一種木質(zhì)纖維素的生物?離子液體聯(lián)合預(yù)處理方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用細(xì)菌和離子液體聯(lián)合預(yù)處理提高木質(zhì)纖維素糖化效率的方法。首先利用一株高效的木質(zhì)素降解菌Sphingobacterium sp.LD?1(保藏號為CGMCC No.10920)對木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行生物處理，去除部分木質(zhì)素、半纖維素，并在一定程度上破壞木質(zhì)纖維素致密的結(jié)構(gòu)；再進(jìn)一步利用離子液體在一定溫度下對木質(zhì)纖維素預(yù)處理一定時(shí)間。本發(fā)明能減少木質(zhì)素、半纖維素組分所占比例，明顯降低木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度，增大纖維素酶的可及表面，提高木質(zhì)纖維素的糖化效率。本發(fā)明具有對設(shè)備抗壓和抗腐蝕性要求不高、操作簡單、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。CGMCC NO. 1092020150528
【專利說明】
一種木質(zhì)纖維素的生物-離子液體聯(lián)合預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理技術(shù)領(lǐng)域，具體來講是一種細(xì)菌Sphingobacterium sp.LD-1與離子液體聯(lián)合預(yù)處理木質(zhì)纖維素原料提高酶解效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著全球經(jīng)濟(jì)、文化的不斷發(fā)展，人們對于可再生能源的需求越來越大，而木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的天然可再生生物質(zhì)資源。近年來，利用木質(zhì)纖維素制取燃料乙醇受到了國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注，發(fā)展木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的能源技術(shù)，對于解決當(dāng)今能源短缺、環(huán)境污染、糧食危機(jī)等都有十分重大的意義。
[0003]木質(zhì)纖維素構(gòu)成了植物的細(xì)胞壁，它主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三部分組成。纖維素是由D-葡萄糖通過β_1，4糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的線性高分子聚合物，由結(jié)晶相和非結(jié)晶相交錯(cuò)形成，結(jié)晶相結(jié)構(gòu)致密，阻礙纖維素的分解。半纖維素是由幾種不同類型五碳糖和六碳糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，它結(jié)合在纖維素微纖維的表面，并且相互連接。木質(zhì)素是由苯丙烷及其衍生物為基本組成單位而形成的高分子芳香族化合物，主要作用是通過形成交織網(wǎng)來硬化細(xì)胞壁，為次生壁主要成分，在水解纖維素過程中扮演著屏障作用。預(yù)處理過程的目的就是破壞木質(zhì)素、半纖維素對纖維素的包裹，降低木質(zhì)纖維素結(jié)晶度，增大酶的可及表面，提高酶解效率。
[0004]離子液體是指在室溫或接近室溫下呈現(xiàn)液態(tài)的、完全由陰陽離子所組成的鹽，也稱為低溫熔融鹽。作為一種新型的綠色溶劑，離子液體有著極低的蒸氣壓、不易燃、熱穩(wěn)定性好、可設(shè)計(jì)還可循環(huán)利用，在有機(jī)合成、催化、電化學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。2002年Rogers等人發(fā)現(xiàn)室溫離子液體能夠溶解纖維素，自此，室溫離子液體在木質(zhì)纖維素預(yù)處理方向引起了學(xué)術(shù)界和企業(yè)界的高度重視。大部分離子液體預(yù)處理木質(zhì)纖維素都是利用離子液體對木質(zhì)纖維素的溶解性在高溫、低固條件下劇烈攪拌將木質(zhì)纖維素溶解，再加入反溶劑使纖維素重析再生，以破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)、降低其結(jié)晶度來提高酶解糖化率。該工藝對設(shè)備的要求嚴(yán)苛、成本高。
[0005]生物(包括真菌、細(xì)菌、放線菌等)也廣泛應(yīng)用于木質(zhì)纖維素產(chǎn)乙醇的預(yù)處理，尤其是白腐真菌。生物方法處理?xiàng)l件溫和、不造成環(huán)境污染、成本低，但預(yù)處理時(shí)間長、效率低、糖成份有損失等缺點(diǎn)阻礙了其發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于利用一種生物聯(lián)合離子液體預(yù)處理的方法提高木質(zhì)纖維素的酶解糖化效率。
[0007]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0008](I)木質(zhì)纖維素干燥、粉碎，控制粒徑為180μπι?425μπι;
[0009](2)將保存在LB斜面的LD-1菌體接種于LB液體培養(yǎng)基中，于25 °C?40 °C溫度下，培養(yǎng)16?24h，得到LD-1的種子液；
[0010](3)其中所述LB液體培養(yǎng)基各成分配比為:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1L;所述LB斜面是在上述配方的基礎(chǔ)上加入15?20g/l的瓊脂；
[0011](4)將上一步所得到的LD-1種子液在6000?12000rpm條件下離心I?5分鐘，棄去上層清液，收集菌體；
[0012](5)進(jìn)一步將收集的LD-1菌體按5?15% (體積比)接種量，接種于木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基中，于25°C?40°C溫度下，自然pH，培養(yǎng)3?7天；
[0013](6)其中所述木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基各成分配比為:木質(zhì)纖維素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0g^KH2PO4 I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.Ig,FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸餾水1L;
[0014](7)將經(jīng)過LD-1培養(yǎng)后的木質(zhì)纖維素清洗至pH呈中性后，于50°C?60°C烘干至恒重；
[0015](8)在LD-1預(yù)處理木質(zhì)纖維素與離子液體質(zhì)量比為1:2?1:5的條件下將兩者混合均勻，于90?130°C下靜置2?6h，隨后冷卻至室溫，加入去離子水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理木質(zhì)纖維素；
[0016](9)將預(yù)處理木質(zhì)纖維素按照固液比為10?30mg/mL與檸檬酸鹽緩沖液混合，再按照10?40FPU/g底物的比例加入纖維素酶，在100?200rpm/min，40?60°C條件下，酶解12?48小時(shí)。
[00?7 ] 步驟(8)中所述的離子液體為1-乙基-3甲基咪卩坐醋酸鹽([Emim ] [ Ac ])。
[0018]步驟(9)中所述的檸檬酸鹽緩沖液的的濃度為0.1moI/L，pH為4.8。
[0019]本發(fā)明提供的預(yù)處理方法的優(yōu)勢在于:
[0020](I)利用高效木質(zhì)素降解菌LD-1生物處理與離子液體結(jié)合的兩步法，去除大部分木質(zhì)素組分，降低木質(zhì)纖維素結(jié)晶度，增大纖維素酶的可及表面，提高木質(zhì)纖維素的糖化效率；
[0021](2)采用高效木素降解細(xì)菌對木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理，與真菌預(yù)處理相比大大縮短了生物預(yù)處理周期并極大的保存了纖維素含量；
[0022](3)離子液體預(yù)處理過程中以高固條件進(jìn)行反應(yīng)，采用靜置方式，無需對纖維素進(jìn)行再生重析，簡化了工藝過程，并極大地降低了能耗。
【附圖說明】
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[0023]圖1:經(jīng)本發(fā)明組合預(yù)處理后木質(zhì)纖維素各組分變化
[0024]圖2:經(jīng)本發(fā)明組合預(yù)處理后木質(zhì)纖維素酶解效果分析
[0025]圖3:經(jīng)本發(fā)明組合預(yù)處理的木質(zhì)纖維素預(yù)處理前后掃描電鏡分析
【具體實(shí)施方式】
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[0026]下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例1
[0028](I)將水稻秸桿洗凈、烘干、粉碎，控制其粒徑分布在180μπι?425μπι之間；
[0029](2)將保存在LB斜面的LD-1菌體接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30 °C溫度下，培養(yǎng)18h，得到LD-1的種子液；
[0030](3)其中所述LB液體培養(yǎng)基各成分配比為:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1L，所述LB斜面是在上述配方的基礎(chǔ)上加入15g/l的瓊脂；
[0031 ] (4)將上一步所得到的LD-1種子液在1000rpm條件下離心2分鐘，棄去上層清液，收集菌體；
[0032](5)進(jìn)一步將收集的LD-1菌體按10% (體積比)接種量，接種于木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基中，于30°C溫度下，自然pH，培養(yǎng)3天；
[0033](6)其中所述木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基各成分配比為:木質(zhì)纖維素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0gjKH2PO4I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.Ig，F(xiàn)eSO40.05g,MnSO40.02g，蒸餾水1L;
[0034](7)將經(jīng)過LD-1培養(yǎng)后的木質(zhì)纖維素清洗至pH呈中性后，于55°C烘干至恒重；
[0035](8)在LD-1預(yù)處理木質(zhì)纖維素與[Emim] [Ac]質(zhì)量比為1:3的條件下將兩者混合均勻，于130°C下靜置2?6h，隨后冷卻至室溫，加入去離子水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理木質(zhì)纖維素；
[0036](9)將預(yù)處理木質(zhì)纖維素按照固液比為25mg/mL與檸檬酸鹽緩沖液混合，再按照12FPU/g底物的比例加入纖維素酶，在110?150rpm/min，50 °C條件下，酶解48小時(shí)；
[0037]通過本實(shí)施例的實(shí)施，如附圖1所示，經(jīng)本方法處理后的水稻秸桿中木質(zhì)素與半纖維素含量顯著降低，纖維素比例提升;預(yù)處理后的水稻秸桿酶解48小時(shí)后還原糖收率最高達(dá)到98% (如附圖2)，而未經(jīng)預(yù)處理的水稻秸桿酶解后還原糖得率僅為20.7%，經(jīng)該實(shí)施例預(yù)處理后，水稻秸桿酶解效率提高為原來的4.7倍;結(jié)合掃描電鏡圖像(如附圖3)所示，未經(jīng)預(yù)處理的水稻秸桿(a、b)呈直桿狀且桿徑較粗，表面平整光滑，而經(jīng)本實(shí)施例預(yù)處理后的水稻秸桿(c、d)剛性結(jié)構(gòu)已完全破壞，表面侵蝕嚴(yán)重，大量纖維素暴露出來。
[0038]實(shí)施例2
[0039](I)將水稻秸桿洗凈、烘干、粉碎，控制其粒徑分布在180μπι?425μπι之間；
[0040](2)將保存在LB斜面的LD-1菌體接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30 °C溫度下，培養(yǎng)18h，得到LD-1的種子液；
[0041](3)其中所述LB液體培養(yǎng)基各成分配比為:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1L，所述LB斜面是在上述配方的基礎(chǔ)上加入15g/l的瓊脂；
[0042](4)將上一步所得到的LD-1種子液在1000rpm條件下離心2分鐘，棄去上層清液，收集菌體；
[0043](5)進(jìn)一步將收集的LD-1菌體按10% (體積比)接種量，接種于木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基中，于30°C溫度下，自然pH，培養(yǎng)3天；
[0044](6)其中所述木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基各成分配比為:木質(zhì)纖維素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0gjKH2PO4I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.lg,FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸餾水1L;
[0045](7)將經(jīng)過LD-1培養(yǎng)后的木質(zhì)纖維素清洗至pH呈中性后，于55°C烘干至恒重；
[0046](8)在LD-1預(yù)處理木質(zhì)纖維素與[Emim] [Ac]質(zhì)量比為1:2?1:5的條件下將兩者混合均勻，于110°C下靜置4?6h，隨后冷卻至室溫，加入去離子水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理木質(zhì)纖維素；
[0047](9)將預(yù)處理木質(zhì)纖維素按照固液比為25mg/mL與檸檬酸鹽緩沖液混合，再按照12FPU/g底物的比例加入纖維素酶，在110?150rpm/min，50 °C條件下，酶解48小時(shí)；
[0048]經(jīng)本實(shí)施例預(yù)處理后的水稻秸桿酶解后還原糖得率最高從20.7%提升到86.9%，酶解效率提高為原來的4.1倍。
[0049]實(shí)施例3
[0050](I)將水稻秸桿洗凈、烘干、粉碎，控制其粒徑分布在180μπι?425μπι之間；
[0051 ] (2)將保存在LB斜面的LD-1菌體接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30 °C溫度下，培養(yǎng)18h，得到LD-1的種子液；
[0052](3)其中所述LB液體培養(yǎng)基各成分配比為:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，蒸餾水1L，所述LB斜面是在上述配方的基礎(chǔ)上加入15g/l的瓊脂；
[0053](4)將上一步所得到的LD-1種子液在1000rpm條件下離心2分鐘，棄去上層清液，收集菌體；
[0054](5)進(jìn)一步將收集的LD-1菌體按10% (體積比)接種量，接種于木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基中，于30°C溫度下，自然pH，培養(yǎng)3天；
[0055](6)其中所述木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基各成分配比為:木質(zhì)纖維素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0gjKH2PO4I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.lg,FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸餾水1L;
[0056](7)將經(jīng)過LD-1培養(yǎng)后的木質(zhì)纖維素清洗至pH呈中性后，于55°C烘干至恒重；
[0057](8)在LD-1預(yù)處理木質(zhì)纖維素與[Emim] [Ac]質(zhì)量比為1:2?1:5的條件下將兩者混合均勻，于130°C下靜置2h，隨后冷卻至室溫，加入去離子水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理木質(zhì)纖維素；
[0058](9)將預(yù)處理木質(zhì)纖維素按照固液比為25mg/mL與檸檬酸鹽緩沖液混合，再按照12FPU/g底物的比例加入纖維素酶，在110?150rpm/min，50 °C條件下，酶解48小時(shí)；
[0059]經(jīng)本實(shí)施例預(yù)處理后的水稻秸桿酶解后還原糖得率最高從20.7%提升到91.08%,酶解效率提高為原來的4.4倍。
[0060]注:本專利涉及的細(xì)菌Sphingobacterium sp.1^)_1于2015年5月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號:CGMCC N0.10920，分類命名為鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種木質(zhì)纖維的生物-離子液體聯(lián)合預(yù)處理方法，其特征在于:包括以下幾個(gè)步驟:(I)細(xì)菌Sphingobacteriumx).LD-1 預(yù)處理:、島Sphingobacteriump.LD-1菌體按5?15%(體積比)接種量，接種于木質(zhì)纖維素液體培養(yǎng)基中，于25?40°C、自然pH條件下，培養(yǎng)3~7天，所得木質(zhì)纖維素用超純水清洗3次，烘干至恒重； (2)離子液體預(yù)處理:將步驟(I)所得木質(zhì)纖維素與[Emim] [Ac]按質(zhì)量比為1: 2?1: 5混合均勻，90°0130°C恒溫環(huán)境靜置2?6 h后，冷卻至室溫，加入去離子水，過濾、洗滌濾渣，干燥后獲得預(yù)處理木質(zhì)纖維素。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高木質(zhì)纖維素糖化效果的組合預(yù)處理方法，其特征為步驟(1)中木質(zhì)纖維素經(jīng)細(xì)菌uffisp.LD-1在25?40°C、自然pH條件下，培養(yǎng)3?7天。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高木質(zhì)纖維素糖化效果的組合預(yù)處理方法，其特征為步驟(2 )中所述的離子液體為1-乙基-3甲基咪卩坐醋酸鹽([Emim ] [ Ac ])。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高木質(zhì)纖維素糖化效果的組合預(yù)處理方法，其特征為步驟(2)中木質(zhì)纖維素與[Emim][Ac]按質(zhì)量比為1:2~1:5混合均勻，90°0130°(:恒溫環(huán)境靜置2~.6 h
【文檔編號】C12P19/14GK106086115SQ201610770559
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月30日
【發(fā)明人】陳躍輝, 周沫, 戴友芝
【申請人】湘潭大學(xué)