專利名稱：一種抗菌肽dc及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種抗菌肽。
背景技術(shù)：
昆蟲抗菌肽(Cecropin)是通過注射大腸桿菌于柞蠶蛹誘導(dǎo)而產(chǎn)生的殺菌多肽。1981年，黃自然等首先報(bào)道分離到柞蠶抗菌肽，有B、D等多個(gè)成員，具有廣譜殺菌功能。天然抗菌肽可用作藥物原料。如1996年用作治療腎炎、肝炎的新藥“腎肝寧”。批準(zhǔn)文號(hào)粵衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1996)第107388號(hào)，以投入生產(chǎn)。1997年，柞蠶素(含抗菌肽)膠囊作為西藥二類治療乙型肝炎已進(jìn)入臨床觀察，批準(zhǔn)文號(hào)(97)XL-29號(hào)。由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高未能工業(yè)化生產(chǎn)。1991年，根據(jù)蠶抗菌肽的氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成抗菌肽AD基因，轉(zhuǎn)化于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達(dá)，通過發(fā)酵獲得抗菌肽AD。已申報(bào)發(fā)明專利。公開號(hào)01107585.6。1992年，設(shè)計(jì)合成抗菌肽CAD基因，轉(zhuǎn)化于畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)，通過發(fā)酵獲得抗菌肽CAD，已獲發(fā)明專利授予權(quán)證書ZL 01107584.8及ZL 99117076.8。2004年，設(shè)計(jì)合成抗菌肽ADC基因，轉(zhuǎn)化于粘質(zhì)芽胞桿菌(Bacillus polymyxa)中表達(dá)，通過發(fā)酵獲得抗菌肽ADC，已申請(qǐng)發(fā)明專利，待公開。以上3種抗菌肽基因(AD、CAD、ADC)，分別在啤酒酵母、畢赤酵母及粘質(zhì)芽胞桿菌中表達(dá)。重組抗菌肽主要用作飼料添加劑，代替禁用的抗生素，防治小雞、仔豬及對(duì)蝦的疾病，效果良好，現(xiàn)已進(jìn)入中試試產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗菌肽DC。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述抗菌肽DC的制備方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述抗菌肽DC在制備消毒殺菌劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案1、抗菌肽DC基因的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)天然抗菌肽的氨基酸序列，選用酵母屬偏愛的遺傳密碼，設(shè)計(jì)合成抗菌肽DC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。其編碼的抗菌肽DC的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
該基因第11位氨基酸為賴氨酸(K)，密碼為AAG，第12位氨基酸為纈氨酸(V)，密碼為GTT。不同于抗菌肽ADC，因?yàn)锳DC基因第11、12位氨基酸均為賴氨酸(K、K)；抗菌肽DC第38位氨基酸為賴氨酸(K)，密碼為AAG，而ADC基因第38位為丙氨酸(A)，密碼為GCT。以上兩處改變對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的殺菌活力有明顯提高。
2、抗菌肽DC基因的確認(rèn)合成的抗菌肽DC基因及質(zhì)粒pHIL-S1(市售，如圖1)分別用EcoRI酶消化，用T4DNA連接酶將它們連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pHIL-DC，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5(市售)。含抗菌肽DC基因的大腸桿菌DH5，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取單菌落，搖瓶培養(yǎng)后從菌體中提取質(zhì)粒，用EcoRI酶切后電泳得到約120bp的區(qū)帶。
以pHIL-DC重組質(zhì)粒為模板，用以下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
引物15’ATG AAA TGG AAG TTG TTA 3’引物25’TTA GTT CTT AGC CAA CGC 3’用2％瓊脂糖凝膠電得到抗菌肽DC的DNA區(qū)帶，測序結(jié)果與設(shè)計(jì)的編碼區(qū)120bp一致。
3、重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建以pHIL-DC質(zhì)粒為摸板，以引物1及2作PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物回收后用EcoRI酶切，在低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收抗菌肽DC片段，用T4DNA連接酶與pPICZα-A質(zhì)粒(市售，見圖2)連接，連接前用小牛小腸堿性磷酸酶處理防止環(huán)化。連接后構(gòu)建成穿梭重組質(zhì)粒pPICZα-A-DC，見圖3。
4、篩選轉(zhuǎn)化子將pPICZα-A-DC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌Top10(市售)的感受態(tài)細(xì)胞，在含Zeocin(100μm/ml)的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑選轉(zhuǎn)化子。
5、獲得工程菌株含抗菌肽DC基因的大腸桿菌Top10中提取質(zhì)粒pPICZ-A-DC，用氯化鋰法轉(zhuǎn)化于季也蒙念珠菌中，在含Zeocin(100μm/ml)的YE培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30℃，48小時(shí)，挑取單菌落。搖瓶培養(yǎng)后檢測各個(gè)菌落的殺菌效價(jià)，篩選工程菌株。
6、Southern印跡雜交用地高辛試劑盒(市售)標(biāo)記抗菌肽DC基因作探針，將工程菌的DNA經(jīng)EcoRI酶切后進(jìn)行Southern印跡雜交。篩選雜交陽性的菌株，作為工程菌保存。
7、季也蒙念珠菌的鑒定季也蒙念珠菌兩株CAD-1及CAD-2，季也蒙念珠菌(Candidaguilliermondii)屬隱球酵母目，隱球酵母科，假絲酵母屬。據(jù)1998年《真菌鑒定》手冊(cè)共收入163個(gè)種。多分布在野生環(huán)境中，可以在食物中分離，又能寄生在動(dòng)物及人體內(nèi)，成為正常菌群的成員。該屬中亦有某些致病菌如白色念珠菌(Candida albicans)。
7.1形態(tài)特征菌落乳白色，圓形，凸起，濕潤，呈乳酪狀。菌體卵圓形2.5×4-6μm。在產(chǎn)子囊的培養(yǎng)基中形成子囊，多數(shù)子囊中有1個(gè)子囊孢子。液體培養(yǎng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生白色沉淀。
7.2發(fā)酵試驗(yàn)除葡萄糖外，麥芽糖、蔗糖、半乳糖、蕈糖、棉籽糖、蜜二糖及可溶性淀粉均不可能發(fā)酵。對(duì)硝酸鹽不能同化。能利用1％甲醇作為碳源生長。
7.3 API 20C AUX鑒定系統(tǒng)鑒別，季也蒙念珠菌的紙條鑒定結(jié)果如下所示葡萄糖 +肌醇 -甘油 +山梨醇+α-酮-D葡萄糖酸鹽+ α-甲基-D葡萄糖甙 -阿拉伯糖 +N-乙酰-D葡萄糖胺 +D-木糖 +纖維二糖 +阿東糖 +乳糖 -木糖 -麥芽糖+
半乳糖 +蔗糖 +棉籽糖 +松三糖+以上生化反應(yīng)參照AUX試劑盒的電腦資料及《真菌鑒定手冊(cè)》和《真菌特征與鑒定手冊(cè)》，該菌鑒定為季也蒙念珠菌。
8、抗菌肽的抑菌譜8.1抗菌肽DC的抑菌譜將抗菌肽DC調(diào)配成5000單位/ml的供試樣本。用下列病菌于LB培養(yǎng)基中制成平板，打孔器打孔，5mm直徑。每孔注入抗菌肽10μl，相當(dāng)50單位。每種病菌重復(fù)5次。30℃培養(yǎng)24小時(shí)，測量抑菌圈直徑，結(jié)果見下表1。
表1抗菌肽DC的抑菌譜

8.2抗菌肽有效殺菌濃度(MIC)天然抗菌肽與重組抗菌肽DC的有效殺菌濃度與常用藥物桿菌肽鋅(Bactracin Zn)及恩諾沙星對(duì)比并設(shè)陰性對(duì)照。各試驗(yàn)取無菌試管3支標(biāo)明藥物濃度及作用時(shí)間。分別吸入所需藥物5ml，在22℃水浴中5分鐘，分別吸入供試細(xì)菌懸濁液0.1ml，迅速搖勻。在指定時(shí)間后分別吸取0.5ml菌液，注入4.5ml滅菌培養(yǎng)基中，在手掌中振蕩80次，吸取0.1ml注入10ml預(yù)融的培養(yǎng)基中，注入7.5cm直徑培養(yǎng)皿中制成平板。每個(gè)試管制備3個(gè)重復(fù)。30℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)算各平板上的菌落數(shù)(cfu)，取平均值，結(jié)果列于表2。
抗菌肽及重組抗菌肽DC對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌及金黃葡萄球菌等革蘭氏陽性菌均有明顯抑菌效果。有效抑菌濃度為0.05μg/ml-0.01μg/ml，2分鐘。常用殺菌劑桿菌肽鋅及恩諾沙星為0.1-0.05μg/ml，3-4分鐘。說明抗菌肽的MIC較常用殺菌劑為優(yōu)。
表2抗菌肽DC的有效抑菌濃度及作用時(shí)間 表中數(shù)字為菌落數(shù)(cfu) 天然抗菌肽0.01、0.05、0.1μg/ml；重組抗菌肽0.01、0.05、0.1μg/ml；桿菌肽鋅0.01、0.05、0.1μ g/ml；恩諾沙星0.01、0.05、0.1μg/ml；*三個(gè)重復(fù)的菌落
8.3抗菌肽與常用抗生素青霉素對(duì)比重組抗菌肽DC，用無菌水稀釋為250單位/ml，青霉素稀釋為4000單位/ml。在無菌試管中加入LB培養(yǎng)基(預(yù)濃縮1倍)2ml，按2倍梯度稀釋，使抗菌肽各管梯度濃度為125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90、1.85、0.92及0.41單位/ml；青霉素為2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81及3.90單位/ml。各試管分別注入100μl待檢病菌，在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。用波長570nm測定各試管的OD值。同時(shí)以陰性作對(duì)照。測定最低抑菌濃度。見表3。
表3抗菌肽DC與青霉素最低抑菌濃度對(duì)比

8.4抗菌肽DC與常用抗真菌劑對(duì)比。
抗菌肽DC對(duì)真菌菌絲及孢子有一定抑制作用。與常用抗真菌劑對(duì)比。主要抗真菌劑是甲硝唑(Metronidazole)，克霉唑(Clotrimazole)，制霉素(Nystatin)及痢特靈(Furagolidon)等。用紙片法將5000單位/ml抗菌肽進(jìn)行梯度稀釋。其它藥物均按二倍法稀釋，以檢定其最低抑菌濃度。結(jié)果見表4。
結(jié)果表明，抗菌肽DC對(duì)以上真菌的抑制效果有較大的優(yōu)越性。由于制霉素等不易溶于水可能限制其作用。
表4抗菌肽DC與常用抗真菌劑有效濃度對(duì)比

*抗菌肽濃度 單位/ml9、抗菌肽DC基因轉(zhuǎn)化季也蒙念珠菌的殺菌活性測定方法轉(zhuǎn)抗菌肽基因季也蒙念珠菌發(fā)酵液，用100℃水浴處理20分鐘，離心5000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，取上清液作殺菌效價(jià)試驗(yàn).在固體LB培養(yǎng)基中預(yù)先接入大腸桿菌K12D31，加熱融化后(50℃)吸取6.5ml注入直徑7.5cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，放冷制成平板。用2.7mm直徑打孔器打孔，每孔注入5μl發(fā)酵液，對(duì)照孔加入無菌水，陽性對(duì)照孔注入100單位/ml的青霉素。每處理重復(fù)3次。倒置培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)過程。培養(yǎng)皿上出現(xiàn)不同大小的抑菌圈，用卡尺測定各抑菌圈的直徑(mm)，取平均值。按以下公式計(jì)算其殺菌效價(jià)。

抗菌肽殺菌效價(jià)(單位/ml)＝2X×1000
舉例抗菌肽孔穴平均抑菌圈直徑為8mm，按公式計(jì)算如下X=8-2.72.1=2.52]]>殺菌效價(jià)(單位/ml)＝22.52×1000＝log(2.52×0.31)×1000＝5.735×1000＝5735單位/ml固體抗菌肽樣本，先用無菌水稀釋一定倍數(shù)后，按以上方法進(jìn)行，再乘以稀釋倍數(shù)即可。
10、抗菌肽作為殺菌消毒劑原料的應(yīng)用10.1抗菌肽鼻咽噴霧劑將發(fā)酵液分離、純化的制劑，用無菌水配成10000單位/ml的原液，用作鼻咽噴霧劑的原料，按以下配方調(diào)制抗菌肽制劑(10000單位/ml)100薄荷油乳化劑300合計(jì)400薄荷油乳化劑的配方薄荷油 2吐溫20 2無菌水 96合計(jì)100
以上抗菌肽薄荷油制劑作為鼻咽呼吸道噴霧劑，可預(yù)防感冒及呼吸道疾病。
10.2抗菌肽陰道栓或凝膠抗菌肽制劑(10000單位/ml)100石臘油 20凝固劑及乳化劑 80合計(jì)200以上栓劑可用小型塑料管送入陰道內(nèi)，待軟化而生效。如凝膠劑可用小型塑料管擠入陰道中使用。
本發(fā)明的有益效果1.抗菌肽DC是一個(gè)經(jīng)過修飾改進(jìn)的基因。由于天然抗菌肽具有多個(gè)成員A、B、D等混合物。而抗菌肽DC是單一的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)上跟AD、ADC等不同。對(duì)氨基酸殘基的改變使其具有較高的殺菌效價(jià)，特別對(duì)多種病原真菌有較好的抑菌作用，如白色念珠菌及原生動(dòng)物陰道毛滴蟲等。
2.抗菌肽DC基因轉(zhuǎn)化季也蒙念珠菌中表達(dá)。合成抗菌肽DC基因與pPICZ-A重組，獲得穿梭質(zhì)粒pDC，可以在大腸桿菌Top10與季也蒙念珠菌中穿梭的特性。pPICZ-α-A質(zhì)粒具有α-因子(α-factor)作為抗菌肽DC基因表達(dá)的啟動(dòng)子，又能將合成的抗菌肽分泌到細(xì)胞外，有利于純化。該質(zhì)粒具有myc末端終止子(c-myc-His)，即含有組氨酸合成酶，能在缺組氨酸的合成培養(yǎng)基中生長，可用作報(bào)告基因；該質(zhì)粒含有Zeocin抗性基因，轉(zhuǎn)化于季也蒙念珠菌后轉(zhuǎn)化子可以在含Zeocin(100μg/ml)的YE培養(yǎng)生長，作為篩選轉(zhuǎn)化子的報(bào)告基因。
3.季也蒙念珠菌作為受體菌，是本發(fā)明分離純化的菌種。經(jīng)有關(guān)單位鑒定不同于畢赤酵母(Pichia pastoris)。它主要特點(diǎn)是能產(chǎn)生芽管、假菌絲現(xiàn)象等。
4.轉(zhuǎn)抗菌肽DC基因季也蒙念珠菌可以工業(yè)化生產(chǎn)。優(yōu)化培養(yǎng)基配方及改善發(fā)酵條件，采用玉米漿、葡萄糖、牛肉浸膏及磷酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)，降低了成本。
5.抗菌肽DC制品既能抑制革蘭氏陰性菌及陽性病原細(xì)菌，如金黃葡萄球菌、銅綠假單胞菌及大腸桿菌等，且殺菌效價(jià)比常用抗生素青霉素低。對(duì)白色念珠菌及黃曲霉等病原真菌的殺菌效價(jià)亦較常用的抗真菌劑為低?？咕腄C對(duì)陰道毛滴蟲有明顯的殺菌作用。是新型廣譜消毒殺菌劑的生物制劑的原料。可以代替抗生素及合成的消毒殺菌劑且更具安全性。


圖1為質(zhì)粒pHIL-S1圖譜；圖2為質(zhì)粒pPICZα-A圖譜；圖3為重組質(zhì)粒pPICZα-A-DC的構(gòu)建圖。
其中，圖1中，pHIL-S1質(zhì)粒8260bp，購自美國Invitrogen公司；5’AOX1啟動(dòng)子，1-941bp；5’AOX1引物856-870bp；多克隆位點(diǎn)(Multiple Cloning Site)1006-1026bp；His40RF(組氨酸酶閱讀框架)4286-1753bp；氨芐青霉素抗性基因(Amplicillin)6651-7106bp；Bgl11、XhoI、EcoRI、Smal、BamHI均為內(nèi)切酶切口。
圖2中，質(zhì)粒pPICZα-A，3595bp，購自美國Invitrogen公司；5’AOX1醇合成酶1-940bp；α因子(α-factor)序列941-1207bp；α因子引導(dǎo)肽序列1144-1164bp；多克隆位點(diǎn)1208-1274bp；Myc末端終止子1275-1307bp；組氨酸合成酶(polyhistidine)1320-1340bp；Bgl11、EcoRI、Not1等為內(nèi)切酶切口。
圖3中，黑線代表抗菌肽DC基因；Primer1、Primer2代表引物1、引物2；PCRDNA限制性內(nèi)切酶鏈反應(yīng)；E、E為EcoRI DNA限制性內(nèi)切酶切口；CIAP小牛小腸堿性磷酸酶，防止環(huán)化；T4DNA連接酶將抗菌肽DC基因與質(zhì)粒pPICα-A連接，構(gòu)成pDC重組質(zhì)粒；5’AOXI醇合成酶基因，作為啟動(dòng)子；ZeocinR為抗生素Zeocin抗性基因；MCS多種內(nèi)切酶的切口。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11.抗菌肽DC基因的設(shè)計(jì)合成根據(jù)天然抗菌肽殺菌活性的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)、合成抗菌肽DC基因。該基因的特點(diǎn)具有兩個(gè)α-螺旋，在第1位列23位氨基酸構(gòu)成第一個(gè)親水性螺旋，第27~39位氨基酸構(gòu)成第第二個(gè)疏水性螺旋。在兩個(gè)α-螺旋之間，有A-G-P(丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸)連接，形成β-折疊。在C-端第39個(gè)氨基酸殘基是天門冬酰胺(N)，與天然抗菌肽末端的賴氨酰胺相似。
本發(fā)明是將設(shè)計(jì)的抗菌肽DC基因用DNA合成儀一次合成主鏈及付鏈，經(jīng)過退火而互補(bǔ)成144bp的抗菌肽DC基因，其中編碼抗菌肽DC的120bp，經(jīng)測序完全與設(shè)計(jì)一致。
2.抗菌肽DC表達(dá)載體的構(gòu)建。
以市售的pHZL-S1及pPICZα-A兩個(gè)質(zhì)粒與抗菌肽DC基因重組，構(gòu)建表達(dá)載體。
首先抗菌肽DC基因及pHIL-S1質(zhì)粒分別用EcoRI酶切，用T4DNA連接酶連接成pHIL-DC重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5，在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基因挑選轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子DNA，用EcoRI酶切后電得到144bp的區(qū)帶。pHIL-DC質(zhì)粒與pPICZα-A質(zhì)粒分別用EcoRI酶切后，用T4DNA連接酶連接成pPICZα-DC(pDC)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌Top10，在含Zeocin(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基上挑選轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落，提取重組質(zhì)粒線性化后作為轉(zhuǎn)化之用。
3.轉(zhuǎn)化于季也蒙念珠菌將季也蒙念珠菌在YE培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長期。將重組質(zhì)粒pPICZα-DA用鋰鹽法或電激法轉(zhuǎn)化于季也蒙念珠菌中。在含Zeocin(100μg/ml)的YE培養(yǎng)基平板中，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，挑取菌落，單獨(dú)作液體搖瓶培養(yǎng)，加入甲醇誘導(dǎo)后，培養(yǎng)48小時(shí)，取發(fā)酵液上清液作抑菌試驗(yàn)。篩選殺菌效價(jià)高的菌株，作為工程菌株保存。
4.轉(zhuǎn)抗菌肽DC基因季也蒙念珠菌的發(fā)酵生產(chǎn)用的培養(yǎng)基配方按質(zhì)量百分比計(jì)算，葡萄糖2％，玉米漿4％，牛肉浸膏2％，KH2PO40.3％，余量為無菌水。發(fā)酵條件30～32℃，pH6.5～7.0，拌攪速度300轉(zhuǎn)/分，供氣量1∶0.6～0.7，培養(yǎng)60～72小時(shí)，產(chǎn)生抗菌肽的效價(jià)為10000單位/ml。發(fā)酵完成后，用瞬時(shí)高溫(120℃10秒)滅菌，過濾除菌即為發(fā)酵的抗菌肽DC。
5.抗菌肽DC的純化發(fā)酵液(10000單位/ml)，在100℃水浴中加熱20分鐘，以除去大多數(shù)的雜質(zhì)，過濾或用離心機(jī)5000轉(zhuǎn)/分，除去菌體。上清液進(jìn)行離子交換樹脂層析。預(yù)先用乙酸銨緩沖液飽和的羧甲基瓊脂糖(CM-Sepharose FF)的層析柱，注入一定體積的抗菌肽DC。經(jīng)離子交換后，抗菌肽吸附于樹脂上，用pH5.2的乙酸銨緩沖液0.1～1.0mol/l作梯度洗脫，分部收集洗脫液，在0.3～0.4mol/l的洗脫液中，含有抗菌活性。收集抗菌活性的組分，用分子量5000Da的超濾膜超濾脫鹽，脫鹽后的抗菌肽在600mmHg 70-75℃真空濃縮，大約除去90％的水份等。濃縮后的抗菌肽DC在噴霧干燥設(shè)備中干燥，進(jìn)氣溫度130～134℃，排氣溫度60～63℃?？咕腄C呈微粉狀黃褐色集中在設(shè)備的貯存箱中，收集噴霧干燥的抗菌肽DC粉末，通過100篩目，密封保存。殺菌效價(jià)10萬單位/g。作為消毒殺菌劑的原料。
實(shí)施例2抗菌肽DC應(yīng)用效果1.抗菌肽治療耐藥性銅綠假單胞菌對(duì)上呼吸道感染的效果醫(yī)院收治5名上呼吸道感染病員，主訴咽喉炎、咳嗽、無發(fā)熱。從咽楷子及咳嗽痰液中培養(yǎng)分離到銅綠假單胞菌，革蘭氏陰性。
對(duì)分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行抗生素耐藥性試驗(yàn)。其中3名病員分離的病菌對(duì)下列抗生素的呈耐藥反應(yīng)，結(jié)果如下表5
表5耐藥性銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素的抗藥性試驗(yàn)

決定使用抗菌肽制劑2500單位/ml作噴霧治療。用SY-II型噴霧器，溫度60℃，將抗菌肽液作口腔噴霧治療，每次約100ml，一日三次。經(jīng)5日連續(xù)使用並輔以頭孢霉素靜脈注射2.5g/日。其余2例只用頭孢霉素靜注4g/日，生理鹽水噴霧作對(duì)比。
結(jié)果一個(gè)療程5天住院觀察。應(yīng)用抗菌肽噴霧治療的病員在第3天已好轉(zhuǎn)，咽楷子檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)銅綠假單孢菌，第5天基本痊愈。為此將其余2例改用抗菌肽噴霧治療亦得到痊愈。
應(yīng)用抗菌肽噴霧治療耐藥性銅綠假單孢菌感染上呼吸道有較好療效。
2.抗菌肽治療陰道炎及陰道毛滴蟲的效果某婦幼醫(yī)院門診治療婦女陰道炎及陰道毛滴蟲感染。主訴外陰騷癢、白帶增多、有時(shí)疼痛，有尿頻、尿急等癥狀。檢查陰道分泌物呈膿性或有異味，陰道壁充血。直接檢驗(yàn)用陰道窺器檢查取出中上部乳樣白帶，涂片，染色(賴氏染料)可見到短桿狀或卵形的病菌及活動(dòng)的陰道毛滴蟲。為進(jìn)一步確證，用30％氫氧化鈉滴于標(biāo)本上，處理15分鐘，仍可見到白色念珠菌的分生芽胞及短菌絲，即可確診。
門診病員隨機(jī)分組，分別用不同的藥物治療，5～7天一個(gè)療程，復(fù)診檢驗(yàn)其效果。結(jié)果見表6。
表6陰道炎與陰道毛滴蟲的治療效果

應(yīng)用抗菌肽栓制(5000單位)對(duì)陰道炎及陰道毛滴蟲均有較好的療效。
實(shí)施例3抗菌肽的安全性評(píng)價(jià)抗菌肽DC發(fā)酵液通過離子交換純化的制劑殺菌活性為5.0萬單位/g。分別進(jìn)行急性、長期毒性試驗(yàn)及“三致”檢驗(yàn)，以確認(rèn)其安全性。
1.急性毒性試驗(yàn)試驗(yàn)動(dòng)物昆蟲種小白鼠50頭，按不同抗菌肽劑量經(jīng)口給藥，調(diào)查一周內(nèi)的中毒情況結(jié)果見表7。
表7抗菌肽對(duì)小鼠口服急性毒性試驗(yàn)(7天)

試驗(yàn)表明抗菌肽口服期對(duì)動(dòng)物均無中毒現(xiàn)象，不能檢測出致死中量(LD50)。最大耐受量為5g/kg水平。
2.抗菌肽長期毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大白鼠60只，隨機(jī)分成4組，口服抗菌肽經(jīng)40周觀察，停食后24小時(shí)調(diào)查血液、尿液及肝腎功能等多項(xiàng)指標(biāo)。觀察動(dòng)物一般狀態(tài)，在給藥期間不同組別的動(dòng)物活動(dòng)正常，毛色光澤、飲食良好；體重調(diào)查試驗(yàn)區(qū)動(dòng)物體重均有不同程度的增加。
試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)前后血液常規(guī)檢驗(yàn)、腎及肝功能測定分別列于表8～表10。
表8抗菌肽對(duì)大白鼠血液常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果(40周)


實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)病理解剖及病理組織學(xué)檢驗(yàn)，包括肉眼檢驗(yàn)及心腎睪丸或卵巢等病理切片檢驗(yàn)均未出現(xiàn)病理性改變。
以上說明抗菌肽經(jīng)大白鼠口服長期(40周)毒性試驗(yàn)無任何毒副作用，同時(shí)對(duì)生長、體重等起到營養(yǎng)促進(jìn)作用。
表9抗菌肽對(duì)大白鼠外圍血白細(xì)胞分類及尿常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果(40周)

試驗(yàn)組與對(duì)照組P＞0.05表10抗菌肽對(duì)大白鼠肝功能檢驗(yàn)結(jié)果(40周)


試驗(yàn)組與對(duì)照組P＞0.053.抗菌肽“三致”試驗(yàn)3.1顯性致死試驗(yàn)將昆明種雄性小鼠50只隨機(jī)分成5組。分別按2.5、1.25、0.625g/kg劑量灌胃，對(duì)照組給予生理鹽水，陽性組以環(huán)磷酸胺30mg/kg腹腔注射。連續(xù)處理5天后與未處理雌性小鼠按1∶2同籠飼養(yǎng)，隨機(jī)交配。每批同籠5天后，休息2天，共同籠6批次。雌鼠同籠后第18天剖腹取出子宮，記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)，計(jì)算著床率、平均死胎率及早死胎鼠比率等。資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較P＜0.05，差異顯著；各試驗(yàn)組與陰性組比較P＞0.05，差異不顯著。說明抗菌肽經(jīng)小鼠口服對(duì)生殖細(xì)胞無突變、無顯性致死作用。
3.2微核涂片試驗(yàn)將昆明種小鼠，雌雄各半，共50只，隨機(jī)分成5組，試驗(yàn)組分別按2.5、1.25、0.625g/kg劑量灌胃，對(duì)照組給予生理鹽水，陽性組以環(huán)磷酸胺30mg/kg腹腔注射。24小時(shí)后取動(dòng)物股骨作材料，用小牛血清沖出骨髓、涂片、染色。觀察1000個(gè)多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核率。結(jié)果各組平均微核率為2.5g/kg組1.6％；1.25g/kg組1.9％；0.625g/kg組1.9％；陰性對(duì)照組1.8％；陽性對(duì)照組25.7％。統(tǒng)計(jì)結(jié)果陽性組及陰性組比較P＜0.05差異顯著，各實(shí)驗(yàn)組與陰性組發(fā)現(xiàn)P＞0.05顯著性差異。說明抗菌肽未引起小白鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核率的增加。見表11。
表11重組抗菌肽對(duì)小鼠脊髓微核試驗(yàn)

3.3 Ames試驗(yàn)試驗(yàn)菌株鼠沙門氏菌組氨酸缺陷型突變株TA97、TA98、TA100、TA102菌株性狀及S9活性物經(jīng)鑒定符合要求。采用平皿摻入法，加S9與不加S9進(jìn)行兩次獨(dú)立試驗(yàn)，設(shè)5000、500、50、5和0.5μg/皿重組抗菌肽，每組做三個(gè)平皿，結(jié)果見表12?；刈兙鋽?shù)未超過自然回變菌落數(shù)2倍，未發(fā)現(xiàn)重組抗菌肽有直接或間接致突變作用。
表12重組抗菌肽平皿摻入法檢測結(jié)果(X±SD)


3.4小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)NIH種小白鼠25只，體重18-25g，隨機(jī)分成5組，連續(xù)灌胃5天，環(huán)磷酸胺腹腔注射，經(jīng)35天后處死動(dòng)物，取雙側(cè)副睪丸，按常規(guī)制片，染色，在油鏡下觀察完整精子5000條，求出精子畸變率，按Wilcoson秩貫和方法檢驗(yàn)結(jié)果，見表13，結(jié)果表示重組抗菌肽各劑量精子畸形率與陰性組對(duì)比，無顯著差異，樣品在測試范圍內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞有誘變畸形的作用。
表13重組抗菌肽對(duì)小鼠精子畸形分析結(jié)果

UN3304~1.TXTSEQUENCE LISTING<110>廣州市華桑生物工程有限公司<120>一種抗菌肽DC及其制備方法與應(yīng)用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>144<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(13)..(129)<400>1gccgccgaat tc atg aaa tgg aag ttg ttc aaa aag att gaa aag gtt ggt 51Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly1 5 10caa aga gtt aga gac gct gtc atc tct gct ggt cct gct gtt gcc act99Gln Arg Val Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Gly Pro Ala Val Ala Thr15 20 25gtt gct caa gct act gcc ttg gct aag aac taagaattcg ggcgg 144Val Ala Gln Ala Thr Ala Leu Ala Lys Asn30 35<210>2<211>39<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Arg Val1 5 10 15Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Gly Pro Ala Val Ala Thr Val Ala Gln20 25 30Ala Thr Ala Leu Ala Lys Asn3權(quán)利要求
1.一種抗菌肽DC，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述抗菌肽DC的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
3.權(quán)利要求1所述的抗菌肽DC的制備方法，其步驟如下(1)設(shè)計(jì)合成抗菌肽DC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；(2)將抗菌肽DC基因與質(zhì)粒pHIL-S1重組，形成重組載體pHIL-DC；(3)將重組載體pHIL-DC與質(zhì)粒pPICZα-A重組，獲得重組載體pPICZα-A-DC；(4)將pPICZα-A-DC轉(zhuǎn)化于宿主菌中，獲得轉(zhuǎn)抗菌肽DC工程菌；(5)用轉(zhuǎn)抗菌肽DC工程菌發(fā)酵產(chǎn)生抗菌肽DC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽DC的制備方法，其特征在于步驟(2)為將抗菌肽DC基因及質(zhì)粒PHIL-S1分別用EcoRI酶消化，用T4DNA連接酶將它們連接，構(gòu)成重組載體PHIL-DC。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽DC的制備方法，其特征在于步驟(3)為將質(zhì)粒PHIL-DC和質(zhì)粒PPICZα-A用EcoRI酶分別酶切，用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建成穿梭重組載體PPICZα-A-DC。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽DC的制備方法，其特征在于步驟(4)為用氯化鋰法將質(zhì)粒PPICZ-A-DC轉(zhuǎn)化于宿主菌中，獲得轉(zhuǎn)抗菌肽DC工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽DC的制備方法，其特征在于步驟(4)所述的宿主菌為季也蒙念珠菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽DC的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的轉(zhuǎn)抗菌肽DC工程菌的培養(yǎng)基為按質(zhì)量百分比計(jì)算，葡萄糖2％，玉米漿4％，牛肉浸膏2％，KH2PO40.3％，余量為無菌水；發(fā)酵的條件是30～32℃，pH6.5～7.0，拌攪速度300轉(zhuǎn)/分，供氣量1∶0.6～0.7，培養(yǎng)60～72小時(shí)。
9.權(quán)利要求1所述抗菌肽DC在制備消毒殺菌劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于抗菌肽DC在制備口腔鼻咽及陰道的消毒殺菌劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌肽DC及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)天然抗菌肽的序列，設(shè)計(jì)、合成抗菌肽DC基因，選擇酵母偏愛的遺傳密碼，用DNA合成儀合成，轉(zhuǎn)化于穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入季也蒙念珠菌中表達(dá)。篩選培養(yǎng)基配方及優(yōu)化發(fā)酵條件，在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)及高效表達(dá)，發(fā)酵液殺菌效價(jià)達(dá)10000單位/ml?？咕腄C能殺滅多種病原微生物，革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌，白色念珠菌等真菌及陰道毛滴蟲等原生動(dòng)物，在制備消毒殺菌劑中有著重要的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1702083SQ20051003274
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日
發(fā)明者黃自然, 陳松彬, 黃永彤 申請(qǐng)人:廣州華桑生物工程有限公司