一種益生型抗菌肽 Enterocin B 的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種益生型抗菌肽Enterocin B基因工程菌的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的一種益生型抗菌肽Enterocin B基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。益生型抗菌肽Enterocin B基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin B具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，包括如下步驟：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)構(gòu)建能高效表達(dá)的重組質(zhì)粒；(3)構(gòu)建基因工程菌；(4)利用基因工程菌表達(dá)抗菌肽Enterocin B。本發(fā)明對病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，安全無毒，無副作用，無抗生素耐藥性。
【專利說明】
一種益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種益生型抗菌肽Enterocin B的制備 方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的大量濫用，導(dǎo)致抗生素耐藥性菌株不斷出現(xiàn)、藥 物殘留、環(huán)境污染和生態(tài)破壞等諸多問題，嚴(yán)重威脅到人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，尋 找一種能替代抗生素的新型抗菌制劑迫在眉睫?？咕木哂锌咕Ч谩岱€(wěn)定性好、無 毒、無殘留、無副作用、安全高效、對環(huán)境無污染且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為解 決抗生素濫用這一難題的有效方法。
[0003] 抗菌肽是生物防御系統(tǒng)中產(chǎn)生的對抗外源性病原體的肽類物質(zhì)，是生物天然的、 防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕膩碓礃O其廣泛，從植物、昆蟲、鳥類、哺乳動(dòng)物、微生物都 已被發(fā)現(xiàn)有抗菌肽的產(chǎn)生。迄今為止，已有近千種抗菌肽被相繼分離純化及鑒定。
[0004] 細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌肽是在其代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性 的多肽類物質(zhì)?？咕脑谝嫔休^為普遍。幾乎所有的益生菌都能產(chǎn)生一種或幾種抗菌 肽物質(zhì)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已從植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳 球菌等許多益生菌中分離純化得到多種抗菌肽物質(zhì)。
[0005] 抗菌肽Enterocin B是從屎腸球菌T136分離純化獲得的抗菌肽，命名為Enterocin B?？咕腅nterocin B的結(jié)構(gòu)基因編碼71個(gè)氨基酸的前肽。其前肽包括18個(gè)氨基酸的信號 肽和53個(gè)氨基酸的成熟肽?？咕腅nterocin B具有較廣的抗菌譜，尤其對單核細(xì)胞增生李 斯特菌、金黃色葡萄球菌等病原菌有明顯的抑制效果，具有較好的應(yīng)用前景。
[0006] 抗菌肽Enterocin B在其產(chǎn)生菌屎腸球菌T136中含量極低，從產(chǎn)生菌中提取抗菌 肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長、工藝復(fù)雜且費(fèi)用昂貴，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，從而制約抗菌肽Enterocin B的實(shí)際應(yīng)用。
[0007] 目前，缺乏一種具有顯著的抗病原菌作用的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方 法及其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種具有顯著的抗病原菌作用的益生型抗菌 肽Enterocin B的制備方法及其應(yīng)用。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：本發(fā)明的一種益生型抗菌肽 Enterocin B基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010]本發(fā)明所述的益生型抗菌肽Enterocin B基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin B具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0011]本發(fā)明所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；
[0013] (2)構(gòu)建能高效表達(dá)抗菌肽Enterocin B的pNZ8148_Enterocin B重組質(zhì)粒；
[0014] (3)用所述pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建乳酸乳球菌NZ9000的 基因工程菌；
[0015] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表達(dá)抗菌肽Enterocin B;
[0016] (5)對抗菌肽Enterocin B的抑菌活性進(jìn)行檢測。
[0017] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，人工合成兩側(cè)含pstl和Hindm的酶切位點(diǎn)Enterocin B 基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0018] 進(jìn)一步地，在步驟(2)中，將SEQ ID No.3所示的核苷酸序列與經(jīng)限制性內(nèi)切酶pst I和Hindm雙酶切后線性化的pNZ8148質(zhì)粒連接獲得pNZ8148-Enterocin B連接產(chǎn)物，將連 接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌MC1061，獲得含pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒。
[0019] 更進(jìn)一步地，在步驟（3)中，所述宿主菌為乳酸乳球菌NZ9000;從含PNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒的大腸桿菌10061中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)?0?和酶切鑒定正確的質(zhì)粒采 用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞NZ9000進(jìn)行抗菌肽Enterocin B的誘導(dǎo)表達(dá)，電轉(zhuǎn)化 處理參數(shù)為2.01^、25以？、20(^、51^，經(jīng)氯霉素抗性篩選、？0?驗(yàn)證、酶切鑒定得到正確的含 pNZ8148_Enterocin B重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌。
[0020] 進(jìn)一步地，在步驟（4)中，將含pNZ8148_Enterocin B重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌 NZ9000的基因工程菌接種于GM17液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至0D6mr?為0.5時(shí)，加入終濃度10ng/ ml的nisin誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)4h后，4000g離心10min取上清液，將獲得的上清液進(jìn)行0.22μηι過 濾獲得誘導(dǎo)后的無菌上清液，得到益生型抗菌肽Enterocin Β。
[0021] 進(jìn)一步地，在步驟(5)中，采用瓊脂擴(kuò)散法對抗菌肽Enterocin B的抑菌活性進(jìn)行 檢測，抗菌肽Enterocin B對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門氏菌的抑菌活 性進(jìn)行檢測。
[0022] 本發(fā)明所述的益生型抗菌肽Enterocin B動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
[0023] 進(jìn)一步地，所述動(dòng)物飼料為飼料添加劑。
[0024] 有益效果:本發(fā)明對病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，安全，無毒，無副作用，無抗生素 耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，可用作動(dòng)物飼料添加劑。本發(fā)明的所構(gòu)建的基因工程菌不僅具有乳酸乳球 菌本身的益生作用，還具有抗菌肽Enterocin B明顯的抗病原菌作用，可以更好的作為益生 型飼料添加劑安全有效地應(yīng)用于動(dòng)物飼料。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] (1)本發(fā)明的抗菌肽基因?yàn)橐嫔c球菌抗菌肽基因 Enterocin B，所編碼的抗菌 肽Enterocin B是從益生菌腸球菌發(fā)酵上清液中分離得到的。本發(fā)明首先合成抗菌肽 Enterocin B的基因序列，并克隆到乳酸乳球菌表達(dá)載體中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體;采用 電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入乳酸乳球菌中進(jìn)行抗菌肽Enterocin B的誘導(dǎo)表達(dá)，其對單核細(xì)胞增生李斯 特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性。
[0027] (2)本發(fā)明的抗菌肽來自對動(dòng)物有益生作用的腸球菌，這種抗菌肽基因?yàn)槭耗c球 菌T136抗菌肽Enterocin B基因。預(yù)期用于動(dòng)物飼料添加劑中對動(dòng)物會(huì)有更好的作用和益 生效果，Enterocin B抗菌肽的成熟肽分子量大約為5.5KDa具有顯著的抗病原菌作用。 [0028] (3)本發(fā)明所表達(dá)的抗菌肽Enterocin B來自于腸球菌，對動(dòng)物體沒有毒性，因此 用本發(fā)明的基因制備的抗菌肽與傳統(tǒng)的抗生素藥物相比，將是一種更為安全的抗病原菌的 短肽類物質(zhì)。
[0029] (4)本發(fā)明以常用的益生菌乳酸乳球菌為宿主菌構(gòu)建的基因工程菌，不僅具有乳 酸乳球菌本身的益生作用，還具有抗菌肽Enterocin B明顯的抗病原菌作用，將Enterocin B基因?qū)胍嫔樗崛榍蚓蝎@得基因工程菌并進(jìn)行高效表達(dá)，將此基因工程菌作為發(fā) 酵菌株用于飼料發(fā)酵，可用作于動(dòng)物飼料添加劑，提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物抗病能力。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明的含目的基因大腸桿菌DH5a質(zhì)粒雙酶切電泳圖；
[0031] 圖2是本發(fā)明pNZ8148質(zhì)粒經(jīng)PstI和Hindm雙酶切電泳圖；
[0032]圖3是本發(fā)明乳酸乳球菌重組菌PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0033] 圖4是本發(fā)明含目的基因 Enterocin B乳酸乳球菌NZ9000重組質(zhì)粒pNZ8148-Enterocin B提取電泳圖；
[0034] 圖5是本發(fā)明含目的基因 Enterocin B乳酸乳球菌重組質(zhì)粒pNZ8148_Enterocin B 經(jīng)PstI和Hindm雙酶切電泳圖；
[0035]圖6是本發(fā)明重組基因工程菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圖，l-3:Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后 重組基因工程菌上清液;對照:未誘導(dǎo)的重組基因工程菌上清液；
[0036] 圖7是本發(fā)明重組基因工程菌對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圖，l-3:Nisin誘導(dǎo) 表達(dá)后重組基因工程菌上清液;對照:未誘導(dǎo)的重組基因工程菌上清液；
[0037] 圖8是本發(fā)明重組基因工程菌對沙門氏菌的抑菌圖，l_2:Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后重組基 因工程菌上清液;對照:未誘導(dǎo)的重組基因工程菌上清液。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例是本發(fā)明的闡釋 和舉例，并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
[0039]本發(fā)明的一種益生型抗菌肽Enterocin B基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列。
[0040] 本發(fā)明所述的益生型抗菌肽Enterocin B基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin B具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0041]本發(fā)明所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，包括如下步驟：
[0042] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；人工合成兩側(cè)含pstl和Hind ΙΠ 的酶切位點(diǎn)Enterocin B基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0043] (2)構(gòu)建能高效表達(dá)抗菌肽Enterocin B的pNZ8148_Enterocin B重組質(zhì)粒;將SEQ ID No.3所示的核苷酸序列與經(jīng)限制性內(nèi)切酶pstl和Hindm雙酶切后線性化的pNZ8148質(zhì) 粒連接獲得pNZ8148-Enterocin B連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌MC1061，獲得含 pNZ8148_Enterocin B重組質(zhì)粒。
[0044] (3)用所述pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建乳酸乳球菌NZ9000的 基因工程菌;所述宿主菌為乳酸乳球菌NZ9000;從含pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒的大腸 桿菌MC1061中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感 受態(tài)細(xì)胞NZ9000進(jìn)行抗菌肽Enterocin B的誘導(dǎo)表達(dá)，電轉(zhuǎn)化處理參數(shù)為2.0kV、25yF、200 Ω、5ms，經(jīng)氯霉素抗性篩選、PCR驗(yàn)證、酶切鑒定得到正確的含pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì) 粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌。
[0045] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表達(dá)抗菌肽Enterocin B;將含PNZ8148- Enterocin B重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌接種于GM17液體培養(yǎng)基，30°C培 養(yǎng)至0D6_m為0· 5時(shí)，加入終濃度10ng/ml的nisin誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)4h后，4000g離心10min取上 清液，將獲得的上清液進(jìn)行〇.22μπι過濾獲得誘導(dǎo)后的無菌上清液，得到益生型抗菌肽 Enterocin Β〇
[0046] ( 5 )對抗菌肽E n t e r o c i η B的抑菌活性進(jìn)行檢測。采用瓊脂擴(kuò)散法對抗菌肽 Enterocin B的抑菌活性進(jìn)行檢測，抗菌肽Enterocin B對金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生 李斯特菌或沙門氏菌的抑菌活性進(jìn)行檢測。
[0047]本發(fā)明所述的益生型抗菌肽Enterocin B動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
[0048]所述動(dòng)物飼料為飼料添加劑。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 本發(fā)明所使用的主要材料
[0051 ] 菌株與載體：乳酸乳球菌NZ9000和PNZ8148質(zhì)粒均購于德國Mo Bi Tec公司；DNA Marker購于上海捷瑞有限公司；單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌均 為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。抗菌肽Enterocin B基因由生工生物工程(上海)有限公司合成并轉(zhuǎn) 入大腸桿菌DH5a;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0052]主要試劑與試劑盒:Ml 7肉湯培養(yǎng)基購自青島海博公司；限制性內(nèi)切酶Pst I和Hind ΙΠ 、Τ4 DNA連接酶、EX Taq購自TaKaRa Biotech公司；氯霉素、質(zhì)粒提取和DNA凝膠回收試劑 盒購自天根生化科技(北京)有限公司;nisin購于Sigma公司。
[0053]主要試劑的配制：
[0054] GM17:M17肉湯培養(yǎng)基121°C高壓滅菌15min，冷卻后加入過濾除菌的葡萄糖至終濃 度為〇. 5 % (質(zhì)量體積比）。
[0055] SGM17:M17肉湯加入終濃度為0.5M蔗糖、2.5%甘氨酸、0.5%葡萄糖117肉湯中加 入蔗糖和甘氨酸后121°C高壓滅菌15min，冷卻后加入0.22μπι過濾除菌的葡萄糖至終濃度為 0.5% (質(zhì)量體積比）。
[0056] 0.5Μ蔗糖/10%甘油：17.115g蔗糖溶解于80ml超純水中，加入10ml甘油后混勻定 容至100ml，0· 22μηι過濾除菌。
[0057] LB液體培養(yǎng)基：10g蛋白胨、5g酵母提取物、lg NaCl溶解于900ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 值至7.0后，定容至1L后121°C高壓滅菌15min。
[0058] 主要儀器:高速冷凍離心機(jī)、移液器、PCR儀均購于德國Eppendorf公司；核酸電泳 槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)化儀購于Bio-Rad公司；凝膠成像儀購于上海天能有限公司；除菌過濾膜 (0·22μπι)購自What Man公司。
[0059] 目的基因獲得：
[0060] 1.抗菌肽Enterocin B基因由生工生物工程(上海)有限公司合成，兩側(cè)加 PstI和 Hindm的酶切位點(diǎn)并導(dǎo)入大腸桿菌DH5a。按照質(zhì)粒提取試劑盒提取由含目的基因的大腸桿 菌DH5a質(zhì)粒。
[0061 ] 2.按照TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶PstI和Hindm雙酶切，如圖1所示，為本發(fā)明 步驟1中提取的質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖，目的基因片段采用天根生化科技 (北京)有限公司DNA回收試劑和操作方法進(jìn)行膠回收，-20°c保存?zhèn)溆谩?br>[0062] 質(zhì)粒pNZ8148線性化：
[0063] 如圖2所示，為本發(fā)明采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶PstI和Hindm操作說明 書對PNZ8148質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，線性化產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖，目的基因片段采用天 根生化科技(北京)有限公司DNA回收試劑和操作方法進(jìn)行膠回收，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0064]回收的目的基因和線性化質(zhì)粒連接
[0065] 按照TaKaRa Biotech的T4DNA連接酶試劑盒操作說明書對回收目的基因和質(zhì)粒進(jìn) 行連接。
[0066] 實(shí)施例2
[0067] 制備大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞
[0068]本實(shí)施例制備大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：
[0069] 1、1 %接種MCI 061的LB液體培養(yǎng)基，于37 °C振蕩過夜培養(yǎng)；
[0070] 2、取過夜培養(yǎng)菌液1 %接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C下振蕩培養(yǎng)4h(此時(shí)細(xì)菌處于對 數(shù)生長期），冰上放置lOmin;
[0071] 3、400(^，4°(：離心1〇1^11收集對數(shù)期細(xì)胞，棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀；
[0072] 4、用1/10于之前液體培養(yǎng)基體積的預(yù)冷的0.1M CaCl2菌體，冰上放置30min;
[0073] 5、4000g，4°C離心5min棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀；
[0074] 6、用1/100于之前液體培養(yǎng)基體積的含0.1M CaCl2溶液重懸菌體；
[0075] 7、吸取200yL分裝于離心管，-8(TC保存。
[0076] 實(shí)施例3
[0077]連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞
[0078]本實(shí)施例為連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：
[0079] (1)取100μΙ大腸桿菌MCI061感受態(tài)細(xì)胞與1.5ml離心管中，加入10μ1連接產(chǎn)物，輕 柔混勾后，冰浴30min;
[0080] (2)將1.5ml離心管放入預(yù)熱至42Γ的水浴中90S;
[0081 ] (3)快速將1.5ml離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3min;
[0082] (4)每管加900μ1 LB培養(yǎng)液體基，37°C搖床溫和震蕩培養(yǎng)1.5h，使細(xì)菌復(fù)蘇并充分 表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；
[0083] (5)吸取100μΙ復(fù)蘇培養(yǎng)菌液分別涂布于含10yg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上；
[0084] (6)將平板置于室溫至液體吸收，倒置平板，37°C培養(yǎng)12-24h直至出現(xiàn)單菌落。
[0085] 實(shí)施例4
[0086] 大腸桿菌MC1061重組質(zhì)粒菌落PCR及雙酶切鑒定
[0087]本實(shí)施例為大腸桿菌MC1061重組質(zhì)粒菌落PCR及雙酶切鑒定。
[0088] 1.挑取上步驟獲得的單菌落進(jìn)行PCR鑒定
[0089] 用于PCR擴(kuò)增的引物
[0090] 正向引物：AAAACTGCAGTTATGCAAAATGTAAAAGAATTAAGTAC
[0091] 反向引物：CCCAAGCTTTTAGTTGCATTTAGAGTATACATT [0092]擴(kuò)增目的片段長度為237bp。
[0093] 2.以單菌落為DNA模板的PCR反應(yīng)體系如下： 正向引物（10 μΜ) 1 μL, 反向引物（10 μΜ) 1 μL. dNTP Mixture 2 μL^
[0094] lOxPCR EiuITcr 2.5 μL TaqDNA 聚合酶（51；/μυ 0.2'uL ddHaO 補(bǔ)足至25pL
[0095] 擴(kuò)增程序：94°(：，511^11，然后30個(gè)循環(huán)（94°(：，11^11;58°(：，503 ;72°(：，11^11);72°(：延 伸1 Omin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。
[0096] 3.重組質(zhì)粒酶切鑒定：
[0097]挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的單菌落于LB液體培養(yǎng)基于37 °C振蕩培養(yǎng)好的菌液，按照天 根生化科技(北京)有限公司質(zhì)粒提取試劑盒操作說明書提取質(zhì)粒后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電 泳，提取質(zhì)粒采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶PstI和Hindm操作說明書雙酶切質(zhì)粒，產(chǎn) 物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳。
[0098] 實(shí)施例5
[0099] 制備乳酸乳球菌NZ9000感受態(tài)細(xì)胞
[0100] 1、乳酸乳球菌1%接種于SGM17(GM17含0.5M蔗糖，2.5%甘氨酸），培養(yǎng)至006〇〇1?~ 0·5_0·8;
[0101] 2、5000g，4°C 離心 lOmin 收集菌體；
[0102] 3、用冰預(yù)冷的含10 %甘油的0.5M蔗糖的溶液洗滌菌體2次；
[0103] 4、用1/100與之前培養(yǎng)基體積的含10%甘油的0.5M蔗糖溶液重懸菌體，于-80 °C保 存。
[0104] 乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化：
[0105] 取2yL重組質(zhì)粒與40yL感受態(tài)細(xì)胞混合后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置lOmin。 電轉(zhuǎn)化條件：電壓2000V，電容25yF，電阻200Ω。電擊完畢后，立即往電轉(zhuǎn)杯中加入lmL GM17 培養(yǎng)基(含20mM MgCl2,2mM CaCl2)，30°C靜置培養(yǎng)2h，涂布于含5μg/ml氯霉素的GM17平板 上，30 °C培養(yǎng)直至出現(xiàn)單菌落。
[0106] 實(shí)施例6
[0107] 正向引物：AAAACTGCAGTTATGCAAAATGTAAAAGAATTAAGTAC
[0108] 反向引物：CCCAAGCTTTTAGTTGCATTTAGAGTATACATT
[0109] 擴(kuò)增目的片段長度為237bp。
[0110] 2.以單菌落為DNA模板的PCR反應(yīng)體系如下： 正向引物（10 μΜ) l pL 反向引物（10 μΜ) 1 μL ciNTP Mixture 2 pL
[0111] lOxPCR Buffer 2 5 μΕ Taq DNA 聚合酶（5 U/pL ) 0.2 μL dclH：0 補(bǔ)足至 25pL
[0112] 擴(kuò)增程序：94°C，5min，然后 30 個(gè)循環(huán)（94°C，lmin;58°C，50S;72°C，lmin);72°C 延 伸lOmin。如圖3所示，為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。
[0113] 挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的單菌落于GM17液體培養(yǎng)基于30°C振蕩培養(yǎng)好的菌液，如圖4 所示，為本發(fā)明按照天根生化科技(北京)有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒操作說明書提取質(zhì)粒 后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖5所示，為本發(fā)明的提取質(zhì)粒采用TaKaRa Biotech限制性 內(nèi)切酶PstI和Hindm操作說明書雙酶切質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0114] 實(shí)施例7
[0115] 乳酸乳球菌NZ9000重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)
[0116] 重組菌4%接種于含5μg/ml氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基待生長至0D6Mr?約為0.5時(shí)加 入終濃度為l〇ng/ml nisin誘導(dǎo)培養(yǎng)4h獲得培養(yǎng)菌液，4000g離心10min取上清液，將獲得的 上清液進(jìn)行〇.22μπι過濾獲得誘導(dǎo)后的無菌上清液，用于下一步的抑菌實(shí)驗(yàn)。
[0117] 實(shí)施例8
[0118] 重組抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)
[0119] 1、重組抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)
[0120] 本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法對重組表達(dá)的抗菌肽Enterocin Β的抑菌活性進(jìn)行檢測。 將處于對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌培養(yǎng)物各取l〇〇yL 涂布于20ml LB固體培養(yǎng)基平板中，再用8mm的打孔器打孔，加入200yL的待測樣品上清液， 以未經(jīng)nisin誘導(dǎo)的含有抗菌肽Enterocin B基因的乳酸乳球菌上清為對照，37°C培養(yǎng)觀 察。
[0121] 2、抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0122] 采用瓊脂擴(kuò)散法對重組抗菌肽的抑菌活性進(jìn)行檢測，經(jīng)37°C培養(yǎng)后，結(jié)果如圖6所 示，為本發(fā)明重組基因工程菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圖，l-3:Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后重組基因 工程菌上清液;對照:未誘導(dǎo)的重組基因工程菌上清液;如圖7所示，為本發(fā)明重組基因工程 菌對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌圖，l-3:Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后重組基因工程菌上清液;對 照:未誘導(dǎo)的重組基因工程菌上清液;如圖8所示，為本發(fā)明重組基因工程菌對沙門氏菌的 抑菌圖，l-2:Nisin誘導(dǎo)表達(dá)后重組基因工程菌上清液;對照：未誘導(dǎo)的重組基因工程菌上 清液。
[0123] 如圖6至圖8所示，本發(fā)明的重組抗菌肽Enterocin B的基因工程菌對沙門氏菌、金 黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑菌效果明顯。
[0124] 根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實(shí)施方 法進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的【具體實(shí)施方式】，對本 發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書 使用了一些特定的術(shù)語，但是這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種益生型抗菌肽Enterocin B基因，其特征在于具有SEQ ID No.l所示的核苷酸序 列。2. 權(quán)利要求1所述的益生型抗菌肽Enterocin B基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin B具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3. 權(quán)利要求1所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，其特征在于包括如下步 驟： (1) 人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因； (2) 構(gòu)建能高效表達(dá)抗菌肽Enterocin B的pNZ8148_Enterocin B重組質(zhì)粒； (3) 用所述pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建乳酸乳球菌NZ900的基因 工程菌； (4) 利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表達(dá)抗菌肽Enterocin B; (5) 對抗菌肽Enterocin B的抑菌活性進(jìn)行檢測。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，其特征在于:在步驟 (1) 中，人工合成兩側(cè)含pst I和HindlH的酶切位點(diǎn)Enterocin B基因具有SEQ ID Νο·3所示 的核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin Β的制備方法，其特征在于:在步驟 (2) 中，將SEQIDN0.3所示的核苷酸序列與經(jīng)限制性內(nèi)切酶pStI和HindIΠ 雙酶切后線性 化的PNZ8148質(zhì)粒連接獲得pNZ8148-Enterocin B連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌 MC1061，獲得含pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，其特征在于:在步驟 (3) 中，所述宿主菌為乳酸乳球菌NZ9000;從含pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒的大腸桿菌 MC1061中提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌感受態(tài) 細(xì)胞NZ9000進(jìn)行抗菌肽EnterocinB的誘導(dǎo)表達(dá)，電轉(zhuǎn)化處理參數(shù)為2.0kV、25μF、200Ω、 51118，經(jīng)氯霉素抗性篩選、？0?驗(yàn)證、酶切鑒定得到正確的含卩似8148411丨61'〇〇;[1113重組質(zhì)粒 的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，其特征在于:在步驟 (4) 中，將含pNZ8148-Enterocin B重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌接種于GM17 液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)至OD6_ mS〇. 5時(shí)，加入終濃度10ng/ml的nisin誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)4h后， 4000g離心10min取上清液，將獲得的上清液進(jìn)行0.22μπι過濾獲得誘導(dǎo)后的無菌上清液，得 到益生型抗菌肽Enterocin Β。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制備方法，其特征在于:在步驟 (5) 中，采用瓊脂擴(kuò)散法對抗菌肽Enterocin B的抑菌活性進(jìn)行檢測，抗菌肽Enterocin B對 金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門氏菌的抑菌活性進(jìn)行檢測。9. 權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的益生型抗菌肽Enterocin B動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，所述動(dòng)物飼料為飼料添加劑。
【文檔編號】C12N15/74GK106086041SQ201610490117
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】楊旭, 方華, 季春源, 沈城, 郭子好
【申請人】江蘇鹽城源耀生物科技有限公司