一種醬油用天然防腐劑抗菌肽及其制備和使用方法
【專利摘要】一種醬油用天然防腐劑抗菌肽及其制備和使用方法，屬于食品防腐劑技術(shù)領(lǐng)域。其制備方法是將副干酪乳桿菌堅韌亞種FX?6?1菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，活化菌株，將活化菌株用MRS培養(yǎng)基稀釋，再將脫脂豆?jié){接種稀釋后的活化菌株，添加葡萄糖和酵母粉，在30～35℃下發(fā)酵70～75 h，發(fā)酵液離心分離，去上清液，過濾，將濾液真空冷凍干燥成粉末狀后冷凍保存，即得一種醬油用天然防腐劑?抗菌肽。本發(fā)明用于醬油防腐劑，可有效延長醬油的貨架期，不僅能保證醬油的營養(yǎng)及口感，而且安全衛(wèi)生，天然無毒。CCTCC M 201404320140223
【專利說明】
一種醬油用天然防腐劑抗菌肽及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及食品防腐劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以副干酪乳桿菌發(fā)酵脫脂大豆分 離純化的天然防腐劑抗菌肽及其制備和使用方法。 技術(shù)背景
[0002] 隨著現(xiàn)代科技的進步和人們生活水平的提高，自然與健康在飲食中占有著越來越 重要的地位。傳統(tǒng)的化學(xué)防腐劑，不僅會產(chǎn)生不良味道，影響食物的味道和口感，還會殘留 一些對人體有害的成分，因此近年來，安全、無毒、天然、高效的食品防腐劑的開發(fā)與利用備 受重視。
[0003] 醬油是中國獨特、常用、居家必備的傳統(tǒng)調(diào)味品，具有兩千多年的歷史，受到廣大 消費者的喜愛。目前市面上所銷售的絕大多數(shù)醬油依然采用化學(xué)防腐劑或加熱滅菌的方 法，其中主要使用的化學(xué)防腐劑是苯甲酸鈉或苯甲酸及其鹽類。苯甲酸鈉雖然是目前國際 上公認的比較安全的化學(xué)合成防腐劑之一，但是也曾有案例報道食用過量苯甲酸鈉而造成 蕁麻疹和假過敏癥狀;而加熱滅菌不僅需要消耗大量的能源，同時也導(dǎo)致醬油中氨基酸等 重要的營養(yǎng)成分損失，香氣成分含量降低，甚至還會引起醬油總酸上升和色澤加深等問題， 嚴重影響了醬油的品質(zhì)。因此，安全無毒、高效的醬油防腐劑成為食品領(lǐng)域的研究熱點之 〇
[0004] 在醬油的加工、運輸和貯藏過程中，微生物的污染和繁殖是導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)的主 要原因，由于醬油本身作為發(fā)酵產(chǎn)品的特殊性，微生物種類和功能十分復(fù)雜，對所使用防腐 劑的質(zhì)量要求很高。因此，現(xiàn)在需要一種天然的防腐劑，同時具有高效性、廣譜性、穩(wěn)定性等 特點，能夠在保持醬油原有風(fēng)味的同時，延長醬油的貨架期。中國專利申請公開的"一種醬 油防腐保鮮劑"（CN101238910)，由魚精蛋白75%~90%，蔗糖脂肪酸酯2%~10%，乙二胺 四乙酸2%~10%和谷氨酸鈉2%~5%組成。這種醬油防腐保鮮劑的效果已經(jīng)達到或超過 苯甲酸鈉和山梨酸鉀的防腐保鮮效果。但其含有乙二胺四乙酸等化學(xué)成分，不屬于天然防 護劑，而且其中的乙二胺四乙酸容易與食品中的金屬離子形成乙二胺四乙酸鹽，對人體有 一定危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種醬油用天然防腐劑，其利用副干酪乳桿菌發(fā)酵脫脂大 豆分離純化得到一種抗菌肽，該抗菌肽用于醬油防腐劑，可有效延長醬油的貨架期，不僅能 保證醬油的營養(yǎng)及口感，而且安全衛(wèi)生，天然無毒。本發(fā)明還提供一種醬油用天然防腐劑的 制備和使用方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的實施方案為:一種醬油用天然防腐劑抗菌肽，由包括以 下步驟的方法制成： (1)將生長對數(shù)期的副干酪乳桿菌堅韌亞種FX-6-1菌株按照體積比1~3:20接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，在35~40 °C下?lián)u床培養(yǎng)10~16 h，活化菌株，所述副干酪乳桿菌堅韌亞種 FX-6-1已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC M 2014043,保藏日期為2014 年02月23日； (2) 將活化菌株用MRS培養(yǎng)基以體積比為1:10~14的比例稀釋至OD6qq=O. 15~0.3; (3) 取脫脂大豆加入水中，混勻、磨碎并煮沸，用四層紗布將粗豆渣過濾并除去，將過濾 后的脫脂豆?jié){用巴氏消毒法處理； (4) 將脫脂豆?jié){置于發(fā)酵罐中，接種步驟(2)稀釋后的活化菌株，添加葡萄糖和酵母粉， 將發(fā)酵罐內(nèi)各種物質(zhì)徹底搖勻溶解，放置在30~35 °C發(fā)酵70~75 h; (5) 發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液離心分離，去上清液，過濾； (6) 將濾液真空冷凍干燥成粉末狀后冷凍保存，即得一種醬油用天然防腐劑-抗菌肽。
[0007] 作為優(yōu)化，步驟(1)中，所述FX-6-1菌株在MRS液體培養(yǎng)基的接種量為8~10%。
[0008] 作為優(yōu)化，步驟(3)中，所述脫脂大豆和水的質(zhì)量體積配比為1~3:6。
[0009] 作為優(yōu)化，步驟(4)中，所述稀釋后的活化菌株和脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積配比為5~ 15:100。進一步優(yōu)化的是，所述稀釋后的活化菌株和脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積配比為9:100。
[0010] 作為優(yōu)化，步驟(4)中，所述葡萄糖與脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積比為3~4:100,進一步 優(yōu)化的是，所述葡萄糖與脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積比為3.44:100。
[0011] 作為優(yōu)化，步驟(4)中，所述酵母粉與脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積比為1~3:100。
[0012] 作為優(yōu)化，步驟(4)中，發(fā)酵溫度32 °C，發(fā)酵時間72 h。
[0013] 作為優(yōu)化，步驟(5)中，所述離心分離轉(zhuǎn)速4000 r/min，時間10 min。
[0014] 作為優(yōu)化，步驟(6)中，所述冷凍干燥溫度為-40 °C，冷凍保存溫度為-20 °C。
[0015] 本發(fā)明還提供一種醬油用天然防腐劑抗菌肽的使用方法，包括:取上述制備好的 醬油用天然防腐劑，在醬油原液(淋油后滅菌，不添加任何防腐劑）中加入抗菌肽，其中抗菌 肽與醬油原液的質(zhì)量比為0.1~0.5: : 100。
[0016] 本發(fā)明確認所獲得的抗菌肽活性經(jīng)牛津杯擴散法實驗檢測分析，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿 菌（i?scAer_/cAia co_/i)、金黃色葡萄球菌（at/ret/s)、銅綠假單胞菌 (Pset/t/o?o/3as aert/gi/3〇sa A蘇云金芽抱桿菌iAt/ri/3gie/3sis)等細菌，及魯氏 (Phylum Sarcomastigophora X M&iM (Aspergillus niger ) ^^^{Aspergillus /7aras)、黑根霉/3i>_rica/3s)等易引起醬油腐敗的真菌具有顯著抑制作用， 本發(fā)明的優(yōu)點在于：（1)所用生產(chǎn)菌菌株副干酪乳桿菌堅韌亞種FX-6-1是從西藏開菲 爾發(fā)酵乳中分離得到的，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2014043,保存日期為2014年02月23日；（2)本發(fā)明發(fā)酵培基成本比較低，發(fā)酵培基主要成分 是價格相對廉價的脫脂大豆，無需大豆蛋白棟、牛肉膏、酵母提取物、Na2S〇3、NaAc等試劑型 培養(yǎng)基，這在實際生產(chǎn)應(yīng)用中將大大節(jié)約成本，簡單方便；（3)本發(fā)明制備天然防腐劑抗菌 肽的過程簡單，無需脫鹽處理；（4)本發(fā)明所得天然防腐劑抗菌肽抗菌譜廣，對大腸桿菌 (i?scAe_r_/cAia co_/i)、金黃色葡萄球菌（SiapA^ococctZs at/_ret/s)、蘇云金芽抱桿菌 等細菌，及魯氏酵母Sai-COffiasiigOjDAora A黑曲霉 (Aspergillus niger )黃你霉(Aspergillus fIavus)、黑敏霉(Rhizopus nigricans)等易 引起醬油腐敗的真菌具有顯著抑制作用；（5)本發(fā)明制備天然防腐劑抗菌肽來源于脫脂大 豆，與醬油具有同源性，能夠最大限度的保存醬油的營養(yǎng)成分及口感，并延長的貨架期，安 全衛(wèi)生，天然無毒。
【附圖說明】
[0017] 圖1是醬油用天然防腐劑HPLC色譜圖。
[0018] 圖2是醬油用天然防腐劑在高鹽條件下對魯氏酵母生長曲線的影響。
[0019] 圖3是醬油用天然防腐劑在高鹽條件下對產(chǎn)膜酵母生長曲線的影響。
[0020] 圖4是醬油添加不同濃度天然防腐劑抗菌肽后再37 °C貯藏過程中感官評分的變 化。
[0021]圖5是醬油在37 °C貯藏過程中pH的變化。
[0022] 圖6是醬油在37 °C貯藏過程中氨基酸態(tài)氮的變化。
[0023] 圖7是醬油在37 °C貯藏過程中的光密度變化。
[0024] 圖8是醬油在37 °C貯藏過程中細菌菌落總數(shù)的變化。
[0025]具體實施方法 下面給出本發(fā)明的實施例，具體闡述本發(fā)明。
[0026] 實施例1: 一種醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法： 將100 yL副干酪乳桿菌FX-6-1菌液加至I mLMRS液體培養(yǎng)基中，于搖床37 °C，150 r/ min培養(yǎng)10~18 h。取I mL活化菌液，用MRS培養(yǎng)基以1:14的比例稀釋，OD6qq=O. 2。按脫脂大 豆與水按質(zhì)量比為1:3制備脫脂豆?jié){，用濾布過濾并將棄除的粗豆渣，將過濾脫脂豆?jié){在85 °C下滅菌30 min，將4 L處理好的脫脂豆?jié){置于發(fā)酵瓶中，按9%(m/v)的比例接種活化后的 FX-6-1菌，按照3.44%(m/v)的比例添加葡萄糖，按照2%(m/v)的比例酵母粉。將發(fā)酵罐內(nèi)各 種物質(zhì)徹底搖勻溶解，放置在32 °C發(fā)酵72 h。發(fā)酵完畢后取出，將發(fā)酵液置于4000 r/min 下離心10 min，取上清液。將上清液用0.2 nm孔徑的濾紙過膜，取濾液備用。收集多次濾液 于-40 °C真空冷凍干燥成粉末狀后-20 °C低溫保存，即得一種醬油用天然防腐劑-抗菌 肽。
[0027] 實施例2: 一種天然防腐劑抗菌肽的制備方法： 將120 yL副干酪乳桿菌FX-6-1菌液加至I mL MRS液體培養(yǎng)基，于搖床38 °C，150 r/ min培養(yǎng)10~18 h。取I mL活化菌液，用MRS培養(yǎng)基以1:14的比例稀釋，OD6qq=O. 2。按脫脂大 豆與水按質(zhì)量比為1:4制備脫脂豆?jié){，用濾布過濾并將棄除的粗豆渣，將過濾后的脫脂豆?jié){ 在90 °C下滅菌20 min，將4 L處理好的脫脂豆?jié){置于發(fā)酵瓶中，按15%(m/v)的比例接種活 化后的FX-6-1菌，按照3.2%(m/v)的比例添加葡萄糖，按照2%(m/v)的比例酵母粉。將發(fā)酵 罐內(nèi)各種物質(zhì)徹底搖勻溶解，放置在35 °C發(fā)酵70 h。發(fā)酵完畢后取出，將發(fā)酵液置于4000 r/min下離心10 min，取上清液。將上清液用0.2 nm孔徑的濾紙過膜，取濾液備用。收集多次 濾液于-40 °C真空冷凍干燥成粉末狀后-20 °C低溫保存，即得一種醬油用天然防腐劑-抗 菌肽。
[0028] 實施例3: 一種天然防腐劑抗菌肽的制備方法： 將150 yL副干酪乳桿菌FX-6-1菌液加至I mL MRS液體培養(yǎng)基，于搖床40 °C，150 r/ min培養(yǎng)10~18 h。取I mL活化菌液，用MRS培養(yǎng)基以1:14的比例稀釋，OD6qq=O. 2。按脫脂大 豆與水按質(zhì)量比為1:3.5制備脫脂豆?jié){，將脫脂豆?jié){與豆渣攪拌混合均勻在85 °C下滅菌30 min，將4 L處理好的脫脂豆?jié){置于發(fā)酵瓶中，按10%(m/v)的比例接種活化后的FX-6-1菌，按 照3.44%(m/v)的比例添加葡萄糖，按照2.5%(m/v)的比例酵母粉。將發(fā)酵罐內(nèi)各種物質(zhì)徹 底搖勻溶解，放置在30 ° C發(fā)酵75 h。發(fā)酵完畢后取出，將發(fā)酵液置于4000 r/min下離心10 min，取上清液。將上清液用0.2 nm孔徑的濾紙過膜，取濾液備用。收集多次濾液于-40 °C真 空冷凍干燥成粉末狀后-20 °C低溫保存，即得一種醬油用天然防腐劑-抗菌肽。
[0029]實施例1為優(yōu)選方案。上述實施例中，所述的副干酪乳桿菌堅韌亞種FX-6-1菌株已 經(jīng)保藏于于2014年02月23日保藏于位于武漢市武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC M 2014043。
[0030] 實施例4: 一種天然防腐劑抗菌肽的使用方法： 用去離子水將上述制備好的醬油用天然防腐劑抗菌肽稀釋成10%的溶液，在醬油原液 中按照1%的比例添加抗菌肽溶液，并混合均勻。
[0031] 實施例5: 本發(fā)明提供的天然防腐劑抗菌肽的抗菌譜分析： 采用瓊脂牛津杯擴散法對天然防腐劑抗菌肽進行抗菌譜分析，具體方法是： 5.1指示菌活化 在超凈工作臺中挑取4 °C保存的試管斜面指示菌單菌于8 mL LB肉湯培養(yǎng)基，放置于 恒溫搖床，37 °C下150 r/min過夜培養(yǎng)。將過夜活化的指示菌液稀釋至菌濃度為IX IO8 CFU/mL，備用。
[0032] 5.2檢測平板制備 將滅菌處理的LB瓊脂冷卻至40~50 °C，在無菌條件下向水平放置的培養(yǎng)皿(9 cm)中 轉(zhuǎn)移12-20 mL培養(yǎng)基。瓊脂平板凝固后，將指示菌液按照1:10~14的比例混入瓊脂培養(yǎng)基 中并搖晃均勻，稀釋至菌濃度為IX IO8 CFU/mL。隨后用移液槍吸取0.2 mL稀釋后的菌液， 均勻滴加在凝固的瓊脂平板表面，用無菌涂布器將菌液涂布均勻。
[0033] 5.3抑菌活性測定 用鑷子將滅菌后的牛津杯（內(nèi)徑6 ±0.1 mm，外徑7 ±0.1 mm)平穩(wěn)置于檢測平板表面， 可以適當(dāng)按壓以固定。將天然防腐劑抗菌肽加入蒸餾水溶解，最終濃度為100 mg/mL，用移 液槍準確吸取0.2 mL天然防腐劑抗菌肽溶液至牛津杯，在37 °C下恒溫靜置培養(yǎng)12 h，游標 卡尺測抑菌圈直徑。天然防腐劑抗菌肽抗菌譜的結(jié)果見表1。
[0034] 從表1可以知，天然防腐劑抗菌肽的抑菌譜廣泛，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌 均具有顯著抑制作用，對魯氏酵母、黑曲霉、黃曲霉和黑根酶等真菌也具有不同程度的抑制 作用。
[0035] 實施例6 本發(fā)明提供天然防腐劑抗菌肽在高鹽條件下對醬油中常見耐鹽菌的抑制作用分析： 6.1指示菌活化 在PDA液體培養(yǎng)基中添加9%的NaCl，充分溶解后滅菌處理。在超凈工作臺中挑取4 °C保 存的試管斜面指示菌魯氏酵母單菌于8 mL加鹽PDA培養(yǎng)基，放置于恒溫搖床，30 °C下150 r/min過夜培養(yǎng)。將過夜活化的指示菌液稀釋至菌濃度為IX IO8 CFU/mL，備用。另挑取4 °C 保存的試管斜面混合產(chǎn)膜酵母菌于8 mL加鹽PDA培養(yǎng)基，其他操作步驟同魯氏酵母。
[0036] 6.2樣品添加 使用96孔板法，每組添加樣品如表2,每組3個平行，其中苯甲酸鈉溶液和天然防腐劑抗 菌肽溶液均用9%的NaCl溶液作為溶劑配置。
[0037] 6.3抑菌活性測定 用酶標儀在600 nm下測量樣品添加后0~14 h的OD值，每2 h測量一次，天然防腐劑抗 菌肽在高鹽條件下對醬油魯氏酵母的抑菌效果的結(jié)果見表3,對產(chǎn)膜酵母的抑制效果見表 4〇
[0038] 從表3和表4可以知，天然防腐劑抗菌肽在高鹽條件下，對醬油中常見的耐鹽酵母 菌具有顯著的抑制作用。
[0039] 實施例7: 本發(fā)明提供不同濃度的天然防腐劑抗菌肽在醬油中的應(yīng)用效果： 此實施例是用于說明本發(fā)明，具體試驗方法如下： 3.1醬油原液樣品的處理 向醬油原液中添加1%的混合菌液(大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、魯氏酵母等量混合后稀 釋至OD6qq=O . 2)?；靹蚝笤谧匀粻顟B(tài)下將樣品進行5種處理，處理方法見表5。將處理后的樣 品搖勻并分裝至無菌醬油瓶中，每種處理方式的醬油樣品分別分裝為10 mL/瓶。將分裝好 的醬油樣品用四層紗布封口后，貯藏于37 °C恒溫箱。請10名接受過嚴格的感官評定訓(xùn)練的 人，分別于處理后Od (貯存3 h后開始測定）、3(1、5(1、7(1、9(1、11(1、13(1、15(1醬油樣品的色澤、 香氣、滋味、體態(tài)等感官指標進行分析評定，方法參照GB/T 5009.39-2003《醬油衛(wèi)生標準 的分析方法》。以上各項感官指標的評定結(jié)果均采用記分制，樣品總體評分為各指標評價結(jié) 果總和的平均倌。感官評分表如表6所示。
[0040]醬油在37 °C貯藏過程中感官評價分數(shù)的變化如圖4所示，在第一天的時候，各組 的感官評價的分數(shù)基本保持一致，其中添加0.5%抗菌肽的醬油樣品帶有略微的香甜味，說 明添加不同濃度的天然防腐劑抗菌肽都不會對醬油品質(zhì)產(chǎn)生負面影響，而高濃度的抗菌肽 會賦予醬油一種特殊的香甜風(fēng)味。隨著貯藏時間的增長感官評價的分數(shù)越來越低，但是無 論是在色澤、氣味、滋味、透明度方面，0.5%的天然防腐劑抗菌肽組和0.3%的天然防腐劑抗 菌肽組都要優(yōu)于其他實驗組的。在貯藏的第15天，添加0%抗菌肽組的醬油的品質(zhì)已經(jīng)嚴重 惡化，色澤灰暗，有苦澀滋味。緊接著的是0.1%天然防腐劑抗菌肽組，最后是0.3%和0.5%的 抗菌肽組。由此可知隨著抗菌肽添加量的增加，有利于醬油在貯藏過程中的品質(zhì)保持，但是 添加高濃度抗菌肽的醬油樣品所具有的微微香甜味，可能不被所有人接受，因此選擇〇. 3% 為天然防腐劑抗菌肽在醬油中的最佳添加量。
[0041 ] 實施例8: 本發(fā)明提供天然防腐劑抗菌肽在醬油中的應(yīng)用 此實施例是用于說明本發(fā)明，具體試驗方法如下： 3.1醬油原液樣品的處理 向醬油原液中添加1%的混合菌液(大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、魯氏酵母等量混合后稀 釋至OD6qq=O . 2)。混勻后在自然狀態(tài)下將樣品進行5種處理，處理方法見表7。然后將處理后 的醬油原液搖勻并分裝至無菌醬油瓶中，每種處理方式的醬油樣分別分裝為10 mL/瓶和25 mL/瓶。實驗分為A、B類型，A類型實驗所用醬油樣品為10 mL/瓶，用于醬油樣品的理化指標 的分析測定;B類型實驗所用醬油樣品為25 mL/瓶，用于醬油樣品的微生物指標的分析測 定，用于感官指標、理化指標分析測定的每組3個平行，用于微生物指標分析測定的每組2個 平行。將分裝好的醬油樣品，用四層紗布封口后貼上標簽，放入37 °C恒溫箱，分別用于Od (貝士存3 h后開始測定）、3(1、5(1、7(1、9(1、11(1、13(1、15(1對腐敗指標測定。
[0042] 6.2不同時間段醬油樣品理化指標測定 6.2.1 pH值指標的測定 取10 mL醬油樣品搖勻后用pH計測定pH值。
[0043] 6.2.2氨基酸態(tài)氮測定 氨基酸是醬油中重要營養(yǎng)成分，醬油在貯藏過程中，隨著微生物的繁殖，氨基酸態(tài)氮的 含量會隨之發(fā)生變化。因此可通過測試不同貯藏時間醬油樣品中的氨基酸態(tài)氮含量，作為 評價醬油腐敗程度的一個指標。在參照GB/T 5009.39-2003中醬油衛(wèi)生標準的分析方法中 的測定方法，即甲醛值法來測定不同時間段醬油樣的氨基酸態(tài)氮含量。吸取5.0 mL醬油樣 品，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL 水，開動磁力攪拌器，用氫氧化鈉標準溶液[c (NaOH) =0.050 mo I /L ]滴定至酸度計只是 pH8.2,記下消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數(shù)，可計算總算含量。再加入10.0 mL甲醛溶 液，混勻。再用氫氧化鈉標準滴定溶液繼續(xù)弟弟乖至PH9.2，幾下消耗氫氧化鈉標準滴定溶 液的毫升數(shù)。同時吸取80 mL水，先用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH為8.2，再加入10.0 mL甲醛溶 液，用氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至PH9.2，同時做試劑空白試驗。
[0044]氨基酸態(tài)氮的含量可按式(1)進行計算：
式中： X--試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為克每百毫升(g/l〇〇 mL) Vl-一測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，單位為毫升 (mL) V2-一試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，單位為毫升(mL) V3一一試樣稀釋液取用量，單位為毫升(mL) C--氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，單位為摩爾每升(mol/L) 0.014--與1.00 mL氫氧化鈉標準滴定溶液[C(NaOH) = I.000 mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì) 量，單位為克(g) 計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
[0045] 6.2.3不同時間段醬油透光度測定 用無菌膠頭滴管從一瓶醬油樣品中吸取適量樣品放入比色皿中，同時吸取適量醬油原 液作為空白對照，在波長600 nm下用紫外可見光分光光度計測定醬油樣品的OD值。
[0046] 6.3不同時間段醬油樣品微生物指標測定 參照GB 4789.2-2010方法測定醬油樣品中的細菌總數(shù)。量取25 mL醬油樣于盛有225 mL無菌生理鹽水的無菌錐形瓶，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。用I mL無菌吸管或微量 移液器吸取1:10樣品勻液I mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無菌試管中，振搖試 管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。按此操作程序，制 備10倍系列稀釋樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品 勻液，在進行10倍遞增稀釋時，吸取I mL樣品勻液于無菌平皿中，倒入15~20 mL冷卻至46 。(:的PCA并轉(zhuǎn)動平皿混勻。同時作空白對照，待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 °C ± I °C培養(yǎng) 48 h±2 h。平皿計數(shù)，結(jié)果以對數(shù)log CFU/mL表示。參照GB/T 2717-2003,菌落總數(shù)值彡3 X IO4 CFU/mL為醬油腐敗變質(zhì)的標準。
[0047]醬油在37 °C貯藏過程中pH的變化如圖5所示。在醬油貯藏的過程中，隨著微生物 的繁殖會產(chǎn)生酸敗，導(dǎo)致PH降低。貯藏初期，各組醬油pH基本相同，說明天然防腐劑抗菌肽 對醬油的pH無顯著影響。貯藏過程中，添加天然防腐劑抗菌肽的醬油pH比對照組要高，說明 抗菌肽已有效地抑制微生物的生長。隨著貯藏時間的延長，添加天然防腐劑抗菌肽的效果 已經(jīng)和苯甲酸鈉組相當(dāng)。
[0048] 醬油在37 °C貯藏過程中氨基酸態(tài)氮的變化如圖6所示，在貯藏的第一天各個組的 氨基酸態(tài)氮值都約為0.8 g/100 mL?？瞻讓φ战M量隨著貯藏時間延長而快速下降，而其他 添加了防腐劑的實驗組，氨基酸態(tài)氮值有下降率較低，說明天然防腐劑抗菌肽能夠較好的 抑制氨基酸態(tài)氮的分解。并且從第13天起添加了天然防腐劑抗菌肽的醬油樣品中氨基酸態(tài) 氮的含量超過了添加苯甲酸鈉的醬油樣品。
[0049] 醬油在37 °C貯藏過程中的光密度變化如圖7所示。在貯藏過程中，對照組由于微 生物的生長繁殖，導(dǎo)致醬油樣品變渾濁，光密度明顯增加。添加防腐劑的樣品中微生物生長 收到抑制，樣品的渾濁度變化較慢，其中苯甲酸鈉組和天然防腐劑抗菌肽組的變化趨勢基 本相同，貯藏7d后添加苯甲酸鈉的醬油樣品透光度開始超過天然防腐劑抗菌肽組。
[0050] 醬油在37 °C貯藏過程中細菌總數(shù)的變化如圖8所示，與對照組相比，微生物在添 加防腐劑的醬油中的生長是受到顯著抑制的。682717-2003規(guī)定醬油中的細菌總數(shù)<3乂 IO4 CFU/mL，空白對照組在第9天的時候細菌總數(shù)就超過了3X104 CFU/mL，即醬油已經(jīng)不新 鮮。0.3%的天然防腐劑抗菌肽能夠明顯抑制醬油中微生物的生長繁殖，并且隨著貯藏時間 的延長，添加天然防腐劑抗菌肽的樣品菌落總數(shù)增長量小于苯甲酸鈉組，因此天然防腐劑 抗菌肽的作用效果更持久。
【主權(quán)項】
1. 一種醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將生長對數(shù)期的副干酪乳桿菌堅韌亞種FX-6-1菌株按照體積比1~3:20接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，在35~40 °C下?lián)u床培養(yǎng)10~16 h，活化菌株，所述副干酪乳桿菌堅韌亞種 FX-6-1已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC Μ 2014043,保藏日期為2014 年02月23日； (2) 將活化菌株用MRS培養(yǎng)基以體積比為1:10~14的比例稀釋至0D6Q()=0.15~0.3; (3) 取脫脂大豆加入水中，混勻、磨碎并煮沸，用四層紗布將粗豆渣過濾并除去，將過濾 后的脫脂豆?jié){用巴氏消毒法處理； (4) 將脫脂豆?jié){置于發(fā)酵罐中，接種步驟(2)稀釋后的活化菌株，添加葡萄糖和酵母粉， 將發(fā)酵罐內(nèi)各種物質(zhì)徹底搖勻溶解，放置在30~35 °C發(fā)酵70~75 h; (5 )發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液離心分離，去上清液，過濾； (6)將濾液真空冷凍干燥成粉末狀后冷凍保存，即得一種醬油用天然防腐劑-抗菌肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，步驟（1) 中，所述FX-6-1菌株在MRS液體培養(yǎng)基的接種量為8~10%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，步驟(3) 中，所述脫脂大豆和水的質(zhì)量體積配比為1~3:6。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，步驟(4) 中，所述稀釋后的活化菌株和脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積配比為5~15:100,所述葡萄糖與脫脂豆 漿的質(zhì)量體積比為3~4:100,所述酵母粉與脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積比為1~3:100,所述發(fā)酵 溫度30~35 °C，發(fā)酵時間70~75 h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所說的醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，步驟 (4)中，所述稀釋后的活化菌株和脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積配比為9:100,所述葡萄糖與脫脂豆 漿的質(zhì)量體積比為3.44:100,所述酵母粉與脫脂豆?jié){的質(zhì)量體積比為2:100,所述發(fā)酵溫度 32 °C，發(fā)酵時間72 h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，步驟(5) 中，所述離心分離轉(zhuǎn)速4000 r/min，時間10 min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醬油用天然防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于，步驟(6) 中，所述冷凍干燥溫度為-40 °C，冷凍保存溫度為-20 °C。8. -種如權(quán)利要求1~7任意一項所述的方法制備的醬油用天然防腐劑抗菌肽。9. 一種如權(quán)利要求8所述的醬油用天然防腐劑抗菌肽的使用方法，其特征在于，包括： 取上述制備好的醬油用天然防腐劑，在醬油原液中加入抗菌肽，其中抗菌肽與醬油原液的 質(zhì)量比為0.1~0.5:100。
【文檔編號】C12R1/225GK106086124SQ201610692125
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月21日 公開號201610692125.4, CN 106086124 A, CN 106086124A, CN 201610692125, CN-A-106086124, CN106086124 A, CN106086124A, CN201610692125, CN201610692125.4
【發(fā)明人】曹庸, 彭勃, 苗建銀, 陳運嬌, 王群
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)