一種雙靶向嵌合肽及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙靶向嵌合肽及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。所述嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其靶向作用于CXCR4+腫瘤細(xì)胞，協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)CXCR4/SDF?1a功能軸和NF?kB信號通路，降低CXCR4+腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。具體地，該嵌合肽由SDF?1a的氮端序列和NF?kB P50亞基的核定位序列（NLS）嵌合而成，通過氮端序列靶向識別腫瘤細(xì)胞表面受體CXCR4，抑制細(xì)胞內(nèi)SDF?1a/CXCR4功能軸作用；又作為穿膜肽促使NF?kB p50亞基 NLS序列有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，靶向抑制NF?kB的入核轉(zhuǎn)錄過程，在研究多靶點(diǎn)抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物方面具有重要價(jià)值。
【專利說明】
一種雙靶向嵌合肽及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種雙靶向嵌合肽及其在制備抗 腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是當(dāng)前危害人類健康的一類重大疾病，其典型特點(diǎn)是不受控制的增殖及轉(zhuǎn) 移。雖然在過去的幾十年中，因手術(shù)、放化療等方法的進(jìn)步腫瘤治療取得了長足的進(jìn)展，但 腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的多器官性衰竭依然是腫瘤致死的主要原因，所以高轉(zhuǎn)移性的腫瘤被稱為惡 性腫瘤。因此，針對新的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制，研發(fā)有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物是今后改善惡 性腫瘤多器官轉(zhuǎn)移的重要方向，也是整體改變腫瘤治療現(xiàn)狀的重要途徑。
[0003] 大量研究表明，乳腺癌，胃癌，前列腺癌，肝癌，宮頸癌等約23種具有高轉(zhuǎn)移活性的 癌細(xì)胞表面高表達(dá)趨化因子受體CXCR4,其特異性配體-趨化因子SDF-I (CXCL12)在人體肝 臟，骨髓、肺等器官高表達(dá)。腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)病灶后，通過血液/體液/淋巴系統(tǒng)到達(dá)高表 達(dá)SDF-Ia的器官組織，其表面受體CXCR4與SDF-Ia發(fā)生特異性識別，激活下游信號通路，包 括NF-kB信號通路的持續(xù)激活，促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生偽足而具有迀移能力，并分泌細(xì)胞外基質(zhì) 金屬蛋白酶MMP9,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等一系列分子幫助腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)， 從而促使腫瘤細(xì)胞在這些特異器官落巢，該過程與SDF-Ia呈濃度依賴性，因此CXCR4+腫瘤 通常會(huì)出現(xiàn)肝，骨髓和肺部的特異性轉(zhuǎn)移(機(jī)制如圖1所示）。實(shí)驗(yàn)證明CXCR4的抗體或拮抗 劑（如AMD3100)或重組SDF-Ia可有效抑制CXCR4+腫瘤細(xì)胞的特異性器官轉(zhuǎn)移。由此說明， CXCR4/SDF-1的相互作用直接介導(dǎo)了腫瘤的特異性器官轉(zhuǎn)移，是研究腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的重 要靶點(diǎn)。
[0004] 另外，核轉(zhuǎn)錄因子KB(NF-kB)是由NF-KBl(p50/pl05)，RELA(p65)和RELB等網(wǎng)狀內(nèi) 皮組織增殖(Reticuloendothel iosis，REL)蛋白形成的一系列二聚體家族的總稱，近年發(fā) 現(xiàn)其在腫瘤發(fā)展過程中扮演關(guān)鍵角色。在多種血液和實(shí)體瘤中，NF-kB過度表達(dá)并通過多種 途徑被持續(xù)激活。活化后的NF-kB(主要以p65/p50亞基構(gòu)成的二聚體形式存在)通過p50亞 基的核定位序列（nuclear localization sequrence，NLS)與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體復(fù)合物 (import in-a)結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，從而啟動(dòng)多種癌基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增 殖、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡逃逸等。在卵巢癌、結(jié)腸癌及胰腺癌等多種體內(nèi)模型研究中，阻斷NF-kB 信號通路的不同環(huán)節(jié)均可有效發(fā)揮抗腫瘤作用。因此NF-kB信號通路已成為抗腫瘤藥物作 用的重要靶標(biāo)。其中阻斷NF-kB的入核轉(zhuǎn)運(yùn)過程即是有效抑制NF-kB信號通路活性的重要手 段。
[0005] 目前有大量研究作用于CXCR4/SDF-1功能軸和NF-kB信號通路的抑制劑用于抗腫 瘤藥物發(fā)現(xiàn)。例如CXCR4的內(nèi)源性配體SDF-Ia的衍生肽被用于研究抑制CXCR/SDF-la相互作 用或作為其他藥物的引導(dǎo)肽靶向識別CXCR4+腫瘤細(xì)胞，但由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的NF-kB信號通 路的持續(xù)激活，CXCR4處于持續(xù)表達(dá)狀態(tài)，因此單純抑制CXCR4/SDF-1的相互作用較難發(fā)揮 持續(xù)的作用。NF-kB P50亞基的碳端含有一段由5個(gè)堿性氨基酸構(gòu)成的典型NLS (VQRKRQKLMP)，能夠特異性識別核轉(zhuǎn)運(yùn)受體（importin-a)，引導(dǎo)NF-kB的入核轉(zhuǎn)運(yùn)。研究證 明，合成P50的NLS作為多肽探針分子，能夠特異性抑制內(nèi)源性NF-kB的P50亞基與核轉(zhuǎn)運(yùn)受 體復(fù)合物的鍵合，阻斷NF-kB的核轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。但P50 NLS主要由堿性氨基酸構(gòu) 成，難以穿過脂質(zhì)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，因此生物利用度很低，難以直接作為藥物使用。Hawiger 等報(bào)道，由脂溶性穿膜肽序（the hydrophobic region/h_region，AAVALLPAVLLALLAP)與 P50 NLS肽序構(gòu)成的嵌合肽-SN50及其環(huán)肽分子，通過h-region的穿膜作用有效引導(dǎo)P50-NLS進(jìn)入細(xì)胞，抑制NF-kB與核轉(zhuǎn)運(yùn)受體復(fù)合物的親和作用，阻斷NF-kB的核轉(zhuǎn)運(yùn)。但因?yàn)橹?溶性穿膜肽能夠穿透所有細(xì)胞膜，缺乏腫瘤靶向性，存在較大的毒副作用。因此，尋找對癌 細(xì)胞具有特異性識別、并能有效攜帶P50 NLS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的定向穿膜引導(dǎo)分子具有重要意 義。
[0006] 已有的報(bào)道中，針對CXCR4的抑制劑可實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的靶向性，但對腫瘤細(xì)胞內(nèi) 其他靶點(diǎn)包括NF-kB信號通路沒有抑制作用，抗腫瘤轉(zhuǎn)移及增值的效果較低；而針對BF-kB 信號通路的多肽藥物研究，普遍存在生物利用度低的問題，需要加入一段穿膜肽，目前主要 使用脂溶性穿膜肽作為進(jìn)入細(xì)胞的引導(dǎo)肽，但這類分子沒有腫瘤靶向性，相應(yīng)的毒副作用 顯著。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研究的缺陷和不足，提供 一種雙靶向嵌合肽及其在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。該雙靶向嵌合肽具有顯著的雙靶 向協(xié)同作用，可有效靶向CXCR4+腫瘤細(xì)胞，并攜帶NF-kB信號通路的靶向抑制劑進(jìn)入細(xì)胞， 從而實(shí)現(xiàn)對SDF-1/CXCR4功能軸和NF-kB信號通路的雙靶向協(xié)同抑制作用，在用于抗腫瘤轉(zhuǎn) 移藥物的應(yīng)用方面具有重要作用。
[0008] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種雙靶向嵌合肽，所述雙靶向嵌合肽的氨基酸序列由氮端序列和碳端序列兩部分序 列構(gòu)成，所述氮端序列如SEQ ID NO. 2所示，具體為KPVSLSYRSPSRFFESH，其特征為有效識別 腫瘤細(xì)胞表面受體;所述碳端序列為能夠有效識別NF-kB核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體的多肽分子。
[0009] 優(yōu)選地，所述碳端序列為NF-kB p50亞基的入核轉(zhuǎn)運(yùn)序列（nuclear localization sequence，NLS)，或其他能夠有效識別NF-kB核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體的多肽分子，如從 噬菌體多肽庫中篩選得到的可有效識別核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體，且抑制NF-kB入核轉(zhuǎn)運(yùn)的多肽分子。 [0010] 更優(yōu)選地，所述為NF-kB p50亞基的入核轉(zhuǎn)運(yùn)序列（nuclear localization sequence，NLS)，即所述碳端序列如SEQ ID從).3所示，具體為￥〇服1^!101^1(。
[0011]即優(yōu)選地，所述雙靶向嵌合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為： KPVSLSYRSPSRFFESHVQRKRQKLMPK。
[0012]上述雙靶向嵌合肽為28個(gè)氨基酸殘基的多肽，其氮端序列即SEQID NO. 2所示序列 (KPVSLSYRSPSRFFESH)是取自SDF-Ia序列的1位到17位氨基酸殘基，其碳端序列即SEQID NO.3所不序列（VQRKRQKLMPK)為NF-kB p50 亞基的入核轉(zhuǎn)運(yùn)序列（nuclear localization sequence，NLS)〇
[0013]上述雙靶向嵌合肽的氮端序列具有靶向CXCR4并引起受體復(fù)合物內(nèi)化的作用，實(shí) 現(xiàn)整個(gè)分子對CXCR4+腫瘤細(xì)胞的靶向選擇性，并引導(dǎo)碳端序列（來源NF-kB p50亞基的 NLS)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞;碳端序列則與細(xì)胞內(nèi)的入核轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白importin-a結(jié)合，從而有效 抑制細(xì)胞內(nèi)處于激活狀態(tài)的NF-kB移位入核，進(jìn)而抑制下游靶基因的表達(dá)，包括CXCR4，實(shí)現(xiàn) 雙靶向協(xié)同抑制作用。
[0014] 另外，上述雙靶向嵌合肽在制備靶向抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0015] 優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物是指抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。
[0016] 更優(yōu)選地，所述腫瘤為表達(dá)CXCR4受體的惡性腫瘤。進(jìn)一步地，所述腫瘤為高表達(dá) CXCR4受體的惡性腫瘤。更進(jìn)一步地，所述腫瘤細(xì)胞存在CXCR4高表達(dá)和NF-kB信號通路的持 續(xù)激活。
[0017] 更優(yōu)選地，所述腫瘤為肺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌等 表達(dá)CXCR4受體的惡性腫瘤。
[0018] 上述雙靶向嵌合肽對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用是通過對CXCR4+腫瘤細(xì)胞中CXCR4+/ SDF-1 a功能軸和NF-kB信號通路的協(xié)同抑制作用來實(shí)現(xiàn)的。
[0019] 另外，上述雙靶向嵌合肽在制備協(xié)同抑制CXCR4+腫瘤細(xì)胞中CXCR4+/SDF_la功能 軸和NF-kB信號通路的藥物中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0020] 進(jìn)一步地，上述對CXCR4+/SDF-la功能軸的抑制包括細(xì)胞表面受體的內(nèi)化和蛋白 表達(dá)的降低;對NF-kB信號通路的抑制包括對NF-kB入核的抑制及下游基因的表達(dá)。
[0021] 本發(fā)明實(shí)際上是在上述基礎(chǔ)上提供了一種可用于治療高表達(dá)CXCR4受體的腫瘤的 轉(zhuǎn)移的方法。具體地說是通過腫瘤細(xì)胞表面的趨化因子受體CXCR4實(shí)現(xiàn)對腫瘤靶向性，并通 過協(xié)同抑制CXCR4/SDF-la功能軸和NF-kB信號通路的活性，發(fā)揮雙靶點(diǎn)抑制CXCR4+腫瘤細(xì) 胞的轉(zhuǎn)移，用于腫瘤的治療。這一發(fā)明基于以下研究發(fā)現(xiàn)：（1)具有高轉(zhuǎn)移活性的惡性腫瘤 細(xì)胞(如乳腺癌，肺癌，胰腺癌，肝癌等)普遍高表達(dá)趨化因子受體CXCR4,其特異性配體SDF-Ia在肝臟，肺，骨髓中高表達(dá);研究表明CXCR4與SDF-Ia的相互作用直接介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞特 異性地向肝，肺及骨髓轉(zhuǎn)移;CXCR4基因沉默或阻斷CXCR4/SDF-la的相互作用可有效抑制地 腫瘤細(xì)胞的迀移活性；因此CXCR4成為高轉(zhuǎn)移活性腫瘤細(xì)胞的有效靶點(diǎn)和標(biāo)志分子；（2) SDF-Ia與CXCR4受體相互作用分析顯示其氮端序列是受體識別和引起受體內(nèi)化的重要結(jié) 構(gòu)區(qū)域;SDF-Ia的1位到17位氨基酸序列組成的多肽分子，可有效識別CXCR4并引起受體內(nèi) 化，具有CXCR4受體部分激動(dòng)劑的效果；（3)NF-kB信號通路在腫瘤細(xì)胞中處于持續(xù)激活狀 態(tài)，而CXCR4/SDF-1 a的相互作用也與NF-kB的持續(xù)激活呈正相關(guān);激活后的NF-kB (主要以 p50/p65亞基組成的二聚體)進(jìn)入細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄表達(dá)多種癌基因，也包括MMP9和CXCR4,促進(jìn) 腫瘤的生長和迀移；因此NF-kB信號通路和CXCR4/SDF-la功能軸在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮 協(xié)同作用。
[0022] 研究證明，乳腺癌等細(xì)胞中持續(xù)活化的NF-kB通過特異性識別CXCR4啟動(dòng)子-66~+1 的DNA序列，上調(diào)表達(dá)CXCR4，是腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CXCR4的重要途徑，直接參與了CXCR4/SDF-Ia介導(dǎo)的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程。因此我們發(fā)現(xiàn)，CXCR4/SDF-la和NF-kB信號通路在腫瘤的增殖 與轉(zhuǎn)移過程中相互關(guān)聯(lián)，具有協(xié)同作用，研究同時(shí)針對二者的雙靶向分子將顯示更強(qiáng)的抗 腫瘤活性，設(shè)計(jì)多靶向的藥物分子協(xié)同作用于上述兩種信號通路將發(fā)揮更好地抗腫瘤轉(zhuǎn)移 作用。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中缺陷:關(guān)于CXCR4/SDF-la功能軸和NF-kB信號通路的抗腫瘤 藥物研究都為單一靶向的，沒有考慮到二者在腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的協(xié)同作 用，無基于上述兩種靶點(diǎn)的成功藥物。本發(fā)明基于CXCR4/SDF-1功能軸和NF-kB信號通路在 腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中的協(xié)同作用，開發(fā)了靶向作用于二者的多功能藥物，即上述的雙靶 向嵌合肽，具有重要的意義。
[0023]發(fā)明人在設(shè)計(jì)了雙靶向嵌合肽（SEQ ID NO.1)的同時(shí)，還合成了其他兩個(gè)多肽分 子，單獨(dú)的VQRKRQKLMPk(SEQ ID N0.3)(NF-kB p50亞基入核轉(zhuǎn)運(yùn)序列）和 AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMPK(SEQIDN0.4，g卩在SEQIDN0.3序列的前面加了一段脂溶 性穿膜肽）。設(shè)計(jì)這兩個(gè)多肽的目的是為了確證(SEQ ID NO.3)是否能夠進(jìn)入細(xì)胞以及其對 腫瘤細(xì)胞是否具有選擇性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SEQ ID NO.3不能獨(dú)立進(jìn)去任何細(xì)胞，而添加 了脂溶性穿膜肽段的SEQ ID NO.4無選擇性進(jìn)入CXCR4+腫瘤細(xì)胞和非腫瘤CHO細(xì)胞。該結(jié)果 進(jìn)一步說明SEQ ID NO. 1不僅保留了SDF-Ia序列對CXCR4受體的選擇性識別，而且也是有效 地保障NF-kB信號通路抑制劑選擇性進(jìn)入腫瘤細(xì)胞發(fā)揮靶向抑制作用的有效手段。
[0024] 該嵌合肽靶向作用于CXCR4+腫瘤細(xì)胞，協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)CXCR4/SDF-la功能軸 和NF-kB信號通路，降低CXCR4+腫瘤細(xì)胞的迀移和侵襲能力，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程的作 用。CXCR4/SDF-1功能軸和NF-kB信號通路在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮協(xié)同作用，該嵌合 肽由SDF-Ia的氮端序列和NF-kB P50亞基的核定位序列(NLS)嵌合而成，通過SDF-I的氮端 序列靶向識別腫瘤細(xì)胞表面受體CXCR4,抑制細(xì)胞內(nèi)SDF-la/CXCR4功能軸作用;又作為穿膜 肽促使NF-kB p50亞基NLS序列有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，靶向抑制NF-kB的入核轉(zhuǎn)錄過程，在制 備雙靶向抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物方面具有重要價(jià)值。
[0025]本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明首次提出利用雙靶向嵌合肽實(shí)現(xiàn)對CXCR4+腫瘤細(xì)胞的靶向選擇性并抑制腫瘤 細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的應(yīng)用，首次提出利用雙靶向抑制劑選擇性識別具有高轉(zhuǎn)移活性的CXCR4+腫 瘤細(xì)胞，并通過協(xié)同抑制CXCR4/SDF-1功能軸和NF-kB信號通路活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞向 特異性器官(肝，肺和骨髓等)轉(zhuǎn)移的抗腫瘤治療方法。該方法具有作用靶點(diǎn)明確，且多靶點(diǎn) 具有協(xié)同作用的特點(diǎn)，具有獨(dú)特的抗腫瘤作用機(jī)制。
[0026]腫瘤轉(zhuǎn)移目前是危害腫瘤患者生命健康的重要原因，目前原發(fā)腫瘤的放化療技術(shù) 已取得了較大進(jìn)步，但腫瘤轉(zhuǎn)移治療目前尚無有效手段和方法。因此本發(fā)明提出的一種多 靶向治療CXCR4+腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法和手段，對惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移治療提供了一種策略。
【附圖說明】
[0027]圖1為CXCR4/SDF-1介導(dǎo)的腫瘤特異性器官轉(zhuǎn)移機(jī)制。
[0028]圖2為不同細(xì)胞表面受體CXCR4的流式細(xì)胞分析圖；圖D和A為Hela細(xì)胞加 PE標(biāo)記的 CXCR4單抗12G5和空白對照圖；圖E和B為A549細(xì)胞加 PE標(biāo)記的CXCR4單抗12G5和空白對照 圖；圖F和C為CHO細(xì)胞加 PE標(biāo)記的CXCR4單抗12G5和空白對照圖。
[0029]圖3為雙靶向嵌合肽（SEQ ID NO. 1)進(jìn)入不同細(xì)胞的熒光標(biāo)記圖；圖A:腫瘤細(xì)胞 A549,圖B:中華倉鼠卵巢細(xì)胞CH0,圖C和D分別為A549細(xì)胞和CHO細(xì)胞對多肽（SEQ ID N0.1) 的FITC標(biāo)記復(fù)合物的攝取情況。 圖4為雙靶向嵌合肽（SEQ ID NO. 1)進(jìn)入不同細(xì)胞的熒光標(biāo)記圖；圖中，E和F分別為 A549細(xì)胞和CHO細(xì)胞對多肽（SEQ ID NO.3)的FITC標(biāo)記復(fù)合物的攝取情況，G和H分別為A459 細(xì)胞和CHO細(xì)胞對多肽(SEQ ID NO.4)的FITC標(biāo)記復(fù)合物的攝取情況。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0031] 除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。
[0032] 以下示例性實(shí)施例中未注明條件的實(shí)驗(yàn)方法可以按本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn) 行，例如可以參考Sambrook等人的《Molecular Cloning: A Laboratory ManualKCold Spring Harbor Laboratory Press,2000)。在以下實(shí)施例中，RPMI1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng) 基如無特殊說明指在滅菌后加入10%滅活小牛血清，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL。
[0033] 術(shù)語解釋：SDF-la(CXC12):趨化因子，又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子，是CXCR4的特異性 配體。CXCR4: -種七次跨膜G-蛋白偶聯(lián)受體。NF-kB:轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族;P50 NLS:NF-kBP50 亞基的核定位序列（nuclear localization sequence)。
[0034] 實(shí)施例1雙靶向嵌合肽的合成及鑒定 1、本發(fā)明的具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列的雙靶向嵌合肽是通過Fmoc/tBu固相 有機(jī)合成方法得到。得到的多肽可以通過與趨化因子受體CXCR4的靶向識別選擇性進(jìn)入 CXCR4+腫瘤細(xì)胞，并有效抑制CXCR4+/SDF-la功能軸和NF-kB信號通路。因此，根據(jù)本發(fā)明的 多肽具有腫瘤細(xì)胞靶向及抑制腫瘤迀移作用，可以應(yīng)用于腫瘤靶向治療的藥物中，如應(yīng)用 在靶向抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物體系中。
[0035]另外，發(fā)明人同時(shí)合成了其他兩個(gè)多肽分子，單獨(dú)的VQRKRQKLMP(SEQ ID N0.3) (NF-kB p50 亞基入核轉(zhuǎn)運(yùn)序列）和AAVALLPAVLLALLAPVQRKRQKLMPK(SEQ ID N0.4，即在SEQ ID NO. 3序列的前面加了一段脂溶性穿膜肽）。設(shè)計(jì)這兩個(gè)多肽的目的是為了確證(SEQ ID NO. 3)是否能夠進(jìn)入細(xì)胞以及其對腫瘤細(xì)胞是否具有選擇性。
[0036] 2、具體地，本發(fā)明雙靶向嵌合肽（以下也簡稱多肽)的合成及鑒定方法如下： 以CLTR樹脂（2-氯-三苯甲基氯樹脂)為載體，F(xiàn)moc/tBu為氨基酸保護(hù)策略，20%哌啶/ DMF為脫保護(hù)試劑，根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行耦合及脫保護(hù)反應(yīng)，最后以95%的TFA/U0把多肽分 子從樹脂上切除，通過高效液相分離純化得到。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟可以參照Chan W.C.《Fmoc solid phase peptide synthesisKOxford University press,2000)。
[0037] 為便于利用熒光標(biāo)記的方法檢測多肽進(jìn)入細(xì)胞的情況，在多肽序列的碳段耦合 biot in分子，獲得每個(gè)多肽分子的biotin標(biāo)記多肽分子，經(jīng)高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定為設(shè) 計(jì)目的肽序，純度均超過95%。具體合成工作由上海強(qiáng)耀生物有限公司合成完成。合成的肽 序如下表1所示。
[0038] 表1
實(shí)施例2雙靶向嵌合肽靶向進(jìn)入CXCR4+腫瘤細(xì)胞 1、多肽靶向進(jìn)入CXCR4+腫瘤細(xì)胞 (1)流式細(xì)胞分析法鑒定CXCR4+A表達(dá)細(xì)胞株 兩種腫瘤細(xì)胞A549和Hela采用DMEM培養(yǎng)基，非腫瘤細(xì)胞CHO(中華倉鼠卵巢細(xì)胞CHO)采 用RPMI1640培養(yǎng)基，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，加入胰酶消化，PBS 清洗并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每種細(xì)胞分別取2 X 100μΙ(含IO6個(gè)細(xì)胞），其中一份加入5μ1含有 PE標(biāo)記的CXCR4單抗(PE-12G5 )，另一份為陰性對照。4 °C避光孵育30miη，流式細(xì)胞分析細(xì)胞 表面受體數(shù)量。
[0039] 圖2中圖D和E相比陰性對照顯示，腫瘤細(xì)胞Α549和Hela細(xì)胞高表達(dá)CXCR4受體，而 非腫瘤細(xì)胞CHO CXCR4表達(dá)量較少。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大量文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近，所以，此三種細(xì) 胞可以作為CXCR4+A表達(dá)的典型細(xì)胞。
[0040] (2)高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)分析多肽選擇性進(jìn)入CXCR4+腫瘤細(xì)胞 為了表征多肽進(jìn)入細(xì)胞的情況，在多肽碳端標(biāo)記biotin，取biotin標(biāo)記的三種多肽分 子溶于DMS0,分別與avidin-FITC以摩爾比1:1在40°C水浴中反應(yīng)lh，利用biotion/avidin 的強(qiáng)相互作用形成FITC標(biāo)記的多肽復(fù)合物(熒光復(fù)合物）。用2μΜ FITC標(biāo)記的多肽復(fù)合物加 入96孔板中，于37°C分別孵育Α549和CHO細(xì)胞2h。同時(shí)用2μΜ avidin-FITC孵育兩種細(xì)胞作 為空白對照。用I X PBS溶液清洗細(xì)胞2次，細(xì)胞洗后Hoechst染核，5mM的NaCl溶液洗掉非特 異性結(jié)合于細(xì)胞表面的多肽復(fù)合物。采用Thermo的高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（型號:ArrayScanVTI) 分別拍攝10個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
[0041 ] (3)雙靶向嵌合肽（SEQ ID NO. 1)以及其他兩種合成的多肽進(jìn)入不同細(xì)胞的熒光 標(biāo)記圖如附圖3和圖4。
[0042] 圖3中A和B顯示，在空白對照實(shí)驗(yàn)中，純的avidin-FITC分子不會(huì)進(jìn)入A549和CHO 細(xì)胞。
[0043] 圖3中C和D分別為A549細(xì)胞和CHO細(xì)胞對多肽（SEQ ID NO. 1)的FITC標(biāo)記復(fù)合物的 攝取情況。圖C中的熒光明確表明，腫瘤細(xì)胞A549明顯有效攝取多肽復(fù)合物，而非腫瘤細(xì)胞 CHO幾乎沒有攝取多肽復(fù)合物。表明該雙靶向嵌合肽(SEQ ID NO. 1)分子對腫瘤細(xì)胞具有明 顯的靶向選擇性。
[0044] 圖4中E和F分別為A549細(xì)胞和CHO細(xì)胞對多肽(SEQ ID NO.3)的FITC標(biāo)記復(fù)合物的 攝取情況。顯示多肽分子即沒有進(jìn)入腫瘤細(xì)胞A549,也沒有進(jìn)入非腫瘤細(xì)胞CH0。
[0045] 圖4中G和H分別為A459細(xì)胞和CHO細(xì)胞對多肽(SEQ ID NO.4)的FITC標(biāo)記復(fù)合物的 攝取情況。顯示該多肽分子無選擇性地進(jìn)入任何細(xì)胞。
[0046]以上結(jié)果明確顯示，雙靶向嵌合肽(SEQ ID NO. 1)利用氮端肽序?qū)XCR4的特異性 識別作用可選擇性進(jìn)入CXCR4+腫瘤細(xì)胞(肺腺癌細(xì)胞A549)，而不進(jìn)入CXCR4-細(xì)胞（中華倉 鼠卵巢細(xì)胞CH0)，且氮端肽序可作為靶向穿膜肽引導(dǎo)NF-kB信號通路的抑制劑進(jìn)入腫瘤細(xì) 胞，發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的特異性作用。
[0047] 實(shí)施例3肺腺癌細(xì)胞A549和宮頸癌Hela細(xì)胞的Transwell細(xì)胞迀移抑制試驗(yàn) 1、雙靶向嵌合肽對腫瘤細(xì)胞的迀移抑制實(shí)驗(yàn) (1)材料 迀移抑制實(shí)驗(yàn)采用12孔聚苯乙稀培養(yǎng)板和transwell小室(Costor 3421型）組成的 迀移裝置。上室底部覆蓋聚碳酸酯膜，直徑6.5mm，膜孔徑5μηι。
[0048] SDF-la(l〇〇yg/ml，中山大學(xué)藥學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室馬偉峰博士贈(zèng))溶于無菌去 離子水中，-20 °C保存。
[0049] 肺腺癌細(xì)胞A549和宮頸癌Hela細(xì)胞。
[0050] (2)迀移抑制實(shí)驗(yàn) 在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板和transwell小室中分別加入600μ1和100μΙ DMEM培養(yǎng)液于37°C、5% CO2條件下平衡。30min后，吸掉培養(yǎng)液，在下室中分別加入混有SDF-la(100ng/ml)和嵌合肽 (SEQ ID N0.1)不同濃度（10μΜ、3μΜ、0·3μΜ)的600μ1 DMEM培養(yǎng)液。同時(shí)設(shè)陽性對照，即在下 室中加入僅含SDF-la(l〇〇ng/ml)的600μ1 DMEM培養(yǎng)液；陰性對照，即在下室中只加600μ1 DMHM培養(yǎng)液。
[0051 ] 取生長狀態(tài)良好的Α549細(xì)胞和Hela細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至IO6個(gè)/ml，分別取100μΙ 加入8個(gè)transwell小室中，再把小室放入下室培養(yǎng)液中，整個(gè)培養(yǎng)板置于37°C、5% CO2條件 下4h。
[0052] 之后輕輕移走transwell小室，用倒置顯微鏡觀察迀移至下室的細(xì)胞數(shù)，記錄下室 5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)，取平均值。
[0053] 2、多肽(SEQ ID NO. 1)對兩種腫瘤細(xì)胞的迀移抑制效率如表2所示。
[0054] 表2多肽(SEQ ID NO. 1)對兩種腫瘤細(xì)胞的迀移抑制效率
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在肺腺癌細(xì)胞A549和宮頸癌Hela細(xì)胞的Transwell細(xì)胞迀移抑制試驗(yàn) 中，嵌合肽(SEQ ID N0.1)可有效抑制SDF-la(100ng/ml)可有效引起腫瘤細(xì)胞從上室迀移 至下室，在3μΜ濃度下即可抑制50%以上的腫瘤細(xì)胞迀移，表明本發(fā)明的雙靶向嵌合肽分子 具有抑制腫瘤細(xì)胞迀移的能力。
[0055] 實(shí)施例4雙靶向嵌合肽轉(zhuǎn)運(yùn)入核實(shí)驗(yàn) 1、嵌合肽進(jìn)入細(xì)胞后的入核轉(zhuǎn)移效率 同樣利用FITC標(biāo)記的多肽復(fù)合物孵育不同細(xì)胞，并對細(xì)胞核進(jìn)行染色，然后采用高內(nèi) 涵系統(tǒng)分析細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度與細(xì)胞質(zhì)中的熒光強(qiáng)度，計(jì)算二者差值，以分析分子入核的 效率。
[0056] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表3所示，高內(nèi)涵熒光數(shù)據(jù)分析得到的核內(nèi)平均熒光數(shù)-胞漿平均熒光數(shù)值，用于反 映分子的入核轉(zhuǎn)移情況。
[0057]表3多肽進(jìn)入不同細(xì)胞后的入核轉(zhuǎn)移效率
表中數(shù)據(jù)顯示嵌合肽(SEQ ID NO. 1)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的入核效率顯著高于CHO細(xì)胞，而多 肽(SEQ ID NO.4)無選擇性進(jìn)入A549和CHO細(xì)胞后，二者的入核效率存在明顯差異。
[0058] 綜上所述，以上結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽分子(SEQ ID NO. 1)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，高 效率地轉(zhuǎn)運(yùn)入核，其在核內(nèi)分布量高于胞漿分布量，說明其高效識別核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白 import in-a，轉(zhuǎn)運(yùn)入核，可有效抑制NF-kB的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制下游祀基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雙靶向嵌合肽，其特征在于，所述雙靶向嵌合肽的氨基酸序列由氮端序列和碳 端序列兩部分序列構(gòu)成，其氮端序列如SEQ ID N0.2所示，具體為KPVSLSYRSPSRFFESH;所述 碳端序列為能夠有效識別NF-kB核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體的多肽分子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙靶向嵌合肽，其特征在于，所述碳端序列為NF-kB p50亞基的 入核轉(zhuǎn)運(yùn)序列，或其他能夠有效識別NF-kB核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體的多肽分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述雙靶向嵌合肽，其特征在于，所述碳端序列如SEQ ID NO.3所示， 具體為 VQRKRQKLMPK。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙靶向嵌合肽，其特征在于，所述雙靶向嵌合肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO · 1 所示，具體為:KPVSLSYRSPSRFFESHVQRKRQKLMPK。5. 權(quán)利要求1所述雙靶向嵌合肽在制備多靶向抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，所述抗腫瘤藥物是指抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為表達(dá)CXCR4受體的惡性腫瘤。8. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤為肺癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)直腸 癌、乳腺癌、卵巢癌或膀胱癌。9. 權(quán)利要求1所述雙靶向嵌合肽在制備協(xié)同抑制CXCR4+腫瘤細(xì)胞中CXCR4+/SDF-la功 能軸和NF-kB信號通路的藥物中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，對CXCR4+/SDF-la功能軸的抑制包括細(xì)胞表 面受體的內(nèi)化和蛋白表達(dá)的降低;對NF-kB信號通路的抑制包括對NF-kB入核的抑制及下游 基因的表達(dá)。
【文檔編號】A61K38/16GK105859841SQ201610122787
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月4日
【發(fā)明人】邵偉艷, 卜憲章, 孫海霞, 劉翠, 區(qū)敬華
【申請人】中山大學(xué)