生物改性半夏蛋白的制備方法及其在制備抗肺癌藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法及其新用途，具體涉及生物改性半夏蛋白的制備 方法及其在制備抗肺癌藥品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性支氣管肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，絕大多數(shù)起源于支氣管黏膜 上皮，也有源于纖體或肺泡上皮者。
[0003] 肺癌的分子發(fā)病機制一班認為肺癌由遺傳和環(huán)境及飲食等諸多因素相互作用所 致，其發(fā)病是一個多步驟的過程，涉及基因亞穩(wěn)態(tài)集群運動的狀態(tài)和表達調(diào)控。
[0004] 現(xiàn)在用于肺癌治療的方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、生物治療、中醫(yī)治療 和中西醫(yī)結(jié)合治療。
[0005] 201110053934. 8公開了一種蟾肽抗生素制成的用于治療肺癌的藥品，該發(fā)明采 用蟾蜍蛆蟲為原料，用溶劑萃取、加溫變性除蛋白、色譜柱分離、超聲波液相制備色譜純化 并用真空冷凍干燥制取的蟾肽抗生素為原料，再用適宜賦形劑相結(jié)合制備成各種劑型的藥 品。
[0006] CN103310105A公開了篩選非小細胞肺癌治療療效生物標記物的方法，該發(fā)明采用 五個步驟對療效生物標記物篩選，用于非小細胞肺癌治療前的指導(dǎo)。
[0007] CN103720689A公開了一種TGF- M抑制劑在肺癌治療中的用途，該發(fā)明利用 TGF-M抑制GF-M通道增加肺癌細胞的放射敏感性。
[0008] CN103536925A公開了強心苷化合物在非小細胞肺癌治療中的應(yīng)用，該發(fā)明涉及強 心苷化合物在制備用于治療非小細胞肺癌的藥物中的用途。
[0009] CN102575300A公開了肺癌治療和診斷的靶基因CSTF2,該發(fā)明涉及CSTF2基因在 癌癥發(fā)生中的作用，通過施用針對CSTF2基因的雙鏈分子或含有此類雙鏈分子的組合物、 載體或細胞來治療或預(yù)防癌癥。
[0010] CN103459422A公開了靶向HGF的多特異性抗原結(jié)合蛋白，該發(fā)明涉及HGF拮抗劑 和VEGF拮抗劑的組合，并且提供了結(jié)合HGF的抗原結(jié)合蛋白。
[0011] CN1846784公開了蛞蝓PEJI蛋白及其生產(chǎn)工藝，該發(fā)明涉及從蛞蝓體中提取蛞蝓 PEJg蛋白并制備成膠囊劑、顆粒劑、片劑、水針劑、凍干粉劑。
[0012] CN101878023A公開了靶向肺癌的肽及其應(yīng)用，該發(fā)明提供了核酸、肽和抗體用于 診斷和治療，并用肽與抗癌藥物長春瑞濱或多柔比星的脂質(zhì)體偶合，改進了這些藥物的效 力。
[0013] 中藥半夏為天南星科多年生草本植物，半夏的塊根辛、溫，有毒，入脾、胃經(jīng)，具有 燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)的功效。由于半夏的毒性限制了其用途，千百年來人們研宄 了各種炮制半夏的工藝。
[0014] 201210315547. 1公開了中藥半夏蛋白生物改性工藝，該發(fā)明以中藥半夏等多種原 料，采用特殊工藝過程生成昆蟲體，將植物蛋白改性成動物重組基因蛋白，通過生物改性工 藝既降低了半夏蛋白的毒性，又賦予較好的生物活性功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的目的是提供一種生物改性半夏蛋白的制備方法及其在制備抗肺癌藥品 中的應(yīng)用，本發(fā)明工藝過程中采用適宜的方法提取分離純化生物改性半夏蛋白，并根據(jù)生 物改性半夏蛋白的理化特性、生物特性輔以相應(yīng)的材料制備成不同劑型的藥品。
[0016] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： (1)將1000 g生物改性半夏蟲體在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化 粉碎。
[0017] 本步驟中，所述膨化壓力為0? l~5MPa，時間為10~60min。
[0018] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出生物改性半夏蛋白粗品。
[0019] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H2O組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0020] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時間為10~30min。
[0021] (3)收集含有生物改性半夏蛋白粗品的溶液并且用微孔過濾器過濾去掉雜質(zhì)。
[0022] 本步驟中，所述微孔過濾器的孔徑為0. 5~50Mm。
[0023] (4)用超濾機超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的生物改性半夏蛋白超濾溶液。
[0024] 本步驟中，所述超濾機的孔徑為50~100nm。
[0025] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0026] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0027] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0028] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0029] (7)純化后的生物改性半夏蛋白用真空冷凍干燥機制備成凍干蛋白粉。
[0030] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_30~50°C、時間為18~26h。
[0031] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑，可用于制備抗肺 癌藥品。
[0032] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下：通過本發(fā)明分離純化的生物改性半夏蛋白 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法及葡聚糖凝膠G-75凝膠過濾法測得相對分子量為 11. 2~12. 7KPa;用等電聚焦發(fā)測定其等電點為pH8. 6~9. 5;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不 含糖類和磷酸基團；紫外分光光度法分析在260nm和280nm測定純化的生物改性半夏蛋白 含量為98. 3%;分子結(jié)構(gòu)屬非典型、非單一的昆蟲蛋白質(zhì)，鏈內(nèi)與鏈間不含二硫鍵，其三級 結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元以無規(guī)卷曲為主，a螺旋與0折疊的含量比例基本相當(dāng)。本發(fā)明制備的生 物改性半夏蛋白制劑質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測，劑型多樣， 成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0033] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限如此，凡是對 本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
[0034] 實施例1: (1) 將1000 g生物改性半夏蟲體干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339. X)中，對 膨化裝置內(nèi)充入二氧化碳氣體并加壓至〇. l~5MPa，時間10~60min，然后迅速釋放壓力至常 壓，生物改性半夏蟲體被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的生物改性半夏粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 *H20,加壓至2~10MPa，形成 膨脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時間10~30min，生物改性半夏粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然 后降壓至常壓，生成生物改性半夏蛋白粗品與甲醇-NH 3 ? H2O的混合液； (3) 收集含有生物改性半夏蛋白粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過濾器過濾去處 固體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的生物改性半夏蛋白超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測器波長260~280nm ; (7) 純化后的生物改性半夏蛋白用真空冷凍干燥機在溫度-30~50°C、時間18~26h干燥 制備成凍干蛋白粉。
[0035] 實施例2: (1) 將1000 g生