人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人骨形態(tài)發(fā)生蛋白?2復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。所述復(fù)合材料包括：(a)多孔載體、(b)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP?2和(c)糖皮質(zhì)激素類藥物，并且(b)和(c)負(fù)載于(a)上。本發(fā)明的復(fù)合材料可有效加速骨組織的修復(fù)速度，改善修復(fù)效果。
【專利說(shuō)明】
人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明設(shè)及一種包含多孔載體、BMP-2和糖 皮質(zhì)激素類藥物的復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨組織缺損是骨科臨床面臨的重要難題。我國(guó)每年骨組織缺損患者超過(guò)500萬(wàn)人， 其中因骨質(zhì)疏松引起的脊柱和四肢骨骼等的骨折患者人數(shù)在200萬(wàn)人W上；因骨腫瘤切除、 脊柱融合等需進(jìn)行骨移植手術(shù)的患者約40萬(wàn)例。因此，骨組織缺損與損傷已成為影響人們 健康和生活的一種重要疾病。
[0003] 目前，自體骨移植是臨床治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)。但是該方法會(huì)給患者帶來(lái)較大的 痛苦和手術(shù)并發(fā)癥，而且存在自體骨來(lái)源有限、異體骨存在免疫排斥反應(yīng)等突出問(wèn)題，運(yùn)使 得骨組織修復(fù)材料的研究引起廣泛的關(guān)注。然而，目前應(yīng)用于臨床的骨組織修復(fù)材料或制 品的成骨活性普遍欠佳，尤其是對(duì)于大段骨缺損部位，有的甚至出現(xiàn)延遲愈合或不愈合，不 僅導(dǎo)致醫(yī)療費(fèi)用增加，更增加患者痛苦。
[0004] 綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要研發(fā)出新型的高活性骨修復(fù)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種包含多孔載體、BMP-2和糖皮質(zhì)激素類藥物的復(fù)合材 料及其制備方法和應(yīng)用，所述復(fù)合材料能夠發(fā)揮協(xié)同作用，治療骨缺損，克服現(xiàn)有BMP-2在 臨床使用過(guò)程中存在的高劑量W及由此帶來(lái)的高成本和臨床并發(fā)癥等問(wèn)題。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供一種復(fù)合材料，所述復(fù)合材料包括：
[0007] (a)多孔載體、（b)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2和(C)糖皮質(zhì)激素類藥物，并且(b)和(C) 負(fù)載于(a)上；
[000引其中，所述(b)與（C)負(fù)載量的質(zhì)量比為1: 3-1:15(較佳地為1:5-1:12)，并且所述 (a)多孔載體的孔隙率為50%-90% (較佳地為60%-80% )。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述(b)與(a)的重量之比為0.1-5000yg:lg，較佳地為100-2000 yg:Ig。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述(b)與（a)的重量之比為0. l-5yg: Ig，較佳地為0.5-Uig: Ig。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述(b)與(a)的重量之比為l-30yg:lg，較佳地為5-10yg:lg。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述BMP-2為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述糖皮質(zhì)激素類藥物選自下組:地塞米松、倍他米松、氨化可 的松、可的松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、或其組合，較佳地為地塞米松。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述(a)多孔載體為多孔類骨憐灰石載體。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述(a)多孔載體包含憐酸四巧和憐酸氨二巧。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述(a)多孔載體的孔徑為100-500皿(較佳地為150-450皿，更 佳地為200-400μπι)。
[0017] 本發(fā)明第二方面，提供一種制備如本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材料的方法，包括 步驟：
[0018] (i)提供一種藥物混合物和所述(a)多孔載體，其中，所述藥物混合物包括所述(b) 骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2和所述(C)糖皮質(zhì)激素類；
[0019] (ii)將所述藥物混合物施涂到所述(a)多孔載體上，其中所述(b)和所述(C)的質(zhì) 量比為1:3-1:15(較佳地為1:5-1:12)，形成所述復(fù)合體1;
[0020] (iii)將所述復(fù)合體1在真空條件下凍干處理，制得本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材 料。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（iii)中，所述真空條件的真空度為《10化，較佳地為 《5口日，更佳地為《2口曰。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（iii)中，所述凍干處理的時(shí)間為5-120min(較佳地為 lO-lOOmin，更佳地為20-80min)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：
[0024] 將riiBMP-2和糖皮質(zhì)激素藥物混合，滴加在多孔類骨憐灰石上，放置于真空干燥器 中，保持30min，然后用真空冷凍干燥機(jī)無(wú)菌凍干得到所述復(fù)合材料。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(i)中，所述的多孔載體用包括W下步驟的方法制備：
[0026] (1)將憐酸巧鹽、制孔劑、水混合，得到混合漿料1，其中，所述憐酸巧鹽與制孔劑的 質(zhì)量比為1:0.5-1:2;
[0027] (2)將所述混合漿料1填入模具，在l-5MPa的壓力下(較佳地為1.5-4.5MPa，更佳地 為2-4MPa)保壓，得到支架胚體；
[0028] (3)將所述支架胚體進(jìn)行固化，得到經(jīng)固化的支架胚體；
[0029] (4)對(duì)所述的經(jīng)固化的支架胚體進(jìn)行浸泡處理，從而得到所述多孔載體。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述多孔載體為多孔類骨憐灰石載體。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(1)中，所述制孔劑為NaCl。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(1)中，所述制孔劑的粒徑為100-500μπι(較佳地為300- δΟΟμL?，更佳地為500-600μπι)。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述多孔類骨憐灰石載體為圓柱體。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述多孔類骨憐灰石載體的直徑約4± 1mm，高約3± 1mm。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，所述保壓時(shí)間為O.l-lOmin(較佳地為0.5- 8min，更佳地為l-6min)。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)包括:將所述混合漿料1填入模具，在2±0.5MPa的 壓力下保壓〇.5-5min，得到支架胚體。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(3)包括:將所述支架胚體在37 ±3°C、90-100%濕度的 恒溫恒濕箱中固化1-7天。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(4)包括:將固化的支架胚體用蒸饋水浸泡，直至制孔 劑被溶解，從而形成所述多孔載體。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(4)還包括：：對(duì)所述的多孔載體進(jìn)行干燥處理，從而得 到干燥的多孔類骨憐灰石載體。
[0040] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可w互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1顯示了實(shí)施例1所述的多孔類骨憐灰石載體的理化性能表征：
[0042] A圖為多孔類骨憐灰石照片及尺寸示意；
[0043] B圖為多孔類骨憐灰石支架的邸S元素分析和廣角XRD圖譜；
[0044] C圖為SEM拍攝的支架連通大孔和微孔形貌，W及表面針狀徑基憐灰石晶體形貌。
[0045] 圖2顯示了復(fù)合材料1的(A)掃描電鏡拍攝的表面形貌，（B)rhBMP-2蛋白緩釋曲線， (C)緩釋蛋白結(jié)構(gòu)分析，W及(D)地塞米松緩釋曲線。
[0046] 圖3顯示了實(shí)施例1-5、對(duì)比例1-3所述的復(fù)合材料的體外成骨ALP活性。
[0047] 圖4顯示了實(shí)施例1-5、對(duì)比例2所述的復(fù)合材料的體外礦化沉積。
[004引圖5顯示了實(shí)施例6-8、對(duì)比例4所述的多孔類骨憐灰石固載扣g riiBMP-2W及不同 比例的地塞米松植入小鼠體內(nèi)異位成骨2周和4周后，取出樣品的數(shù)碼照片和濕重、灰重質(zhì) 量數(shù)據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，特定比例的BMP-2與糖皮質(zhì)激 素類藥物負(fù)載于特定的多孔載體上時(shí)，能夠更好地發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)W誘導(dǎo)成骨分化，治療骨 缺損。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[(K)加]術(shù)語(yǔ)說(shuō)明
[0051] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。
[0052] 如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"約"意指該值可W從列舉的 值變動(dòng)不多于1 %。例如，如本文所用，表述"約100"包括99和101和之間的全部值（例如， 99.1、99.2、99.3、99.4等）。
[0053] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"含有"或"包括(包含r可W是開(kāi)放式、半封閉式和封閉式的。換 言之，所述術(shù)語(yǔ)也包括"基本上由…構(gòu)成"、或"由…構(gòu)成"。
[0化4] BMP-2
[0055] 骨組織設(shè)及細(xì)胞外基質(zhì)與信號(hào)分子的識(shí)別、相關(guān)因子的表達(dá)、祀向作用和新骨的 發(fā)育成熟等一系列鏈?zhǔn)竭^(guò)程，其中細(xì)胞生長(zhǎng)因子起著至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-0超 家族的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)被證明具有突出的誘導(dǎo)成骨分化和促進(jìn)成骨的功能，人 重組BMP-2(rhBMP-2)于2002年被美國(guó)FDA和歐洲醫(yī)藥管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)應(yīng)用于脊柱融合、腔骨 骨折和齒科移植，廣泛地用于骨支架的活性化修飾化.Attisano and J丄.Wrana，Science， 2002,296,1646;D.Qien,Μ.Zhao and G.R.Mundy,G;row1:h i^ictors,2004,22,233)。然而，臨 床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，BMP-2的實(shí)際用量大大高于試驗(yàn)中的動(dòng)物使用劑量，不僅提高了手術(shù)成本，而 且提高了因大劑量使用可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
[0056] 類骨憐灰石
[0057] 本發(fā)明所述的類骨憐灰石材料是由憐酸巧鹽等幾種材料復(fù)合而成的，在生理環(huán)境 條件下，講過(guò)常溫水化轉(zhuǎn)化可形成化學(xué)組成和結(jié)晶度均接近自然骨的低結(jié)晶度類骨憐灰 石，具有優(yōu)異的生物活性和生物相容性。
[005引復(fù)合材料
[0059] 本發(fā)明的復(fù)合材料，包括：
[0060] (a)多孔載體、（b)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2和(C)糖皮質(zhì)激素類藥物，并且(b)和(C) 負(fù)載于(a)上；
[0061 ]其中，所述(b)與（C)負(fù)載量的質(zhì)量比為1: 3-1:15(較佳地為1:5-1:12)，并且所述 (a)多孔載體的孔隙率為50%-90% (較佳地為60%-80% )。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述(b)與(a)的重量之比為0.1-5000yg:lg，較佳地為100-2000 yg:Ig。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述(b)與(a)的重量之比為0.1 -化g: 1 g，較佳地為0.5-化g: 1 g。
[0064] 在另一優(yōu)選例中，所述(b)與(a)的重量之比為1 -30yg: 1 g，較佳地為5-1 Oyg: 1 g。
[0065] 本發(fā)明中，用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，（b)與(a)的重量之比較佳地為0.1-扣g:lg，更佳地為 0.5-lyg: 1 g;而用于動(dòng)物體內(nèi)成骨時(shí)，（b)與（a)的重量之比較佳地為1 -30yg: 1 g，更佳地為 5-10yg:Ig。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述BMP-2為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)。
[0067] 在另一優(yōu)選例中，所述糖皮質(zhì)激素類藥物選自下組:地塞米松、倍他米松、氨化可 的松、可的松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、或其組合，較佳地為地塞米松。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，所述(a)多孔載體為多孔類骨憐灰石載體。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，所述(a)多孔載體包含憐酸四巧和憐酸氨二巧。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述(a)多孔載體的孔徑為100-500μπι(較佳地為150-450μπι，更 佳地為200-400μπι)。
[0071 ]制備方法
[0072] 本發(fā)明提供一種制備如本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材料的方法，包括步驟：
[0073] (i)提供一種藥物混合物和所述(a)多孔載體，其中，所述藥物混合物包括所述(b) 骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2和所述(C)糖皮質(zhì)激素類；
[0074] (ii)將所述藥物混合物施涂到所述(a)多孔載體上，其中所述(b)和所述(C)的質(zhì) 量比為1:3-1:15(較佳地為1:5-1:12)，形成所述復(fù)合體1;
[0075] (iii)將所述復(fù)合體1在真空條件下凍干處理，制得本發(fā)明第一方面所述的復(fù)合材 料。
[0076] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（iii)中，所述真空條件的真空度為《10化，較佳地為 《5口日，更佳地為《2口曰。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（iii)中，所述凍干處理的時(shí)間為5-120min(較佳地為 lO-lOOmin，更佳地為20-80min)。
[0078] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：
[0079] 將riiBMP-2和糖皮質(zhì)激素藥物混合，滴加在多孔類骨憐灰石上，放置于真空干燥器 中，保持30min，然后用真空冷凍干燥機(jī)無(wú)菌凍干得到所述復(fù)合材料。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(i)中，所述的多孔載體用包括W下步驟的方法制備：
[0081] (1)將憐酸巧鹽、制孔劑、水混合，得到混合漿料1，其中，所述憐酸巧鹽與制孔劑的 質(zhì)量比為1:0.5-1:2;
[0082] (2)將所述混合漿料1填入模具，在1-5M化的壓力下(較佳地為1.5-4.5MPa，更佳地 為2-4MPa)保壓，得到支架胚體；
[0083] (3)將所述支架胚體進(jìn)行固化，得到經(jīng)固化的支架胚體；
[0084] (4)對(duì)所述的經(jīng)固化的支架胚體進(jìn)行浸泡處理，從而得到所述多孔載體。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述多孔載體為多孔類骨憐灰石載體。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(1)中，所述制孔劑為NaCl。
[0087] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(1)中，所述制孔劑的粒徑為100-500μπι(較佳地為300- δΟΟμL?，更佳地為500-600μπι)。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，所述多孔類骨憐灰石載體為圓柱體。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，所述多孔類骨憐灰石載體的尺寸為直徑約4±lmm，高約3±lmm。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，所述保壓時(shí)間為O.l-lOmin(較佳地為0.5- 8min，更佳地為l-6min)。
[0091] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(2)包括:將所述混合漿料1填入模具，在2±0.5MPa的 壓力下保壓〇.5-5min，得到支架胚體。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(3)包括:將所述支架胚體在37 ±3°C、90-100%濕度的 恒溫恒濕箱中固化1-7天。
[0093] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(4)包括:將固化的支架胚體用蒸饋水浸泡，直至制孔 劑被溶解，從而形成所述多孔載體。
[0094] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟(4)還包括：：對(duì)所述的多孔載體進(jìn)行干燥處理，從而得 到干燥的多孔類骨憐灰石載體。
[00M]測(cè)試實(shí)驗(yàn)及方法
[0096] 1、材料表征
[0097] 采用X射線衍射(X畑，Rigaku D/max 2550VB/PC Japan)對(duì)多孔類骨憐灰石載體進(jìn) 行物相分析;采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡鏡(FE-SEM，HitacM S-4800)觀察支架及復(fù)合材 料的大孔結(jié)構(gòu)、表面微孔結(jié)構(gòu)和固載蛋白形貌，并結(jié)合面掃描邸S表征類骨憐灰石支架表面 的元素分布情況。
[0098] 2、材料的藥物緩釋
[0099] 將制備好的復(fù)合材料浸泡于PBS緩沖溶液，置于恒溫振蕩箱在37°C、100rpm頻率恒 溫振蕩，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集蛋白緩釋液后加入新鮮PBS繼續(xù)浸泡降解。用riiBMP-2ELISA試劑 盒測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的rhBMP-2緩釋濃度，用圓二色譜分析緩釋蛋白的結(jié)構(gòu)變化;緩釋液用透析 膜透析后，用液相色譜測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的地塞米松釋放量。
[0100] 3、堿性憐酸酶(ALP)活性測(cè)定
[0101] 堿性憐酸酶(ALP)是廣泛用于體內(nèi)和體外的成骨分化標(biāo)記物，它的表達(dá)水平被用 來(lái)定量地顯示細(xì)胞的成骨分化水平。進(jìn)行ALP活性測(cè)定和體外細(xì)胞礦化實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度 和不同時(shí)間培養(yǎng)的地塞米松對(duì)rhBMP-2的生物活性的影響;采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 分析(Realtime RT-PCR)，研究地塞米松和riiBMP-2對(duì)一些成骨轉(zhuǎn)錄因子和成骨標(biāo)記物的基 因表達(dá)的影響。
[0102] 采用對(duì)硝基苯憐酸鹽(PNPP-化，購(gòu)自上海生工生物有限公司）作為基質(zhì)測(cè)定堿性 憐酸酶活性。即，將復(fù)合材料樣品置于24孔板內(nèi)，X 10^孔的密度在其上接種骨髓間充 質(zhì)干細(xì)胞。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，細(xì)胞用PBS洗兩次，更換新的維持培養(yǎng)基(培養(yǎng)液含2 %小牛 血清），之后隔天更換維持培養(yǎng)基。在4/7/14天培養(yǎng)后，去除維持培養(yǎng)基，在每孔加入50化 1 %乙基苯基聚乙二醇溶液(NP-40)，化后獲得細(xì)胞裂解液。
[0103] 0.1 mL P-硝基苯基憐酸鹽溶液（Img/mL，抑=9.0)和0.1M甘氨酸組成的混合液，加 入ImM MgCl2.6H2〇,并在37°C解育15min。然后加入O.lmL的0.1M NaOH，用酶標(biāo)儀 (SPECTRAmax 384,美國(guó)分子器件公司）來(lái)定量堿性憐酸酶的吸收，測(cè)定結(jié)果在波長(zhǎng)為405nm 處。堿性憐酸酶的活性用405nm時(shí)的吸光度除W時(shí)間和總蛋白值來(lái)表達(dá)。W牛血清白蛋白作 為標(biāo)準(zhǔn)，用BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自中國(guó)江蘇碧云天生物研究技術(shù)所)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
[0104] 4、細(xì)胞礦化
[0105] 為了確定成骨礦化結(jié)節(jié)的形成，使用Von Kossa染色技術(shù)將一個(gè)細(xì)胞外基質(zhì)礦化 染色。即將復(fù)合材料樣品置于24孔板內(nèi)，把骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞W2X10シ孔的密度接種其 上。在培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，細(xì)胞用PBS洗兩次，更換新的維持培養(yǎng)基(培養(yǎng)液含2%小牛 血清），之后隔天更換維持培養(yǎng)基。在7/14天培養(yǎng)后，去除維持培養(yǎng)基，室溫下用PBS沖洗細(xì) 胞，加入冷的1 %戊二醒溶液固定1 Omi η。用冷的1 %茜素紅(購(gòu)自上海Maj or生物公司）（抑= 4.2)作用細(xì)胞lOmin進(jìn)行細(xì)胞染色。然后用PBS沖洗運(yùn)些細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下可獲得彩色 數(shù)字圖像。
[0106] 5、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析(realtime RT-PCR)
[0107] 將復(fù)合材料樣品置于24孔板內(nèi)，W2X10シ孔的密度將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種其 上。在培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)，細(xì)胞用PBS洗兩次，更換新的維持培養(yǎng)基(培養(yǎng)液含2%小牛 血清），之后隔天更換維持培養(yǎng)基。在7/14天培養(yǎng)后，去除維持培養(yǎng)基，采用RT-PCR檢測(cè)其成 骨相關(guān)基因的表達(dá)。
[0108] RT-PCR檢測(cè)步驟如下：
[0109] A.RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄：
[0110] 1)棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗固載有細(xì)胞的支架2次；
[0111] 2)向每孔中加入50化L的RNAisoPlus裂解液充分裂解細(xì)胞15分鐘；
[0112] 3)收集細(xì)胞裂解液并轉(zhuǎn)移至離屯、管中，室溫靜置5分鐘；
[0113] 4)向上述裂解液中加入其1/5體積量的氯仿并充分混合至粉紅色乳狀液體，室溫 靜置5分鐘；
[0114] 5H.2X104rpm、4 °C離屯、15mi η，上述液體分為Ξ層:透明上清液(mRNA)、白色蛋白 層(含有大量DNA)及最下層有機(jī)相；
[0115] 6)小屯、吸取上清液至另一新的離屯、管中；
[0116] 7)加入與上述上清液等體積的異丙醇，快速上下顛倒使其均勻混合，室溫靜置10 分鐘；
[0117] 8) 1.2 X 104rpm、4 °C離屯、15分鐘，小屯、棄去上清，試管底部即為mRNA沉淀。加入 75%乙醇清洗mRNA，1.0X 104rpm 4°C離屯、5分鐘后小屯、棄去上清；
[011引 9)最后加入ΙΟμΙ DEPC水溶解mRNA;
[0119] 10)配制10化擴(kuò)增反應(yīng)體系：6.5化1111?熱，0.5化011旨〇扣？'11116'(504]\0，化1 SxPrimeScrip飯Buffer和0.5化逆轉(zhuǎn)錄酶PHmeScHp魄RT Enzyme Mixl;
[0120] 11)用Biometra基因擴(kuò)增儀逆轉(zhuǎn)錄，其條件為：37°C/15min，85°C/5s;
[0121] 12)逆轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，樣品置于-20°C保存。
[0122] B.Realtime PCR檢測(cè)：
[0123] l)10l·^LSYBRPremixExTaq?，o.4化50μM上下游引物，l化cDNA模板，8.2化 DEPC水分別加入到孔板中。引物序列如表1所示，GAPDH為內(nèi)參；
[0124] 2)采用Bio-Rad公司實(shí)時(shí)定量PCR儀(CFX96)進(jìn)行巧光定量檢測(cè)，具體循環(huán)溫度如 下:升溫至 95 °C/30s 一 95 °C/5s，60 °C/30s (40 次循環(huán))一最后升溫至 95 °C( 0.5 °C/5s)。
[0125] C.數(shù)據(jù)處理
[0126] W空白對(duì)照組的第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的巧光強(qiáng)度為1，得到的巧光強(qiáng)度數(shù)據(jù)W倍數(shù)形式 表不。
[0127] 表1Realtime RT-PCR所用的正向引物和反向引物 [012 引
[0129] 6、小鼠異位成骨實(shí)驗(yàn)
[0130] W小鼠的肌袋植入模型作為異位成骨模型，研究本發(fā)明的復(fù)合材料的體內(nèi)促成骨 效果，并證明rhBMP-2與地塞米松的協(xié)同效應(yīng)及其與類骨憐灰石載體相結(jié)合的應(yīng)用前景。
[0131] 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在無(wú)菌環(huán)境下操作，所用的實(shí)驗(yàn)器具均滅菌處理。將巧7小鼠（23g)按體 重的3%進(jìn)行戊己比妥鋼腹腔注射麻醉。將小鼠的右后腿外側(cè)剌毛、消毒處理，切開(kāi)約10mm 的縱向切口，分離肌袋內(nèi)軟組織，植入樣品，手術(shù)線縫合肌膜和皮膚。無(wú)菌環(huán)境中正常標(biāo)準(zhǔn) 飼養(yǎng)。
[0132] 在手術(shù)2周和4周后分別處死每組6只小鼠，取出誘導(dǎo)成骨組織。3個(gè)帶周圍軟組織 樣品置于4%的福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)的組織切片檢測(cè)。其余3個(gè)樣品去除周圍軟 組織后稱濕重，然后放入馬弗爐中60(TC般燒化，取出并稱取灰分重量。
[0133] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0134] (1)本發(fā)明特定比例的BMP-2與糖皮質(zhì)激素類藥物負(fù)載于特定的多孔載體上時(shí)，能 夠更好地發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)W誘導(dǎo)成骨分化；
[0135] (2)與單純的多孔憐酸巧鹽相比，本發(fā)明的復(fù)合材料通過(guò)負(fù)載重組人骨形態(tài)發(fā)生 蛋白-2提高骨誘導(dǎo)性，同時(shí)，通過(guò)糖皮質(zhì)激素類藥物的協(xié)同作用，降低重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋 白-2的使用劑量、提高了材料的骨修復(fù)能力和新骨生長(zhǎng)能力，從而更好地實(shí)現(xiàn)骨組織完全 再生/修復(fù)。
[0136] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量 份數(shù)。
[0137] W下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。
[0138] 實(shí)施例1多孔類骨憐灰石的制備
[0139] 將由等摩爾比的憐酸四巧（Tetracalcium曲osphate，TTCP)和無(wú)水憐酸氨二巧 (Dicalcium Phosphate Anhy化ate,DCPA)組成的復(fù)合憐酸巧鹽粉末Ig、化C1顆粒(粒徑約 500μπι) Ig、飽和化C1溶液0.3g混合得到均勻漿料，將漿料填入直徑4mm、高3mm的圓柱狀的模 具并維持2MPa的壓力Imin，得到相應(yīng)尺寸和形狀的支架胚體。
[0140] 將所述支架胚體在37°C、100%濕度的恒溫恒濕箱中固化3天，用蒸饋水浸泡將 NaCl完全溶解后，100°C下烘干12h得到多孔類骨憐灰石載體。
[0141] 如圖1所示，多孔類骨憐灰石載體為直徑約4mm、高約3mm的圓柱狀（圖1A)，成分主 要是徑基憐灰石（圖1B)。
[0142] 如圖1C所示，通過(guò)鹽析法，多孔類骨憐灰石載體具有連通的大孔結(jié)構(gòu)，保證了細(xì)胞 組織的長(zhǎng)入和材料的快速降解，還具有固化過(guò)程中過(guò)量的水形成的微孔，從而提高了支架 的生物活性，同時(shí)為固載rhBMP-2提供了高吸附比表面積。在更高放大倍數(shù)下觀察（圖1C， c3)，可看到多孔類骨憐灰石載體表面有大量針狀徑基憐灰石晶體。
[0143] 實(shí)施例2-復(fù)合材料layg riiBMP-2與化g地塞米松
[0144] 取Ig實(shí)施例1所述的多孔類骨憐灰石載體進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌，在無(wú)菌條件下， 將含化g riiBMP-2和化g地塞米松的溶液滴加在多孔類骨憐灰石載體上，放置于真空干燥器 中，用真空累抽真空并保持30min，使溶液充分吸附入支架的孔隙中。
[0145] 然后將支架從真空干燥器中取出，用真空冷凍干燥機(jī)無(wú)菌凍干得到復(fù)合材料1，復(fù) 合材料1的riiBMP-2固載量為化g，可4°C密封長(zhǎng)期保存。
[0146] 實(shí)施例3-復(fù)合材料2:化g riiBMP-2與化g地塞米松
[0147] 同實(shí)施例2,不同之處在于，地塞米松為化g，復(fù)合材料2的riiBMP-2固載量為化g。
[0148] 實(shí)施例4-復(fù)合材料3:化g riiBMP-2與化g地塞米松
[0149] 同實(shí)施例2,不同之處在于，地塞米松為化g，復(fù)合材料3的riiBMP-2固載量為化g。
[0150] 實(shí)施例5-復(fù)合材料4:化g riiBMP-2/12yg地塞米松
[0151] 同實(shí)施例2，不同之處在于，地塞米松為1化g，riiBMP-2為化g，復(fù)合材料4的riiBMP-2 固載量為化g。
[0152] 實(shí)施例6-復(fù)合材料5:化g riiBMP-2與30yg地塞米松
[0153] 同實(shí)施例2，不同之處在于，地塞米松為30yg，riiBMP-2為扣g，復(fù)合材料5的riiBMP-2 固載量為化g。
[0154] 實(shí)施例7-復(fù)合材料6:化g riiBMP-2與15yg地塞米松
[01巧]同實(shí)施例2，不同之處在于，地塞米松為15yg，riiBMP-2為扣g，復(fù)合材料6的riiBMP-2 固載量為化g。
[0156] 實(shí)施例8-復(fù)合材料7:化g riiBMP-2與45yg地塞米松
[0157] 同實(shí)施例2，不同之處在于，地塞米松為45yg，riiBMP-2為扣g，復(fù)合材料7的riiBMP-2 固載量為化g。
[015引對(duì)比例1-復(fù)合材料Cl:lyg riiBMP-2/lyg地塞米松
[0159] 同實(shí)施例2,不同之處在于，地塞米松為化g，復(fù)合材料C1的riiBMP-2固載量為化g。
[0160] 對(duì)比例2-復(fù)合材料C2:lyg riiBMP-2/多孔類骨憐灰石復(fù)合材料 [0161 ]同實(shí)施例2，不同之處在于，不添加地塞米松。
[0162] 對(duì)比例3-復(fù)合材料C3:6yg地塞米松/多孔類骨憐灰石復(fù)合材料
[0163] 同實(shí)施例2,不同之處在于，不添加 riiBMP-2。
[0164] 對(duì)比例4-復(fù)合材料C4:5yg riiBMP-2/多孔類骨憐灰石復(fù)合材料
[0165] 同實(shí)施例6，不同之處在于，不添加地塞米松。
[0166] 實(shí)施例9復(fù)合材料1的表征和藥物緩釋
[0167] 用掃描電鏡觀察復(fù)合材料1，圖2A中可看到，固載了riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體的大孔表面均勻吸附了大量絮狀蛋白。
[0168] 將復(fù)合材料1浸泡于PBS緩沖溶液，置于恒溫振蕩箱在37°C、100巧m頻率恒溫振蕩， 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集蛋白緩釋液后加入新鮮PBS繼續(xù)浸泡降解。用riiBMP-2ELISA試劑盒測(cè)定 各時(shí)間點(diǎn)的rhBMP-2緩釋濃度，用圓二色譜分析緩釋蛋白的結(jié)構(gòu)變化;緩釋液用透析膜透析 后，用液相色譜測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的地塞米松釋放量。
[0169] 復(fù)合材料1的rhBMP-2緩釋曲線（圖2B)顯示，支架具有典型的雙階段釋放動(dòng)力學(xué)： 初始突釋和后期緩釋。從圓二色譜圖（圖2C)及其結(jié)構(gòu)分析還可看出，多孔類骨憐灰石載體 所采用的W物理吸附為主的固載方式不會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)變化率僅為5.7%左右）。地 塞米松緩釋曲線（圖2D)顯示，地塞米松的釋放速度要高于rhBMP-2。
[0170] 實(shí)施例10固載不同藥物和不同藥物比例的多孔類骨憐灰石的體外成骨ALP活性
[0171] W大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究固載不同藥物或不同藥物比例的多孔類骨 憐灰石載體的體外成骨ALP活性，分別選取W下復(fù)合材料：
[0172] 實(shí)施例1所述的多孔類骨憐灰石載體作為對(duì)照組(bla址control組）；
[0173] 實(shí)施例2所述的復(fù)合材料1:固載化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:6組）；
[0174] 實(shí)施例3所述的復(fù)合材料2:固載化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:3組）；
[0175] 實(shí)施例4所述的復(fù)合材料3:固載化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:9組）；
[0176] 實(shí)施例5所述的復(fù)合材料4:固載12yg地塞米松、lyg rhBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:12組）；
[0177] 對(duì)比例1所述的復(fù)合材料C1:固載化g地塞米松、lyg rhBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:l組）；
[0178] 對(duì)比例2所述的復(fù)合材料C2:固載化griiBMP-2、無(wú)地塞米松的多孔類骨憐灰石載體 (BMP-2組）；
[0179] 對(duì)比例3所述的復(fù)合材料C3:固載化g地塞米松、無(wú) rhBMP-2的多孔類骨憐灰石載體 (Dex組）。
[0180] 如圖3所示，可W看出：
[0181 ] (1)只固載地塞米松的復(fù)合材料成骨性能較差；
[0182] (2)rhBMP-2本身具有一定的成骨誘導(dǎo)性，而當(dāng)riiBMP-2與地塞米松共同作用時(shí)，成 骨誘導(dǎo)性得到大幅度顯著提升。其中，具有較佳成骨誘導(dǎo)效果的rhBMP-2/地塞米松比例為 1:3、1:6、1:9、1:12。
[0183] 實(shí)施例11固載不同藥物和不同藥物比例的多孔類骨憐灰石的體外礦化
[0184] W大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究了固載不同藥物或不同藥物比例的多孔類 骨憐灰石載體的體外礦化，分別選取W下復(fù)合材料：
[01化]實(shí)施例1所述的多孔類骨憐灰石載體作為對(duì)照組(bla址control);
[0186] 實(shí)施例2所述的復(fù)合材料1:固載化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:6組）；
[0187] 實(shí)施例3所述的復(fù)合材料2:固載化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:3組）；
[0188] 實(shí)施例4所述的復(fù)合材料3:固載化g地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:9組）；
[0189] 實(shí)施例5所述的復(fù)合材料4:固載12yg地塞米松、lyg riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載 體(BMP-2/DEX=l:12組）；
[0190] 對(duì)比例2所述的復(fù)合材料C2:固載化griiBMP-2、無(wú)地塞米松的多孔類骨憐灰石載體 (BMP-2組）。
[0191] 如圖4所示，當(dāng)riiBMP-2與地塞米松共同作用時(shí)，其體外礦化沉積水平顯著提升，且 具有較佳礦化沉積量的riiBMP-2/地塞米松比例為1:3、1:6、1:9、1:12。
[0192] 實(shí)施例12固載不同藥物和不同藥物比例的多孔類骨憐灰石的體外成骨基因表達(dá)
[0193] W大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞為細(xì)胞模型，研究了固載不同藥物或不同藥物比例的多孔類 骨憐灰石載體的體外成骨基因表達(dá)，分別選取W下復(fù)合材料：
[0194] 實(shí)施例1所述的多孔類骨憐灰石載體作為對(duì)照組(Bla址Control組）；
[01巧]對(duì)比例2所述的復(fù)合材料C2:固載化griiBMP-2、無(wú)地塞米松的多孔類骨憐灰石載體 (BMP-2組）；
[0196] 對(duì)比例3所述的復(fù)合材料C3:固載化g地塞米松、無(wú) riiBMP-2的多孔類骨憐灰石載體 (Dex組）；
[0197] 實(shí)施例2所述的復(fù)合材料1:固載化g riiBMP-2與化g地塞米松的多孔類骨憐灰石載 體(Dex+BMP-2組）。
[0198] 復(fù)合材料1、C2、C3對(duì)體外成骨基因的表達(dá)結(jié)果如表2所示。
[0199] 由表2可W看出，單純的BMP-2對(duì)BSP、Col I、0CN、0PN和Runx2成骨相關(guān)基因的表達(dá) 具有一定的上調(diào)作用;單純的地塞米松對(duì)Runx2基因作用不明顯。
[0200] 但是，當(dāng)Ξ者(地塞米松+多孔類骨憐灰石載體+BMP-2)共同使用時(shí)，可發(fā)揮協(xié)同作 用，對(duì)BSP、Co 1 I、0CN、0PN和Runx2成骨基因的表達(dá)均具有非常明顯的上調(diào)作用。特別地，對(duì) 于Col I和Runx2基因，與對(duì)照組、BMP-2組和Dex組相比，協(xié)同效果尤其明顯：
[020U 例如，對(duì)于Co 1 I基因，7d后，Dex+BMP-2組基因表達(dá)相較于Dex組提高了 19.6 %，相 較于BMP-2組提高了 58.9 % ;對(duì)于Runx2基因，7d后，Dex+BMP-2組基因表達(dá)相較于Dex組提高 了86.6%。
[0202] 表2復(fù)合材料1、C2、C3對(duì)體外成骨基因的相對(duì)表達(dá)結(jié)果(倍數(shù)）
[0203]
[0204] (注:倍數(shù)數(shù)據(jù)WBla址Control組數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)，采用平均值表示）
[0205] 實(shí)施例13固載扣g riiBMP-2和不同比例地塞米松的多孔類骨憐灰石載體在小鼠體 內(nèi)異位成骨
[0206] 依據(jù)圖3、圖4得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，選取W下復(fù)合材料進(jìn)行動(dòng)物異位成骨測(cè)試：
[0207] (1)實(shí)施例6所述的復(fù)合材料5(rhBMP-2 :DEX = 1:6);
[020引 （2)實(shí)施例7所述的復(fù)合材料6 (riiBMP-2: DEX = 1:3);
[0209] (3)實(shí)施例8所述的復(fù)合材料7 (riiBMP-2: DEX = 1:9);
[0210] (4)對(duì)比例4所述的復(fù)合材料C4作為對(duì)照(riiBMP-2 :DEX = 1:0)。
[0211] 2周時(shí)，上述（1)-(4)組的異位骨樣品大小和異位骨濕重、灰重質(zhì)量結(jié)果如圖5所 示：
[0212] 可見(jiàn)，多孔類骨憐灰石/riiBMP-2/地塞米松復(fù)合材料的成骨活性、成骨量和礦化程 度明顯高于僅固載riiBMP-2的復(fù)合材料，且rhBMP-2與地塞米松的劑量比例為1: 3、1:6、1:9 時(shí)，都具有明顯效果。
[0213] 第4周與第2周相比，異位骨濕重降低，灰重增加，說(shuō)明異位骨組織進(jìn)一步礦化，同 時(shí)發(fā)生骨吸收，各組趨勢(shì)與第2周時(shí)基本一致，多孔類骨憐灰石/riiBMP-2/地塞米松復(fù)合材 料與僅固載rhBMP-2的材料相比，灰重差距更大，再次說(shuō)明本發(fā)明的多孔類骨憐灰石/ riiBMP-2/地塞米松復(fù)合材料促進(jìn)了礦化程度。
[0214] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種復(fù)合材料，其特征在于，所述復(fù)合材料包括： (a)多孔載體、（b)骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2和(c)糖皮質(zhì)激素類藥物，并且(b)和（c)負(fù)載 于(a)上； 其中，所述(b)與（c)負(fù)載量的質(zhì)量比為1:3-1:15,并且所述(a)多孔載體的孔隙率為 50%-90%〇2. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述(b)與（a)的重量之比為0.1-5yg: lg〇3. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述(b)與(a)的重量之比為l-30yg:lg。4. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述糖皮質(zhì)激素類藥物選自下組:地塞 米松、倍他米松、氫化可的松、可的松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、或其組合。5. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述(a)多孔載體為多孔類骨磷灰石載 體。6. 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料，其特征在于，所述(a)多孔載體的孔徑為100-500μπι。7. -種制備如權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料的方法，包括步驟： (i) 提供一種藥物混合物和所述(a)多孔載體，其中，所述藥物混合物包括所述(b)骨形 態(tài)發(fā)生蛋白BMP-2和所述(c)糖皮質(zhì)激素類； (ii) 將所述藥物混合物施涂到所述(a)多孔載體上，其中所述(b)和所述(c)的質(zhì)量比 為1:3-1:15,形成所述復(fù)合體1; (iii) 將所述復(fù)合體1在真空條件下凍干處理，制得權(quán)利要求1所述的復(fù)合材料。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述制孔劑為NaCl。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中，所述制孔劑的粒徑為100-500um〇10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述多孔類骨磷灰石載體的直徑約4±lmm， 高約3± lmm。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK105999417SQ201610392378
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】劉昌勝, 林丹, 柴延軍, 袁媛
【申請(qǐng)人】華東理工大學(xué)