yīng)，氨基酸活化后轉(zhuǎn)入反應(yīng)罐內(nèi)于22. 5±2. 5°C，攪拌反應(yīng)3小時，偶聯(lián)結(jié)束后，DMF 洗滌3次，DCM洗滌3次，洗滌后用甲醇收縮，真空干燥過夜，得到十四肽偶聯(lián)樹脂； (15) 肽樹脂的裂解 取步驟（14)所得十四肽偶聯(lián)樹脂，按Ig :10mL的比例加入裂解液（TFA :TIS = 95 :5， V/V)，攪拌反應(yīng)2h，抽濾，除去樹脂，濾液加入乙醚內(nèi)沉降3h，離心得還原型線性粗肽； (16) 粗肽氧化 加水溶解粗肽固體，將粗肽配成lmg/ml的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完畢后 攪拌，檢測反應(yīng)結(jié)束后加入過量的硫代硫酸鈉，中和過量的碘，獲得生長抑素粗品； (17) 精制純化 初純：流動相A :TFA/純化水、B :乙腈（色譜純），波長：230nm 洗脫梯度如下：流動相B用5%平衡2min，在Imin內(nèi)升到35%，保持35%直到洗脫結(jié) 束；循環(huán)上樣洗脫進行操作，收集主峰溶液； 精純一步：流動相A相：HAC/TEA/純化水，B相：乙腈，波長：230nm 洗脫梯度如下：流動相B用5%平衡2min，在Imin內(nèi)升到26%，在40min內(nèi)升到28%， 保持直到洗脫結(jié)束，循環(huán)上樣洗脫進行操作，收集主峰溶液； 精純二步：流動相A相：HAC/純化水，B相：乙腈，波長：230nm 洗脫梯度如下：流動相B用5 %平衡2min，在Imin內(nèi)升到19 %，在20min內(nèi)升到22 %， 在22%保持20min洗脫結(jié)束，循環(huán)上樣洗脫進行操作，收集主峰溶液； 轉(zhuǎn)鹽：流動相A相：醋酸銨/純化水；B相：乙腈，波長：230nm 梯度洗脫梯度：流動相B用5%轉(zhuǎn)鹽20min，洗脫流動相C 3% HAC水溶液，洗脫梯度： 流動相B用5%平衡15min，在Imin內(nèi)升到25%，在25%保持20min洗脫結(jié)束； 收集所需要的流出液，去鹽，除盡乙腈，凍干獲得精生長抑素。
【文檔編號】C07K1/04GK104311639SQ201410543151
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】崔學(xué)云, 楊平, 楊勇 申請人:海南中和藥業(yè)有限公司