本發(fā)明涉及一種生物強(qiáng)化木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，化石資源日益枯竭，能源問(wèn)題面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)，同時(shí)化石燃料燃燒造成環(huán)境污染與氣候變暖，使開(kāi)發(fā)清潔可再生能源變得日益重要。氫能以其燃燒熱值高，每千克氫燃燒后的熱量約為汽油的3倍，酒精的3.9倍，焦炭的4.5倍，燃燒的產(chǎn)物只有水，清潔可再生等優(yōu)點(diǎn)成為化石燃料的理想替代品。然而目前氫氣的制備主要來(lái)源于化石燃料或電解水，對(duì)大規(guī)模制氫來(lái)說(shuō)仍不具備經(jīng)濟(jì)可行性，甚至造成二次污染。生物制氫技術(shù)是解決當(dāng)前所面對(duì)的能源問(wèn)題和環(huán)境污染問(wèn)題的重要手段之一，但是由于技術(shù)上的制約，至今仍無(wú)法獲得廉價(jià)的氫氣，尋求效率高、成本低的制氫技術(shù)依然是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源之一，其資源利用及生物化工過(guò)程對(duì)解決能源問(wèn)題、減少碳排放與環(huán)境污染、實(shí)現(xiàn)能源可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實(shí)意義。木質(zhì)纖維素是一個(gè)巨大的可通過(guò)微生物發(fā)酵作用將其轉(zhuǎn)化為能源的可再生糖類(lèi)資源，隨著對(duì)木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和成分的了解，以及對(duì)纖維素酶生產(chǎn)研究的深入，木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為微生物容易利用的混合可發(fā)酵糖(主要為葡萄糖和木糖)的成本大大降低。因此，利用木質(zhì)纖維素這一在自然界大量存在的可再生資源為原材料生產(chǎn)氫氣，可以使獲取廉價(jià)氫氣成為可能。

為滿足木質(zhì)纖維素生物制氫的工業(yè)化生產(chǎn)需求，建立長(zhǎng)期穩(wěn)定運(yùn)行的制氫系統(tǒng)勢(shì)在必行。這一方面依賴于高效產(chǎn)氫菌種的篩選，另一方面依賴于高產(chǎn)氫量及產(chǎn)氫速率的生物制氫反應(yīng)器的開(kāi)發(fā)。盡管目前在這兩方面國(guó)內(nèi)外均已有長(zhǎng)足的進(jìn)展，然而在連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程中造成的菌種易于流失，底物利用率低(尤其是木質(zhì)纖維素水解液這種混合底物)的問(wèn)題仍難以得到妥善解決。采取連續(xù)生物制氫反應(yīng)器中產(chǎn)氫菌種固定化技術(shù)在提高單位體積的生物量的同時(shí)能夠有效增強(qiáng)制氫穩(wěn)定性。然而目前生物固定化所用載體主要以海藻酸鹽、聚丙烯酰胺凝膠、聚乙烯醇凝膠、聚丙烯酸凝膠等包埋為主。這類(lèi)載體一般價(jià)格偏高，使用壽命短，少數(shù)載體具有毒性，有損微生物活性，而且存在較大的傳質(zhì)阻力。因此研制開(kāi)發(fā)一種既能夠固定細(xì)胞又能保持良好的催化活性和存活力而且具有低成本，性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)的固定化方式對(duì)于推動(dòng)木質(zhì)纖維素生物制氫技術(shù)大規(guī)模發(fā)展至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是要解決現(xiàn)有生物制氫反應(yīng)器中以木質(zhì)纖維素水解液為底物時(shí)，反應(yīng)器中生物量易流失，制氫不穩(wěn)定，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)氫底物利用率低的問(wèn)題，而提供一種利用生物載體固定化強(qiáng)化木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的方法。

一種利用生物載體固定化強(qiáng)化木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的方法，具體是按以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、生物載體制備：將黑曲霉菌Aspergillus niger Y3孢子接種于黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基中，接種量為1×10⁶個(gè)孢子/mL～3×10⁶個(gè)孢子/mL，在溫度為30℃的有氧條件下懸浮培養(yǎng)2～7天，得到含黑曲霉菌絲球的培養(yǎng)基；二、向序批式生物制氫反應(yīng)器中加入產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，從步驟一中得到的含黑曲霉菌絲球的培養(yǎng)基將粗黑曲霉菌絲球取出，并用無(wú)菌水對(duì)粗黑曲霉菌絲球沖洗2～4次，得到黑曲霉菌絲球，再將黑曲霉菌絲球加入序批式生物制氫反應(yīng)器內(nèi)的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，黑曲霉菌絲球的加入量為35g/L～210g/L，且在黑曲霉菌絲球加入過(guò)程中持續(xù)向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99.99％的氮?dú)?，黑曲霉菌絲球加完后繼續(xù)向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99.99％的氮?dú)庖耘懦磻?yīng)器中的氧氣，然后向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按照體積比為10％的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)氫種子液，將pH調(diào)至6.5，控制溫度為60℃，攪拌速度為150rpm/min，水力停留時(shí)間6h～24h下進(jìn)行連續(xù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：一、本發(fā)明使用生物載體菌絲球強(qiáng)化木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫，減少了采用其他固定化載體在木質(zhì)纖維素產(chǎn)氫過(guò)程中的投入及可能對(duì)環(huán)境造成的影響。二、本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定強(qiáng)化制氫，底物利用率達(dá)到95％以上，平均產(chǎn)氫速率達(dá)到10mmol H₂L^-1h^-1以上，最高產(chǎn)氫速率達(dá)到12.36mmol H₂L^-1h^-1。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中序批式生物制氫反應(yīng)器的示意圖，其中1表示進(jìn)水罐，2表示進(jìn)水泵，3表示磁力攪拌器，3-1表示磁力轉(zhuǎn)子，4表示出水泵，5表示出水箱，6表示第二時(shí)間繼電器，7表示第三時(shí)間繼電器，8表示加熱棒，9表示氣體流量計(jì)，10表示反應(yīng)器主體，11表示水浴箱，12表示第一時(shí)間繼電器。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式是一種利用生物載體固定化強(qiáng)化木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的方法，具體是按以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、生物載體制備：將黑曲霉菌Aspergillus niger Y3孢子接種于黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基中，接種量為1×10⁶個(gè)孢子/mL～3×10⁶個(gè)孢子/mL，在溫度為30℃的有氧條件下懸浮培養(yǎng)2～7天，得到含黑曲霉菌絲球的懸濁液；二、向序批式生物制氫反應(yīng)器中加入產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，從步驟一中得到的含黑曲霉菌絲球的培養(yǎng)基將粗黑曲霉菌絲球取出，并用無(wú)菌水對(duì)粗黑曲霉菌絲球沖洗2～4次，得到黑曲霉菌絲球，再將黑曲霉菌絲球加入序批式生物制氫反應(yīng)器內(nèi)的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，黑曲霉菌絲球的加入量為35g/L～210g/L，且在黑曲霉菌絲球加入過(guò)程中持續(xù)向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99.99％的氮?dú)猓谇咕z球加完后繼續(xù)向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99.99％的氮?dú)庖耘懦磻?yīng)器中的氧氣，然后向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按照體積比為10％的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)氫種子液，將pH調(diào)至6.5，控制溫度為60℃，攪拌速度為150rpm/min，水力停留時(shí)間6h～24h下進(jìn)行連續(xù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫。

本實(shí)施方式所述的黑曲霉菌Aspergillus niger Y3保藏編號(hào)為CGMCC No.3.3926；在2011年第6期第4360–4365頁(yè)的《Bioresource Technology》中刊登的名稱(chēng)為“Performance of enhanced biological SBR process for aniline treatment by mycelial pellet as biomass carrier”的文章中公開(kāi)。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是：步驟一中所述的黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基由蔗糖、NH₄Cl、KH₂PO₃·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O和水制備而成，且所述的黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基中蔗糖濃度為10.0g/L，NH₄Cl濃度為1.0g/L，KH₂PO₃·3H₂O濃度為1.0g/L，MgSO₄·7H₂O濃度為0.5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O濃度為0.1g/L。其他與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二之一不同點(diǎn)是：步驟一中接種量為1.5×10⁶個(gè)孢子/mL～2.5×10⁶個(gè)孢子/mL。其他與具體實(shí)施方式一或二相同。

本實(shí)施方式步驟一中將100mL黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基放入250mL錐形瓶中，然后按接種量為1×10⁶個(gè)孢子/mL～3×10⁶個(gè)孢子/mL接種黑曲霉孢子，在溫度為30℃和攪拌速度為140rpm/min的有氧條件下振動(dòng)培養(yǎng)2～7天，得到含黑曲霉菌絲球的懸濁液。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同點(diǎn)是：步驟二中所述的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)鹽溶液和碳源組成，且營(yíng)養(yǎng)鹽溶液與碳源的體積比為3:7；

所述營(yíng)養(yǎng)鹽溶液由氯化銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、半胱氨酸、MgCl₂·6H₂O、氯化鉀、酵母粉、蛋白胨、微量金屬元素貯液II、維生素貯液和0.1‰(w/v)的刃天青制備而成；且所述的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化銨的質(zhì)量-體積濃度為1.0g/L、氯化鈉的質(zhì)量-體積濃度為1.0g/L、磷酸氫二鉀的質(zhì)量-體積濃度為3g/L、磷酸二氫鉀的質(zhì)量-體積濃度為1.5g/L、半胱氨酸的質(zhì)量-體積濃度為0.5g/L、MgCl₂·6H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.5g/L、氯化鉀的質(zhì)量-體積濃度為0.2g/L、酵母粉的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、蛋白胨的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、微量金屬元素貯液II占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、維生素貯液占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、0.1‰(w/v)的刃天青占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一；其中所述的微量金屬元素貯液II由氯化亞鐵、氯化鋅、硼酸、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、NiCl₂·6H₂O、Na₂MO₄·H₂O、鎢酸鈉和Na₂SeO₄·5H₂O制備而成，微量金屬元素貯液II中氯化亞鐵的質(zhì)量-體積濃度為1.5g/L，氯化鋅的質(zhì)量-體積濃度為70mg/L，硼酸的質(zhì)量-體積濃度為6mg/L，MnCl₂·4H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.1g/L，CuCl₂·2H₂O的質(zhì)量-體積濃度為2mg/L，CoCl₂·6H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.19g/L，NiCl₂·6H₂O的質(zhì)量-體積濃度為24mg/L，Na₂MO₄·H₂O的質(zhì)量-體積濃度為36mg/L，鎢酸鈉的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L，Na₂SeO₄·5H₂O的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L；其中所述的維生素貯液由硫辛酸、生物素、煙酸、鹽酸硫胺素、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、泛酸鈣、維生素B₁₂和鹽酸吡哆醇制備而成，維生素貯液中硫辛酸的質(zhì)量-體積濃度為50.0mg/L，生物素的質(zhì)量-體積濃度為20.0mg/L，0.35g/L的煙酸，鹽酸硫胺素的質(zhì)量-體積濃度5.0mg/L為，對(duì)氨基苯甲酸的質(zhì)量-體積濃度為50.0mg/L，葉酸的質(zhì)量-體積濃度為20.0mg/L，泛酸鈣的質(zhì)量-體積濃度為50.0mg/L，維生素B₁₂的質(zhì)量-體積濃度為1.0mg/L，鹽酸吡哆醇的質(zhì)量-體積濃度為100.0mg/L；

所述的碳源為玉米秸稈水解液。

其他與具體實(shí)施方式一至三相同。

本實(shí)施方式所述的玉米秸稈水解液是按以下步驟制備的：

①、培養(yǎng)：將真菌Trichoderma viride的孢子接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在29℃、150r/min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天；②、分離：將步驟一培養(yǎng)4天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在4℃，8000r/min離心10min，分離得到上清液即為粗酶液；③、配置纖維素溶液：將玉米秸稈粉碎至粒度為10～30mm，并采用熱堿方法處理2h，然后加入到物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為35g/L的纖維素溶液；④、制備纖維素糖化液：在50℃、pH＝2的條件下，將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為150rpm/min放置3天，即得到纖維素糖化液；五、產(chǎn)氫：13000r/min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心20min，分離得到的玉米秸稈水解液；

步驟①中所述的綠色木霉是真菌Trichoderma viride，編號(hào)：3.2876，分離號(hào)：糖研37；

步驟①中真菌Trichoderma viride的孢子接種量為1×10¹²個(gè)/L～1×10¹⁶個(gè)/L；

步驟①中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基由KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂、有機(jī)碳源、有機(jī)氮源和微量金屬元素貯液I組成，其中KH₂PO₄的質(zhì)量-體積濃度為2.0g/L，(NH₄)₂SO₄的質(zhì)量-體積濃度為1.4g/L，MgSO₄·7H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.3g/L，CaCl₂的質(zhì)量-體積濃度為0.3g/L，有機(jī)碳源的質(zhì)量-體積濃度為30g/L，有機(jī)氮源的質(zhì)量-體積濃度為5g/L，微量金屬元素貯液I占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積的千分之一；其中所述的有機(jī)碳源是麩皮與玉米秸稈按質(zhì)量比為2:1混合的混合物；其中所述的有機(jī)氮源為豆餅粉；其中所述的微量金屬元素貯液I是由FeSO₄·7H₂O、MgSO₄、ZnSO₄·7H₂O和CoCl₂組成，其中FeSO₄·7H₂O的質(zhì)量-體積濃度為3～7g/L，MgSO₄的質(zhì)量-體積濃度為0.5～3.0g/L，ZnSO₄·7H₂O的質(zhì)量-體積濃度為1.0～2.0g/L，CoCl₂的質(zhì)量-體積濃度為1.0～3.0g/L；

步驟③中所述的熱堿方法是在100℃條件下采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液處理粒度為10～30mm的玉米秸稈，其中所述的粒度為10～30mm的玉米秸稈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液的固液比為1:10，其中所述的固液比是粒度為10～30mm的玉米秸稈的質(zhì)量與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液的體積之比。

上述真菌Trichoderma viride在專(zhuān)在利授權(quán)號(hào)ZL201110253537.5“一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法”中公開(kāi)。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同點(diǎn)是：步驟二中所述的發(fā)酵產(chǎn)氫種子液為產(chǎn)氫菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的液體懸濁液；其中所述的產(chǎn)氫菌為熱解糖厭氧芽孢桿菌W16。其他與具體實(shí)施方式一至四相同。

本實(shí)施方式所述的熱解糖厭氧芽孢桿菌W16(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16)，Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16在2008年第33期第6124–6132頁(yè)的《International Journal of Hydrogen Energy》中刊登的名稱(chēng)為“Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16”的文章中公開(kāi)。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同點(diǎn)是：步驟二中黑曲霉菌絲球的加入量為40g/L～55g/L。其他與具體實(shí)施方式一至五相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

采用下述試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明效果

試驗(yàn)一：一種利用生物載體固定化強(qiáng)化木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)氫的方法，具體是按以下步驟實(shí)現(xiàn)：一、生物載體制備：將黑曲霉菌Aspergillus niger Y3孢子接種于黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基中，接種量為1.5×10⁶個(gè)孢子/mL～2.5×10⁶個(gè)孢子/mL，在溫度為30℃的有氧條件下懸浮培養(yǎng)5天，得到含黑曲霉菌絲球的懸濁液；二、向序批式生物制氫反應(yīng)器中加入產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基，從步驟一中得到的含黑曲霉菌絲球的培養(yǎng)基將粗黑曲霉菌絲球取出，并用無(wú)菌水對(duì)粗黑曲霉菌絲球沖洗3次，得到黑曲霉菌絲球，再將黑曲霉菌絲球加入序批式生物制氫反應(yīng)器內(nèi)的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，黑曲霉菌絲球的加入量為46g/L，且在黑曲霉菌絲球加入過(guò)程中持續(xù)向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99.99％的氮?dú)猓谇咕z球加完后繼續(xù)向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中通入純度為99.99％的氮?dú)庖耘懦磻?yīng)器中的氧氣，然后向產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中按照體積比為10％的接種量接入發(fā)酵產(chǎn)氫種子液，將pH調(diào)至6.5，控制溫度為60℃，攪拌速度為150rpm/min，水力停留時(shí)間12h下進(jìn)行連續(xù)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫。

本試驗(yàn)所述的黑曲霉菌Aspergillus niger Y3保藏編號(hào)為CGMCC No.3.3926；在2011年第6期第4360–4365頁(yè)的《Bioresource Technology》中刊登的名稱(chēng)為“Performance of enhanced biological SBR process for aniline treatment by mycelial pellet as biomass carrier”的文章中公開(kāi)。

本試驗(yàn)步驟一中所述的黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基由蔗糖、NH₄Cl、KH₂PO₃·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O和水制備而成，且所述的黑曲霉菌絲球制備培養(yǎng)基中蔗糖濃度為10.0g/L，NH₄Cl濃度為1.0g/L，KH₂PO₃·3H₂O濃度為1.0g/L，MgSO₄·7H₂O濃度為0.5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O濃度為0.1g/L。

本試驗(yàn)步驟二中所述的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基由營(yíng)養(yǎng)鹽溶液和碳源組成，且營(yíng)養(yǎng)鹽溶液與碳源的體積比為3:7；

所述營(yíng)養(yǎng)鹽溶液由氯化銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、半胱氨酸、MgCl₂·6H₂O、氯化鉀、酵母粉、蛋白胨、微量金屬元素貯液II、維生素貯液和0.1‰(w/v)的刃天青制備而成；且所述的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化銨的質(zhì)量-體積濃度為1.0g/L、氯化鈉的質(zhì)量-體積濃度為1.0g/L、磷酸氫二鉀的質(zhì)量-體積濃度為3g/L、磷酸二氫鉀的質(zhì)量-體積濃度為1.5g/L、半胱氨酸的質(zhì)量-體積濃度為0.5g/L、MgCl₂·6H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.5g/L、氯化鉀的質(zhì)量-體積濃度為0.2g/L、酵母粉的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、蛋白胨的質(zhì)量-體積濃度為2g/L、微量金屬元素貯液II占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、維生素貯液占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一、0.1‰(w/v)的刃天青占產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基總體積的千分之一；其中所述的微量金屬元素貯液II由氯化亞鐵、氯化鋅、硼酸、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·2H₂O、CoCl₂·6H₂O、NiCl₂·6H₂O、Na₂MO₄·H₂O、鎢酸鈉和Na₂SeO₄·5H₂O制備而成，微量金屬元素貯液II中氯化亞鐵的質(zhì)量-體積濃度為1.5g/L，氯化鋅的質(zhì)量-體積濃度為70mg/L，硼酸的質(zhì)量-體積濃度為6mg/L，MnCl₂·4H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.1g/L，CuCl₂·2H₂O的質(zhì)量-體積濃度為2mg/L，CoCl₂·6H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.19g/L，NiCl₂·6H₂O的質(zhì)量-體積濃度為24mg/L，Na₂MO₄·H₂O的質(zhì)量-體積濃度為36mg/L，鎢酸鈉的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L，Na₂SeO₄·5H₂O的質(zhì)量-體積濃度為15mg/L；其中所述的維生素貯液由硫辛酸、生物素、煙酸、鹽酸硫胺素、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、泛酸鈣、維生素B₁₂和鹽酸吡哆醇制備而成，維生素貯液中硫辛酸的質(zhì)量-體積濃度為50.0mg/L，生物素的質(zhì)量-體積濃度為20.0mg/L，0.35g/L的煙酸，鹽酸硫胺素的質(zhì)量-體積濃度5.0mg/L為，對(duì)氨基苯甲酸的質(zhì)量-體積濃度為50.0mg/L，葉酸的質(zhì)量-體積濃度為20.0mg/L，泛酸鈣的質(zhì)量-體積濃度為50.0mg/L，維生素B₁₂的質(zhì)量-體積濃度為1.0mg/L，鹽酸吡哆醇的質(zhì)量-體積濃度為100.0mg/L；

所述的碳源為玉米秸稈水解液；所述的玉米秸稈水解液是按以下步驟制備的：

①、培養(yǎng)：將真菌Trichoderma viride的孢子接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在29℃、150r/min的有氧條件下懸浮培養(yǎng)4天；②、分離：將步驟一培養(yǎng)4天液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基在4℃，8000r/min離心10min，分離得到上清液即為粗酶液；③、配置纖維素溶液：將玉米秸稈粉碎至粒度為10～30mm，并采用熱堿方法處理2h，然后加入到物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，配置成質(zhì)量-體積濃度為35g/L的纖維素溶液；④、制備纖維素糖化液：在50℃、pH＝2的條件下，將步驟二分離得到的粗酶液加入步驟三制備的纖維素溶液中，在攪拌速度為150rpm/min放置3天，即得到纖維素糖化液；五、離心分離：13000r/min的條件下將步驟四制備的纖維素糖化液離心20min，分離得到的玉米秸稈水解液；步驟①中所述的綠色木霉是真菌Trichoderma viride，編號(hào)：3.2876，分離號(hào)：糖研37；步驟①中真菌Trichoderma viride的孢子接種量為1×10¹²個(gè)/L～1×10¹⁶個(gè)/L；步驟①中所述液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基由KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂、有機(jī)碳源、有機(jī)氮源和微量金屬元素貯液I組成，其中KH₂PO₄的質(zhì)量-體積濃度為2.0g/L，(NH₄)₂SO₄的質(zhì)量-體積濃度為1.4g/L，MgSO₄·7H₂O的質(zhì)量-體積濃度為0.3g/L，CaCl₂的質(zhì)量-體積濃度為0.3g/L，有機(jī)碳源的質(zhì)量-體積濃度為30g/L，有機(jī)氮源的質(zhì)量-體積濃度為5g/L，微量金屬元素貯液I占液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基總體積的千分之一；其中所述的有機(jī)碳源是麩皮與玉米秸稈按質(zhì)量比為2:1混合的混合物；其中所述的有機(jī)氮源為豆餅粉；其中所述的微量金屬元素貯液I是由FeSO₄·7H₂O、MgSO₄、ZnSO₄·7H₂O和CoCl₂組成，其中FeSO₄·7H₂O的質(zhì)量-體積濃度為3～7g/L，MgSO₄的質(zhì)量-體積濃度為0.5～3.0g/L，ZnSO₄·7H₂O的質(zhì)量-體積濃度為1.0～2.0g/L，CoCl₂的質(zhì)量-體積濃度為1.0～3.0g/L；步驟③中所述的熱堿方法是在100℃條件下采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液處理粒度為10～30mm的玉米秸稈，其中所述的粒度為10～30mm的玉米秸稈與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液的固液比為1:10，其中所述的固液比是粒度為10～30mm的玉米秸稈的質(zhì)量與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的氫氧化鈉溶液的體積之比。

上述真菌Trichoderma viride在專(zhuān)在利授權(quán)號(hào)ZL201110253537.5“一種利用纖維素生產(chǎn)氫氣的方法”中公開(kāi)。

本試驗(yàn)步驟二中所述的發(fā)酵產(chǎn)氫種子液為產(chǎn)氫菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的液體懸濁液；其中所述的產(chǎn)氫菌為熱解糖厭氧芽孢桿菌W16。所述的熱解糖厭氧芽孢桿菌W16(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16)，Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16在2008年第33期第6124–6132頁(yè)的《International Journal of Hydrogen Energy》中刊登的名稱(chēng)為“Dark fermentation of xylose and glucose mix using isolated Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16”的文章中公開(kāi)。

所述的序批式生物制氫反應(yīng)器，包括進(jìn)水罐1、進(jìn)水泵2、第一時(shí)間繼電器12、磁力攪拌器3、反應(yīng)器主體10、水浴箱11、加熱棒8、第三時(shí)間繼電器7、出水泵4、第二時(shí)間繼電器6、出水箱5和氣體流量計(jì)9；所述進(jìn)水罐1通過(guò)進(jìn)水泵2與反應(yīng)器主體10頂部的進(jìn)水口連通，第一時(shí)間繼電器12控制進(jìn)水泵2的開(kāi)關(guān)，反應(yīng)器主體10外部為水浴箱11，水浴箱11設(shè)置在磁力攪拌器3上，第二時(shí)間繼電器6控制磁力攪拌器3的開(kāi)關(guān)；所述反應(yīng)器主體10的底部設(shè)置磁力轉(zhuǎn)子3-1，反應(yīng)器主體10頂部的出水口通過(guò)出水泵4與出水箱5連通，第三時(shí)間繼電器7控制出水泵的開(kāi)關(guān)，水浴箱11內(nèi)設(shè)有加熱棒8，反應(yīng)器主體10頂部上安裝有氣體流出管與出水管，氣體流量9安裝在氣體流出管上。

上述序批式生物制氫反應(yīng)器的工作原理如下：

進(jìn)水罐1中的產(chǎn)氫菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基由進(jìn)水泵2通過(guò)反應(yīng)器主體10頂端的進(jìn)水口泵入反應(yīng)器主體10內(nèi)；反應(yīng)器主體10反應(yīng)區(qū)中發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌在磁力轉(zhuǎn)子3-1的攪拌作用下混合均勻，充分利用培養(yǎng)基中的有機(jī)物產(chǎn)生氫氣，產(chǎn)生的氫氣通過(guò)氣體流量計(jì)9排出反應(yīng)器主體10，反應(yīng)完全后，第二時(shí)間繼電器6控制磁力攪拌器3的開(kāi)關(guān)，進(jìn)行靜置沉淀，然后出水泵4將反應(yīng)后的發(fā)酵液通過(guò)反應(yīng)器主體10頂端的出水管泵出反應(yīng)器主體10進(jìn)入出水箱5中；其中進(jìn)水、攪拌、沉淀、出水均由各自第一時(shí)間繼電器12、第二時(shí)間繼電器6和第三時(shí)間繼電器7進(jìn)行準(zhǔn)確控制；水浴箱11通過(guò)加熱棒8加熱維持反應(yīng)器主體10反應(yīng)區(qū)溫度。

圖1為試驗(yàn)一所述的序批式生物制氫反應(yīng)器的示意圖，其中1表示進(jìn)水罐，2表示進(jìn)水泵，3表示磁力攪拌器，3-1表示磁力轉(zhuǎn)子，4表示出水泵，5表示出水箱，6表示第二時(shí)間繼電器，7表示第三時(shí)間繼電器，8表示加熱棒，9表示氣體流量計(jì)，10表示反應(yīng)器主體，11表示水浴箱，12表示第一時(shí)間繼電器。

通過(guò)計(jì)算可知本發(fā)明木質(zhì)纖維素產(chǎn)氫過(guò)程底物利用率達(dá)到95％以上，且平均產(chǎn)氫速率達(dá)到10mmol H₂L^-1h^-1以上，產(chǎn)氫性能穩(wěn)定，且最高產(chǎn)氫速率達(dá)到12.36mmol H₂L^-1h^-1。