專利名稱：Iren蛋白,其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼TNF受體相關(guān)因子(TRAF)結(jié)合蛋白的DNA序列。更具體說，本發(fā)明涉及編碼能結(jié)合TRAF2的本文命名為IREN的生物活性蛋白質(zhì)及其同工型的cDNA序列。本發(fā)明還涉及上述DNA編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)和DNA序列在治療或預(yù)防與NF-κB誘導(dǎo)的或TRAF2介導(dǎo)的其他活性、或與所述蛋白結(jié)合的其他分子相關(guān)的疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子(TNF/NGF)受體超家族，代表了哺乳動物細(xì)胞中一個迄今已鑒定的成員超過20個的正在發(fā)展中的家族。雖然該超家族的受體胞外結(jié)構(gòu)域一級序列互不相同，但TNF/NGF受體超家族成員均具有富含半胱氨酸的亞結(jié)構(gòu)域，認(rèn)為這些亞結(jié)構(gòu)域繼承了總體類似的三級折疊(Bazan1993；Beutler和van Huffel，1994；Smith等，1994)。除了P55TNF受體和Fas/APO1這兩個受體外，該受體家族的各個成員可能具有不同的結(jié)構(gòu)差異。然而各受體之間的功能非常相似表明，它們具有共同的信號傳導(dǎo)通路。這種相似性的一個例子是TNF/NGF家族的幾種受體能夠激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(見下)。
TRAF2是命名為TRAF(TNF受體相關(guān)因子)蛋白質(zhì)家族最近描述的一個成員，該家族包括幾種已鑒定的蛋白質(zhì)，如TRAF1，TRAF2(Rothe，M等1994；PCT頒布的申請WO 95/33051)、TRAF3(Cheng，G等，1995)、TRAF4(CART1，富含C的與RING和TRAF結(jié)構(gòu)域相關(guān)的基序，Regnier等，1995)、TRAF5(Ishida等，1996a；Nakano等，1996)和TRAF6(見Cao等，1996a；Ishida等，1996b)。屬于TRAF家族的所有蛋白質(zhì)其C未端結(jié)構(gòu)域均有高度氨基酸相同性，而其N未端結(jié)構(gòu)域不相關(guān)。如TRAF2的示意圖(圖1)所示。該分子在其N未端含有一個環(huán)指基序和二個TFIIIA樣鋅指基序。該分子的C未端一半包含一稱為“TRAF結(jié)構(gòu)域”的區(qū)域，它含有氨基酸264-358之間的一潛在性亮氨酸拉鏈區(qū)(稱為N-TRAF)。另一朝向該分子羧基未端氨基酸359-501之間的結(jié)構(gòu)域(稱為C-TRAF)負(fù)責(zé)TRAF與受體和其它TRAF分子的結(jié)合形成同源-或異源二聚體。
TRAF銜接子蛋白質(zhì)向受體分子胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的募集，可導(dǎo)致由不同TRAF銜接子分子和具有酶功能的效應(yīng)蛋白質(zhì)組成的較大信號傳導(dǎo)復(fù)合體的裝配。許多報道檢驗(yàn)到在對TRAF依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的反應(yīng)中，胞內(nèi)激酶的激活。特別是已證明，有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的激酶，是含TRAF復(fù)合體觸發(fā)的信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵性因素。這些通路看來以C-Jun(N)氨基未端激酶(JNK)的激活而告終(Reinhard等，1997；Song等，1997)。TRAF蛋白能具有是調(diào)節(jié)這些受體觸發(fā)不同信號傳遞通路的能力，導(dǎo)致蛋白激酶的磷酸化和激活，然后導(dǎo)致Rel和AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子的激活。
C-Jun轉(zhuǎn)錄因子在其氨基端被JNK(一種MAPK信號通路最下游成員)磷酸化(Hibi等，1993)。被JNK激活需要被MAPK激酶(MAPKK，SEK，MEK)所磷酸化。該激酶自身被MAPKKK(MEKK1)所磷酶化，MAPKKK可通過被GCKR(生發(fā)中心激酶相關(guān))蛋白磷酸化而激活，GCKR是該通路中最上游激酶(Minden等人，1994；Liu等，1995；Shi和Kehrl，1997)。這些蛋白質(zhì)之一的顯性失活突變(缺乏激酶活性)將阻斷TRAF-介導(dǎo)的由TNF/NGFR超家族成員誘導(dǎo)的JNK激活。因此，看來TRAF蛋白以非常鄰近的步驟調(diào)節(jié)JNK活化通路(Liu等，1996；Lee等，1997；Reinhard等，1997)。TRAF2缺陷小鼠的細(xì)胞在對TNFα反應(yīng)中不能激活JNK(Yeh等，1997)。已證明在T淋巴細(xì)胞激活過程中JNK介導(dǎo)了CD28的共刺激信號整合(Su等，1994)。綜合起來這些結(jié)果提示，在TNFR相關(guān)分子連接后，CD28共刺激和TRAF介導(dǎo)的共刺激采用了相同的遠(yuǎn)端信號組分。
TRAF蛋白看來還在調(diào)節(jié)受體介導(dǎo)的NF-KB激活早期階段起重要作用(Rothe等，1995b；Cao等1996；Nakano等，1996)。NF-κB包括與Rel癌基因同源的、一個形成二聚體的蛋白家族成員，以它們的二聚體形式起轉(zhuǎn)錄因子作用。這些因子普遍存在并參與多個基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。雖然在B細(xì)胞表達(dá)Igκ輕鏈階段已鑒定到B細(xì)胞中有NF-κB，但主要知道它的作用是一種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活劑。最著名的是NF-κB起著基本(primary)因子作用，即其活性受到細(xì)胞中以它們的非活性形式預(yù)先存在分子的活化所誘導(dǎo)，而非其從頭合成(這依賴于開啟NF-κB基因的可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子)。NF-κB的作用是高度多效的。大多數(shù)這些作用具有共同特征，即對胞外刺激應(yīng)答時被快速誘導(dǎo)。絕大多數(shù)NF-κB激活劑是免疫防衛(wèi)的誘導(dǎo)劑，包括病毒和細(xì)菌的成分、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子、UV光等。因此受NF-κB調(diào)節(jié)的許多基因?qū)γ庖叻佬l(wèi)有貢獻(xiàn)(見Blank等，1992；Grilli等，1993；Baeuerle和Henkel，1994，綜述)。
NF-κB調(diào)節(jié)的一個主要特點(diǎn)是，該因子以胞質(zhì)非DNA結(jié)合形成存在，可被誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)位至核中，結(jié)合DNA并激活轉(zhuǎn)錄。NF-κB蛋白質(zhì)的這種雙重(dual)形式受I-κB(含有多個最初在紅細(xì)胞蛋白質(zhì)ankyrin中鑒定到的一種結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族)的調(diào)節(jié)(Gilmore和Morin等，1993)。在未受到刺激形式中，NF-κB二聚體與一個I-κB分子(其占據(jù)它的胞質(zhì)位置，防止它與NF-κB結(jié)合性DNA序列反應(yīng)和激活轉(zhuǎn)錄)結(jié)合。受到其許多誘導(dǎo)劑的作用，I-κB與NF-κB二聚體分離構(gòu)成了其關(guān)鍵性激活步驟(DiDonato等，1995)。對各種NF-κB誘導(dǎo)劑應(yīng)答反應(yīng)而言，迄今對各種NF-κB誘導(dǎo)性因子的應(yīng)答反應(yīng)中決定細(xì)胞特異性的方式了解很少。
TRAF蛋白質(zhì)可影響NF-κB的受體介導(dǎo)的激活證據(jù)是，已證明顯性失活形式的TRAF2可抑制對幾種TNFR相關(guān)分子(包括TNFR11、CD40、CD30、41BB和0×40)的寡聚化反應(yīng)中NF-κB的激活(Rothe等，1994，1995b；Duckett等，1997；Arch和Thompson，1998)。然而小鼠基因消除研究未能提示在這些受體之一激活NF-κB中需要特異性TRAF的作用(Lee等，1997；Yeh等1997)。這提示受體結(jié)合可能通過一條以上的通路激活NF-κB。
NF-κB最強(qiáng)的誘導(dǎo)劑之一是細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子(TNF)。存在兩種不同的TNF受體P55和P75受體，二者的表達(dá)水平在不同細(xì)胞中各不相同(Vandenabeele等，1995)，P75受體優(yōu)選與細(xì)胞結(jié)合形式的TNF起反應(yīng)(TNF表達(dá)為II型跨膜蛋白和可溶性蛋白兩種形式)而P55受體只對可溶性TNF分子起有效反應(yīng)(Grell等，1995)。這兩種受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上不相關(guān)，結(jié)合不同的胞質(zhì)蛋白。然而，兩種受體至少可誘導(dǎo)TNF的部分效應(yīng)，包括TNF的殺細(xì)胞效應(yīng)和NF-κB的誘導(dǎo)，其特征是細(xì)胞特異性的。P55受體能在所有對TNF反應(yīng)顯示這種效應(yīng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)殺細(xì)胞作用或激活NF-κB。P75-R只在某些細(xì)胞中具有此種作用。其他細(xì)胞盡管高水平表達(dá)P75-R，只在對P55-R刺激應(yīng)答中顯示誘導(dǎo)這種作用(Vandenabeele等，1995)。除TNF受體外，TNF/NGF受體家族的其他不同受體CD30(McDonald等，1995)、CD40(Berberich等，1994；Lalmanach-Girard等，1993)、淋巴毒素β受體；在幾種類型的細(xì)胞中Fas/APOl也能誘導(dǎo)NF-κB的激活(Rensing-Ehl等1995)。也能特異地觸發(fā)NF-κB激活的IL-1I型受體盡管結(jié)構(gòu)上與其不相似、但具有TNF受體的大多數(shù)效應(yīng)。最近已克隆了IL-18受體復(fù)合物的新受體亞單位并顯示能在對IL-18的反應(yīng)中引起NF-κB轉(zhuǎn)位和激活(Born等，1998)。IL-1Rrp以及一種IL-1受體家族的新蛋白質(zhì)，命名為AcPL(Accessory Protein Like)，二者皆為IL-18信號傳遞所需要。
觸發(fā)這些不同受體使NF-κB活化是由于誘導(dǎo)了其相關(guān)I-κB分子的磷酸化。最近已鑒定了在對促炎癥性細(xì)胞因子TNF-α或IL-1β的反應(yīng)中激活的特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)的幾種成分，一種稱為NIK的新的蛋白激酶(NF-κB誘導(dǎo)性激酶)是首次被鑒定(見待批的共同擁有的專利申請WO97/37016，Malinin等，1996)。發(fā)現(xiàn)NIK結(jié)合TRAF2并激活NF-κB，NIK序列與MAP3K激酶相似，參與對TNF/NGF家族受體和IL-1型受體共同的NF-κB誘導(dǎo)性信號級聯(lián)反應(yīng)。TNF-α和IL-1β啟動信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致兩種IκB激酶IKK-1[IKK-α]和IKK-2[IKK-β]的激活，在特異性N-末端絲氨酸殘基處磷酸化IκB(對IκBα為S32和S36，對IκBβ為S19和S23(見Mercurio F和Manning AM綜述，1999)。這些激酶被鑒定為稱為IKK信號體(Signalsome)的一種高分子量蛋白復(fù)合體的組成成分。
遍在蛋白能綴合酶級聯(lián)反應(yīng)的最末端成員，E3遍在蛋白連接酶可選擇性地使磷酸化的IκB遍在蛋白化。此信號級聯(lián)的最后一步，仍與胞漿中的NF-κB相結(jié)合的磷酸化和遍在蛋白化的IκB，被26S蛋白酶體選擇性降解。此過程暴露出NLS，因而釋放NF-κB與胞核輸入機(jī)(nuclear import machinery)相互作用并轉(zhuǎn)位到胞核中，結(jié)合其靶基因啟動轉(zhuǎn)錄。
IKK信號體其他幾種成分的鑒定為受體活化可能與IKK激活相連系的那一種可能機(jī)制提供了線索。其中之一是一種稱為NEMO的NF-κB基本調(diào)節(jié)劑，發(fā)現(xiàn)這種鼠蛋白是在對所有測試的NF-κB刺激物無反應(yīng)的HTLV-1 Tax轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞的扁平細(xì)胞變體中激活NF-κB所必須。(Yamaoka等，1998)。顯示NEMO為同源二聚化并直接與IKK2相互反應(yīng)。Kovalenko等(見待批共同擁有的以色列專利申請123758和126024)獨(dú)立克隆了同一蛋白質(zhì)，作為RIP結(jié)合蛋白，命名為RAP-2。隨后其他二個小組獨(dú)立克隆了NEMO，作為IKK信號體的非激酶組分。命名為IKKAP-1(Mercurio F等，1996b，Rothwarf DM等1998)。該同一蛋白質(zhì)還被克隆為E3反應(yīng)性蛋白，它是一種腺病毒蛋白質(zhì)，由早期轉(zhuǎn)錄區(qū)編碼，功能是抑制TNF的溶細(xì)胞作用，顯示能與RIP激酶反應(yīng)(LiY等，1998)。這些研究提供的證據(jù)顯示，NEMO介導(dǎo)了NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基本步驟。三種受體相關(guān)蛋白質(zhì)看來參與了該磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的啟動(見圖2說明)當(dāng)TRAF2高水平表達(dá)時，可通過其自身引起NF-κB激活而結(jié)合于活化的P75TNF-R(Rothe等1994)、淋巴毒素β受體(Mosialos等1995)、CD40(Rothe等1995a)和CD30(未發(fā)表資料)并由它們介導(dǎo)NF-κB的誘生。TRAF2不結(jié)合P55TNF受體，也不結(jié)合Fas/APOl，然而能結(jié)合稱為TRADD的P55受體相關(guān)蛋白質(zhì)，而TRADD能結(jié)合稱為MORT1(或FADD，見Boldin等1995b和1996)的Fas/APOL相關(guān)蛋白質(zhì)。另一稱為RIP的含死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)的絲氨酸/蘇氨酸激酶受體反應(yīng)性蛋白，也能與TRAF2以及FAS/APOl，TRADD，P55TNF受體和MORT-1反應(yīng)。因此，雖然RIP最初是與細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)(細(xì)胞死亡)相連系，但它與TRAF2反應(yīng)的能力也意味著它參與NF-κB激活。
TRAF分子看來參與了導(dǎo)致NF-κ激活的通路。這些相關(guān)物看來使P55TNF受體和FAS/APOL觸發(fā)了NF-κB的激活(Hsu等，1995；Boldin等，1995；Chinnaiyan等，1995；Varfolomeev等，1996；Hsu等，1996)。IL-1受體引起NF-κB激活不依賴于TRAF2，可能涉及TRAF2的同源物-TRAF6和最近克隆的稱為IRAK的IL-1受體相關(guān)蛋白激酶(Croston等，1995)。已證明TRAF6和IRAK在IL-18誘導(dǎo)的信號傳遞和功能中起著重要作用(Kanarakaraj等，1999)。
TRAF分子或含死亡結(jié)構(gòu)域的銜接子蛋白的受體募集啟動的信號傳遞級聯(lián)反應(yīng)，受到能通過修飾多蛋白復(fù)合體組分和/或能阻斷蛋白-蛋白相互反應(yīng)和下游效應(yīng)器功能而干擾特異性步驟的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)。已鑒定到幾種能結(jié)合TRAF的胞質(zhì)分子。其中有A20、c-IAP(凋亡的細(xì)胞抑制劑)、TRIP(TRAF反應(yīng)性蛋白)和I-TRAF/TANK(TRAF反應(yīng)性蛋白，TRAF家族成員相關(guān)的NF-κB激活劑)(Rothe等，1994；Rothe等1995b；Cheng和Baltimore 1996；Lee等1997；Roy等1997)以及其他二種蛋白一種命名為克隆9，與本發(fā)明蛋白質(zhì)有某些序列同源，另一種命名為克隆15(見待批共同擁有的專利申請WO97/37016)。已證明這些蛋白質(zhì)各自能至少結(jié)合TRAF家族成員、某些還能與之反應(yīng)。也證明這些反應(yīng)的功能效應(yīng)完全不同。這些蛋白質(zhì)在TRAF依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的能力中可能是重要的連接。事實(shí)上，尚不清楚TRAF如何引起I-κB的磷酸化。也沒有關(guān)于說明TRAF被不同受體激活(如兩種TNF受體誘生NF-κB)所見的細(xì)胞特異性方式機(jī)制的信息。最近已分辨了人TRAF的TRAF結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)(Park Y.C等1999)，該結(jié)構(gòu)顯示TRAF結(jié)構(gòu)域?yàn)樽陨斫Y(jié)合(self-association)的三聚體，這為TRAF的募集依賴于其三聚胞外配體對受體的寡聚化提供了基于親合力的解釋。
因此關(guān)于NF-κB激活及其在維持細(xì)胞存活中的重要性，目前尚未能闡明涉及這種激活的各種胞內(nèi)通路，例如，各種TRAF蛋白質(zhì)是如何直接或間接參與。
因此，如目前所知關(guān)于TNF/NGF受體家族不同成員和它們的相關(guān)胞內(nèi)信號傳遞通路，包括各種銜接子，介質(zhì)/調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(簡述和參考文獻(xiàn)見待批的共同所有的以色列專利申請114615，114986，115319，116588)而言，例如TNF和Fas/APOl配體可對細(xì)胞起有益和有害兩種作用。例如TNF在器官抗腫瘤和感染因子的防衛(wèi)時誘導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的殺傷，增強(qiáng)粒細(xì)胞的抗菌活性，對病理損傷康復(fù)有貢獻(xiàn)，在這些情況下需要TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。然而過量TNF可能是有害的，如已知在許多疾病，如敗血性休克、厭食、風(fēng)濕病、炎癥和移植物抗宿主反應(yīng)中TNF起著主要致病作用，在此類情況下，不需要TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。例如，F(xiàn)AS/APOl配體也具有有益和有害作用。該FAS/APOl配體在T細(xì)胞成熟過程中通過其受體誘導(dǎo)了對自身反應(yīng)性T細(xì)胞的殺傷，即在識別自身抗原的T細(xì)胞發(fā)育過程中將其殺死，從而避免了自身免疫疾病。
此外，各種惡性細(xì)胞和HIV感染細(xì)胞，其表面具有FAS/APOl受體，因此，可通過其配體或特異性抗體激活此受體，進(jìn)而激活此受體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(凋亡)細(xì)胞內(nèi)通路，而被摧毀。然而，F(xiàn)AS/APOl受體亦可介導(dǎo)有害作用，例如，在伴有肝細(xì)胞破壞的急性肝炎等某些疾病中見到的不能控制的組織殺傷。
以上綜述，即TNF/NGF家族受體可一方面誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通路，另一方面誘導(dǎo)細(xì)胞存活通路(通過誘導(dǎo)NF-κB)，細(xì)胞內(nèi)這兩個相反的通路之間顯然存在著精細(xì)的平衡。例如，當(dāng)需要獲得對癌細(xì)胞或其他感染或患病細(xì)胞的最大破壞時，可能需要TNF和/或FAS/APOl配體只誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通路而不誘導(dǎo)NF-κB。相反，當(dāng)需要保護(hù)細(xì)胞時，例如在炎癥，移植物抗宿主反應(yīng)，急性肝炎時，可能需要阻斷TNF和/或FAS/APOl配體誘導(dǎo)的細(xì)胞殺傷而代之以增強(qiáng)對NF-κB的誘生。同樣，在某些病理情況下，可能需要阻斷P75TNF受體和IL-1受體介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳遞通路，而在其他情況下，可能需要增強(qiáng)這些胞內(nèi)通路。
發(fā)明簡述本發(fā)明的一個目的是提供能結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)蛋白質(zhì)的生物活性蛋白質(zhì)，及其同工型，類似物，片段或衍生物。由于TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)參與了轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(其由某些TNF/NGF受體以及其他上述已提到的受體所引發(fā))激活的調(diào)節(jié)或介導(dǎo)，本發(fā)明蛋白質(zhì)通過結(jié)合TRAF蛋白可能調(diào)節(jié)或介導(dǎo)由結(jié)合其受體的各種配體所引發(fā)的胞內(nèi)信號傳遞過程。這些配體，如TNF、CD40配體，F(xiàn)AS配體等和調(diào)節(jié)劑/介質(zhì)，可以通過與TRAF蛋白直接或間接反應(yīng)而激活NF-κB(如TRAF2和TRAF6誘導(dǎo)NF-κB激活，TRAF3抑制NF-κB激活)。
本發(fā)明的生物活性蛋白質(zhì)，及同其工型，類似物，片段或衍生物，同樣可能是其他能與TRAF蛋白直接或間接反應(yīng)的各種其他蛋白質(zhì)(如FAS/APOL受體，P55TNF受體，P75TNF受體，IL-1受體和其相關(guān)蛋白質(zhì)，如MORT-1，TRADD，RIP)胞內(nèi)生物活性的間接調(diào)節(jié)劑/介質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的是，提供對上述新穎TRAF結(jié)合性蛋白，及其同工型，類似物，片段或衍生物的拮抗劑(如抗體，肽，有機(jī)化合物或甚至其某些同工型)，當(dāng)需要時可用于抑制信號傳遞過程，或更具體說抑制參與細(xì)胞存活過程的NF-κB及其相關(guān)物的激活。同樣，本發(fā)明的TRAF結(jié)合性蛋白或它們結(jié)合的TRAF蛋白(如TRAF3)本身對NF-κB激活有抑制作用(間接或通過對它們結(jié)合的蛋白質(zhì)的運(yùn)輸或穩(wěn)定性調(diào)節(jié))，本發(fā)明的目的是提供對TRAF結(jié)合性蛋白激活信號傳遞過程的拮抗劑，或更具體說，當(dāng)需要時，提供對阻斷NF-κB活化的抑制，因而能增強(qiáng)NF-κB激活的拮抗劑。
本發(fā)明另一目的是，采用上述新穎TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)，其同工型，類似物，片段或衍生物來分離和特性鑒定其他可能參與TRAF蛋白活性調(diào)節(jié)和/或上述受體活性的蛋白質(zhì)或因子，例如，可結(jié)合TRAF蛋白并影響其活性的其他蛋白質(zhì)；和/或分離和鑒定該信號傳遞過程，上游或下游，這些新穎蛋白質(zhì)，類似物，片段和衍生物所結(jié)合的、因而也涉及其功能的其他受體或其他細(xì)胞蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的還有一個提供能夠?qū)爰?xì)胞中與該新穎TRAF結(jié)合性蛋白及其可能的同工型結(jié)合或反應(yīng)的抑制劑，該抑制劑可抑制例如NF-κB激活中的TRAF蛋白相關(guān)活性，因此當(dāng)需要時，可抑制NF-κB的激活，或該抑制劑可抑制NF-κB激活中的抑制性TRAF相關(guān)活性(如TRAF3)，因此，當(dāng)需要時可增強(qiáng)NF-κB激活。
而且，本發(fā)明的一個目的是采用上述TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)，其同工型，類似物，片段或衍生物作為抗原來制備其多克隆和/或單克隆抗體。這些抗體進(jìn)而可用于例如從不同來源，如細(xì)胞抽提物或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，純化所述新型蛋白質(zhì)。
更進(jìn)一步，這些抗體還可用于診斷目的，例如，鑒定與TRAF蛋白直接介導(dǎo)的，或P55TNF受體、FAS/APOl受體或其它相關(guān)受體和它們結(jié)合的細(xì)胞蛋白質(zhì)(如MORT-1、TRADD、RIP，它們通過與TRAF蛋白反應(yīng)直接或間接調(diào)節(jié)/介導(dǎo)胞內(nèi)過程)介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)功能異常相關(guān)的疾病。
本發(fā)明還有一個目的是提供包含上述新穎IREN蛋白質(zhì)，其同工型，類似物，片段或衍生物的藥物組合物，以及包含上述新穎抗體或其他拮抗劑的藥物組合物。
因此本發(fā)明提供了能至少結(jié)合TRAF2，并對TRAF2具有高度特異性結(jié)合能力的一種新穎IREN蛋白質(zhì)，它是TRAF2胞內(nèi)活性的調(diào)節(jié)劑或介質(zhì)。TRAF2參與至少一個胞內(nèi)信號傳遞通路的調(diào)節(jié)或介導(dǎo)，該通路是細(xì)胞存活或生存相關(guān)通路，TRAF2直接參與了在細(xì)胞存活中起中心作用的NF-κB的激活。
事實(shí)上，稱為IREN(IκB的調(diào)節(jié)劑)的這種蛋白質(zhì)能結(jié)合TRAF2，并顯然在NF-κB信號傳遞通路NIK的下游NEMO和IKKI的上游起作用，并增強(qiáng)IκB的IKK1磷酸化。此外，TRAF2由于能直接或間接與上述P55TNF受體、P75TNF受體、FAS/APOl受體和它們的相關(guān)蛋白質(zhì)MORT-1、TRADD和RIP反應(yīng)，因此也是這些受體引起NF-κB誘生或激活活性的介質(zhì)或調(diào)節(jié)劑。故TRAF2是這些受體和它們相關(guān)的蛋白質(zhì)所介導(dǎo)的細(xì)胞存活途徑的一種調(diào)節(jié)劑/介質(zhì)(與細(xì)胞死亡途徑相反)。這些受體和/或蛋白質(zhì)與TRAF2之間反應(yīng)的程度是這些受體活性(一旦被其配體激活)的結(jié)局，即細(xì)胞是死是活的重要因素。故本發(fā)明的蛋白質(zhì)在TRAF2和其它能與其反應(yīng)的蛋白質(zhì)/受體之間的這種反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，如IREN之類的蛋白質(zhì)通過與TRAF2的特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)其活性，和/或通過與TRAF2反應(yīng)而調(diào)節(jié)其自身活性。
如本文所用，TRAF蛋白的活性，如TRAF2的活性包括其調(diào)節(jié)/介導(dǎo)細(xì)胞存活通路的活性，如NF-κB的誘導(dǎo)/激活。同樣，如本文所用，TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)，具體是TRAF2結(jié)合性蛋白質(zhì)的活性，包括通過與TRAF(具體是TRAF2蛋白)的特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)/介導(dǎo)了TRAF，具體說TRAF2的活性。這種調(diào)節(jié)/介導(dǎo)包括細(xì)胞存活通路的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)，具體說這涉及TRAF蛋白，具體是TRAF2直接或間接參與的NF-κB的激活/誘導(dǎo)。因此可認(rèn)為IREN是所有上述蛋白質(zhì)和可能還有參與細(xì)胞存活的其他成員的間接調(diào)節(jié)劑/介質(zhì)，例如NF-κB激活/誘導(dǎo)和TRAF2(或其他TRAF蛋白質(zhì))與NF-κB結(jié)合，或TRAF2(或其他TRAF蛋白質(zhì))以直接或間接方式與NF-κB反應(yīng)。同樣，TRAF2通過激活Jun激酶級聯(lián)反應(yīng)參與AP1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，故IREM在Jun激酶激活通路中或在控制其他基因激活通路(如P38激酶通路)中可能起作用。其在控制TNF所致炎癥和其他非凋亡效應(yīng)中以及在控制凋亡中可能具有重要作用。
更具體說，本發(fā)明提供了編碼能結(jié)合TRAF的蛋白質(zhì)的DNA序列，其選自a)包含圖3所示核苷酸序列的本文命名為IREN的cDNA序列；b)包含圖4所示核苷酸序列的本文命名為IREN-10B同工型的cDNA序列；c)包含圖5所示核苷酸序列的本文命名為IREN-E同工型的cDNA序列；d)編碼能至少結(jié)合TRAF2氨基酸序列的225-501殘基的生物活性蛋白質(zhì)的(a)-(c)序列的片段e)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)-(d)之一序列雜交，并編碼能至少結(jié)合TRAF2氨基酸序列的225-501殘基的生物活性蛋白質(zhì)的DNA序列。
f)與(a)-(e)中限定的DNA序列具有基因密碼子簡并性(degenerate)并編碼能至少結(jié)合TRAF2氨基酸序列的225-501殘基的生物活性蛋白質(zhì)的DNA序列。編碼由IREN編碼的蛋白質(zhì)的本發(fā)明的上述DNA序列的具體例子包括(i)編碼能結(jié)合TRAF2并能調(diào)節(jié)NF-κB和IREN同工型，其片段或類似物的活性IREN蛋白質(zhì)、其生物活性同工型、片段或類似物的DNA序列。
(ii)上述(i)的DNA序列選自a)衍生白天然IREN蛋白編碼區(qū)的cDNA序列；b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)序列雜交并編碼生物活性IREN的DNA序列；和c)與(a)和(b)中限定的序列具有基因密碼子簡并性并編碼生物活性IREN蛋白的DNA序列。
(iii)如上述(i)或(ii)中的至少含有圖3所示序列的一部分并至少編碼一種活性IREN蛋白、其同工型、類似物或片段的DNA序列。
(iv)如上述(iii)中編碼IREN蛋白、其同工型，類似物或片段的至少具有圖3所示部分氨基酸序列的DNA序列。
另一方面，本發(fā)明提供上述DNA編碼的蛋白質(zhì)或多肽，它們能結(jié)合TRAF2，優(yōu)選至少能結(jié)合TRAF2的225-501氨基酸序列；及這些蛋白質(zhì)和多肽的同工型、類似物，片段和衍生物。本發(fā)明這些蛋白質(zhì)/多肽的實(shí)施例包括a)本文命名為IREN的蛋白質(zhì)；b)其同工型、片段、類似物和衍生物；和c)至少具有圖6所示部分氨基酸序列的IREN蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段和衍生物另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明上述DNA序列的、能在選自真核和原核細(xì)胞的宿主細(xì)中表達(dá)的載體，以及含有所述載體的轉(zhuǎn)化的真核和原核細(xì)胞。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)本發(fā)明上述DNA序列任一所編碼的蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物的方法，該方法包括在適合所述蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物表達(dá)的條件下，培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，若需要，可影響翻譯后的修飾以獲得所述蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物，并分離所表達(dá)的蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物。
還有一方面，本發(fā)明提供對以上TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)、其類似物、同工型、片段或衍生物有特異性的，或?qū)ι鲜鯥REN蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物有特異性的抗體或抗體的活性片段或衍生物。
另一不同方面，本發(fā)明提供以下篩選方法(i)篩選能結(jié)合本發(fā)明上述蛋白質(zhì)，包括其同工型、類似物、片段或衍生物的配體的方法。該方法包括使一種其上結(jié)合有所述蛋白質(zhì)其同工型，類似物，片段或衍生物的親和層析基質(zhì)與細(xì)胞提取物接觸，在此配體與所述差異結(jié)合，洗脫，分離和分析所述配體。
(ii)篩選編碼能結(jié)合本發(fā)明上述蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物的配體的DNA序列。該方法包括采用酵母雙雜交程序，在此程序中一種雜交載體攜帶有編碼所述蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物的序列，第二雜交載體攜帶有cDNA或基因組DNA文庫的序列，用所述二載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，抽提所述第二雜交載體以獲得編碼所述配體的序列。
相類似，本發(fā)明還提供分離和鑒定能直接結(jié)合TRAF2的本發(fā)明上述的蛋白質(zhì)、其同工型、類似物和片段的方法，該方法采用酵母雙雜交程序，此程序中一個雜交載體攜帶有編碼TRAF2的序列，第二雜交載體攜帶有cDNA或基因組DNA文庫的序列，用兩載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后抽提所述第二雜交載體以獲得編獲能結(jié)合TRAF2的蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明還有一方面是提供一種調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性，或受TRAF2或其他分子(本發(fā)明上述蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物)調(diào)節(jié)和介導(dǎo)的任何其他胞內(nèi)信號傳遞活性的方法；所述方法包括通過以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的形式向所述細(xì)胞導(dǎo)入一種或多種所述蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物，或以攜帶有所述序列的合適載體形式向所述細(xì)胞導(dǎo)入編碼所述一種或多種蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物的DNA序列來處理細(xì)胞，所述載體以所述序列能在所述細(xì)胞中表達(dá)所述序列的方式影響所述序列插入所述細(xì)胞。
上述調(diào)節(jié)/介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性或受TRAF2或其他分子調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的任何其他胞內(nèi)信號傳遞活性的方法，其實(shí)施例包括(i)上述方法中，所述的細(xì)胞處理，包括以攜帶有所述序列的合適載體形式，向所述細(xì)胞導(dǎo)入編碼所述IREM蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物的DNA序列，所述載體以所述序列能在所述細(xì)胞中表達(dá)的方式影響所述序列插入所述細(xì)胞。
(ii)上述方法中，所述的細(xì)胞處理是用重組動物病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，包括以下步驟。
a)構(gòu)造一攜帶有編碼病毒表面蛋白質(zhì)(配體)的序列的重組動物病毒載體，和構(gòu)造攜帶者編碼本發(fā)明所述IREN蛋白質(zhì)、同工型類似物、片段和衍生物的第二序列的重組動物病毒載體，該病毒表面蛋白(配體)能結(jié)合得處理的細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞表面受體，然后在所述細(xì)胞中表達(dá)能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)NF-κB活性或受TRAF2或其他所述分子調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的任何其他胞內(nèi)信號傳遞活性的分子；和b)用(a)所述載體感染所述細(xì)胞同樣，本發(fā)明還提供調(diào)節(jié)TRAF2所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞作用的方法，包括用本發(fā)明上述的抗體或其活性片段或衍生物處理所述細(xì)胞。所述處理是，給所述細(xì)胞使用含有所述抗體、其活性片段或衍生物的適當(dāng)組合物，當(dāng)所述細(xì)胞的IREN蛋白或其部分暴露于胞外表面時配制胞外用的所述組合物；當(dāng)所述IREN蛋白是胞內(nèi)所述成份時，配制胞內(nèi)用的所述組合物。
本發(fā)明調(diào)節(jié)TRAF2所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞作用的其他方法包括(i)用對于編碼所述IREN蛋白質(zhì)DNA序列至少一部分的反義序列的編碼寡核苷酸序列，處理所述細(xì)胞，這種DNA序列是本發(fā)明上述序列之一，所述寡核苷酸序列能阻斷所述IREN蛋白的表達(dá)。
(ii)如上述(i)的方法中，通過上述重組病毒，將所述寡核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞，所述病毒的所述第二序列編碼所述寡核苷酸序列(iii)一種包括使用核酶程序的方法，在此方法中，將編碼能與細(xì)胞mRNA序列(編碼本發(fā)明上述IREN蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物)反應(yīng)的核酶序列，以允許其在所述細(xì)胞中表達(dá)所述核酶的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞。當(dāng)所述細(xì)胞表達(dá)該核酶序列時，該核酶與所述細(xì)胞的mRNA序列反應(yīng)并切割所述mRNA序列，導(dǎo)致抑制所述IREN蛋白在所述細(xì)胞中的表達(dá)。
本發(fā)明上述方法和實(shí)施例中還包括預(yù)防或治療NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)連的疾病、或受TRAF2或其他分子(本發(fā)明蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物能與之結(jié)合的)所介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)連的疾病的方法；所述方法包括給予需要的病人有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物，或編碼它們的DNA分子，或能破壞所述蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物與TRAF2的相互反應(yīng)，或能破壞與所述蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物結(jié)合的其他分子的相互反應(yīng)的分子。在本發(fā)明此方法中，給予需要的病人本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是IREN編碼的蛋白質(zhì)，或編碼其的DNA分子。目前認(rèn)為IREN編碼的蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)IKK-1和NIK對NF-κB的誘導(dǎo)。本發(fā)明另一方面是提供一種藥物組合物來調(diào)節(jié)TRAF2所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞的效應(yīng)，此組合物含有活性組分IREN、其生物活性片段、類似物、衍生物或它們的混合物。
本發(fā)明的其他藥物組合物或其實(shí)施例包括(i)一種用于調(diào)節(jié)TRAF2所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，其包含本發(fā)明編碼能結(jié)合細(xì)胞表面受體的蛋白質(zhì)和IREN，其生物活性同工型、活性片段或類似物的重組動物病毒載體作為活性組分。
(ii)一種用于調(diào)節(jié)TRAF2所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，其包含編碼本發(fā)明IRENm RNA序列的反義序列的寡核苷酸序列作為活性組分。
上述藥物組合物的其他實(shí)施例具體是用于預(yù)防或治療NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)連的疾病或受TRAF2或其他分子(本發(fā)明蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物能與之結(jié)合的)所介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)連的疾病的藥物組合物，所述組合物包含有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)、類似物、同工型、片段或衍生物，或編碼它們的DNA分子或能破壞所述蛋白質(zhì)、類似物、同工型、片段或衍生物與TRAF2的相互反應(yīng)，或能破壞與所述蛋白質(zhì)、類似物、同工型、片段或衍生物結(jié)合的任何其他分子的相互反應(yīng)的分子。在另一具體實(shí)施例中，所述藥物組合物含有有效量的IREN編碼的蛋白質(zhì)，IREN的同工型、類似物、片段或衍生物，或編碼它們的DNA分子。
在另一具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供同于預(yù)防或治療NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)連的疾病或受TRAF2或受IREN蛋白所結(jié)合的任何其他分子所介導(dǎo)的其他活性相關(guān)連的疾病的藥物組合物。所述的組合物含有能干擾IREN活性的分子。在該組合物中于擾性分子可能是有效量的活性位點(diǎn)殘基已突變的IREN。這種突變的IREN作用是干擾天然IREN。
一種已知與NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)連的狀態(tài)(異常)是AIDS病，其他還有自身免疫病和腫瘤。
本發(fā)明的其他方面內(nèi)容和實(shí)施例是(i)一種鑒定或產(chǎn)生能調(diào)節(jié)受本發(fā)明蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能結(jié)合含有圖6所示IREN序列至少一部分的多肽的配體；b)鑒定和特性分析上述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的能實(shí)現(xiàn)所述結(jié)合的配體，除TRAF2或TNF/NGF受體家族某受體的一部分外；c)以基本分離和純化的形式產(chǎn)生所述配體。
(ii)一種鑒定或產(chǎn)生能調(diào)節(jié)受IREN所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能結(jié)合含有圖6所示IREN序列至少一部分的多肽的配體；b)鑒定和特性分析上述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的能實(shí)現(xiàn)所述結(jié)合的配體，除TRAF2或TNF/NGF受體家族某受體的一部分外；c)以基本分離和純化的形式產(chǎn)生所述配體。
(iii)一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)受IREN所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)受IREN所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)鑒定和特性分析該分子；和c)以基本分離和純化形式產(chǎn)生所述分子。
(iv)一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)受本發(fā)明蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)細(xì)胞活性的分子的方法，該方法包括a)篩選能調(diào)節(jié)受本發(fā)明IREN蛋白質(zhì)、同工型、類似物、片段或衍生物所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；b)鑒定和特性分析該分子；和c)以基本分離的和純化的形式產(chǎn)生該分子。
本文也提供了本發(fā)明的其他方面內(nèi)容和實(shí)施例，如本發(fā)明以下詳細(xì)描述所提供的那樣。
應(yīng)明白，本文中，使用了以下術(shù)語“TRAF(或TRAF2)對細(xì)胞作用的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)”和本文所述的其他這類“調(diào)節(jié)/介導(dǎo)”，可理解為包括體內(nèi)和體外處理，此外還包括抑制或增強(qiáng)/促進(jìn)。


圖1.TRAF2分子結(jié)構(gòu)的示意2.某些參與NF-κB激活的蛋白質(zhì)的示意3A.IREN的5’引物UTR的核苷酸序列(從該序列起始處直到Kozak序列的ATG)在所有3種IREN剪接同工型中是相同的(SEQ.ID NO3)圖3B.顯示IREN(SEQ.ID NO4)的核苷酸序列圖4.顯示IREN-10B(SEQ.ID NO5)的核苷酸序列圖5.顯示IREN-E(SEQ.ID NO6)的核苷酸序列圖6.顯示IREN的氨基酸序列(SEQ.ID NO7)圖7.顯示IREN-10B氨基酸序列(SEQ.ID NO8)圖8.顯示IREN-E氨基酸序列(SEQ.ID NO9)圖9.顯示IREN及其同工型IREN-10B和IREN-E序列之間的比較圖10.顯示IKK-1，野生型IREN，NIK和NEMO及它們的突變體，誘導(dǎo)NF-κB激活結(jié)果的示意圖。
圖11.用pcFLAG CHUK(編碼小鼠IKK1)和pc20.4(編碼MEMO蛋白)，與PCHIS-IRENΔN(pcHIS-IREN198-541，左泳道)，pcHIS-IREN(中間泳道)一起，或空載體PCDNA3(右泳道)作為對照，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后獲得的FLAG-IKK1，GST-IkappaB和NEMO的放射自顯影圖。如實(shí)施例3所述進(jìn)行了免疫沉淀和激酶試驗(yàn)，測定了FLAG-IKK1、GST-IKappB和NEMO的分子量相應(yīng)可見條帶的大小。
圖12.從轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫沉淀的IREN10B和IREN的SDS-PAGE分析的放射自顯影(左)和免疫染色(右)，再進(jìn)行體外激酶試驗(yàn)。此圖表明IREN10B在細(xì)胞內(nèi)與一蛋白激酶結(jié)合。此激酶可磷酸化這種IREN剪接變體。
圖13.基因數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示這些基因與存在于幾個人染色體中的IREN密切相關(guān)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及本文命名為IREN的cDNA序列(見圖3)，它編碼了能結(jié)合TRAF2的蛋白質(zhì)，該DNA序列編碼了此蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及IREN的同工型IREN-10B和IREN-E的以cDNA序列(分別見圖4和5)。
上述DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列在DNA或氨基酸序列的“GENEBANK”或“PROTEIN BANK”數(shù)據(jù)庫中沒出現(xiàn)。因此它們代表迄今未知的序列。
本發(fā)明的范圍還包括上述DNA序列的片段和能在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與這些DNA序列或其部分雜交的DNA序列，只要它們編碼能與TRAF2的至少225-501氨基酸結(jié)合的生物活性蛋白質(zhì)或多肽。
本發(fā)明也涉及作為上述DNA序列基因編碼結(jié)果的簡并DNA序列，它們能編碼至少能結(jié)合TRAF2的225-501氨基酸序列的生物活性蛋白質(zhì)或多肽。
關(guān)于TRAF2，應(yīng)明白TNF/NGF受體家族的幾個成員能通過與TRAF2直接或間接結(jié)合而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，因此TRAF2是這些受體的衡接子蛋白，也可以認(rèn)為是這些TNF/NGF受體誘導(dǎo)NF-κB激活活性的一種調(diào)節(jié)劑/介質(zhì)(見圖2)。另一受體，IL-1受體可不依賴TRAF2激活NF-κB。本發(fā)明產(chǎn)生的IREN類似物或突變蛋白，當(dāng)這些類似物和突變蛋白在細(xì)胞中表達(dá)時可調(diào)節(jié)NF-κB的激活。
故本發(fā)明涉及IREN蛋白及其生物活性同工型、類似物、片段和衍生物。和由該蛋白編碼的同工型、類似物、片段和衍生物，可用標(biāo)準(zhǔn)方法(見SambrooK等，1998)制備這種類似物、片段和衍生物。標(biāo)準(zhǔn)方法中，在DNA編碼序列中可刪除，加入一個或多個密碼子，或用另一個來替代，產(chǎn)生編碼的對天然蛋白至少有一個氨基酸改變的類似物?？山邮艿念愃莆锸悄切┲辽俦Ａ袅私Y(jié)合TRAF2能力的但不能或能介導(dǎo)任何其他結(jié)合活性或酶促活性的類似物，如能結(jié)合TRAF2但不傳遞信號，即不再結(jié)合下游蛋白或其他因子，或不催化信號依賴性反應(yīng)的類似物。以這種方式可產(chǎn)生具有所謂顯性失活效應(yīng)的類似物，即在結(jié)合TRAF2上或在上述結(jié)合后的后續(xù)信號傳遞上有缺陷的類似物。例如可用這種類似物來抑制CD40，p55TNF和p75TNF(FAS/APOl)和其他有關(guān)的受體的作用。以及通過與天然IREN蛋白競爭，影響到上述各種受體相關(guān)蛋白(銜接子)所介導(dǎo)的作用。同樣，也可產(chǎn)生所謂的顯性陽性(dominant-positive)類似物，其作用是增強(qiáng)TRAF2作用。它們具有比天然TRAF2結(jié)合性蛋白質(zhì)相同或更佳的TRAF2結(jié)合性能、和相同或更佳的信號傳遞性能。在類似物一類中，可如上所述以類似物制備形式制備本發(fā)明克隆的生物活性片段。本發(fā)明DNA序列的合適片段是編碼保留了TRAF2結(jié)合能力的或能介導(dǎo)上述任何結(jié)合活性或酶促活性的蛋白質(zhì)或多肽的那些DNA片段。因此就類似物而言，可以制備具有上述顯性失活或顯性陽性作用的本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的片段。同樣，可通過標(biāo)準(zhǔn)方法修飾這些蛋白質(zhì)、其類似物或片段的一個或多個氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，或?qū)⑦@些蛋白質(zhì)、其類似物或片段與另一分子，如抗體、酶、受體等偶聯(lián)，來制備衍生物，這是本領(lǐng)域眾所周知的。
本發(fā)明編碼TRAF2結(jié)合性蛋白質(zhì)IREN、其生物活性同工型、類似物、片段或衍生物的上述DNA序列，作為本發(fā)明的一個實(shí)施例，還包括能與天然TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)編碼區(qū)產(chǎn)生的cDNA序列雜交的DNA序列，這種雜交在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行，該可雜交的DNA序列編碼生物活性的TRAF結(jié)合性蛋白。
這些可雜交的DNA序列包括，與天然IRENcDNA序列，和選擇代表代表TRAF結(jié)合蛋白樣序列相對高度同源的序列，它們可是，例如，編碼各種IREN同工型的天然衍生序列，或天然存在的屬檢編碼IREN的TRAF結(jié)合蛋白樣序列的編碼蛋白序列。進(jìn)一步，這些序列也可例如包括非天然存在的，合成產(chǎn)生的序列，它們與天然的IRENcDNA序列類似，但包括一些所需的修飾。這樣的合成序列包括編碼都具有TRAF結(jié)合蛋白活性的IREN類似物，片段和衍生物的所有可能的序列。
如本文所用，嚴(yán)謹(jǐn)條件是雜交實(shí)驗(yàn)中所用溫度、雜交溶液中單價陽離子摩爾濃度和甲酰胺百分濃度的函數(shù)(function)。為確定某給定系列條件所涉及的嚴(yán)謹(jǐn)程度，人們先采用了Meinkoth等(1984)的公式來確定100％同一性雜交的穩(wěn)定性，表示為DNA-DNA雜交的解鏈溫度TmTm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L其中，M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分濃度，L是雜交物的堿基對長度。從100％同一性雜交計算，Tm每減少1℃，允許的錯配序列數(shù)量增加約1％。因此，如果某給定雜交實(shí)驗(yàn)在特定的鹽濃度和甲酰胺濃度時所用Tm低于按Meinkoth公式100％雜交計算的Tm值10℃，即使錯配序列高達(dá)10％，雜交仍將發(fā)生。故“高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是，其Tm不低于發(fā)生與靶序列形成完全的二聚體時的Tm(或用以上公式計算或?qū)嶋H測定)10℃以上的那些條件?！爸械葒?yán)謹(jǐn)度條件”是，其Tm不低于發(fā)生與靶序列形成完全的二聚體時的Tm(或用以上公式計算或?qū)嶋H測定)20℃以上的那些條件。不受限制，高嚴(yán)謹(jǐn)度條件(低于計算或測定的雜交Tm 5-10℃)和中等嚴(yán)謹(jǐn)度條件(低于計算或測定的雜交Tm 15-20℃)的例子，在低于計算的雜交Tm的適當(dāng)溫度下采用2XSSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水)和0.5％SDS(十二烷基硫酸鈉)洗滌液。最高嚴(yán)謹(jǐn)條件主要是洗滌條件。特別是如果所用的雜交條件使在形成穩(wěn)定的雜交的同時也允許形成不大穩(wěn)定的雜交。較高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗滌條件去除了不大穩(wěn)定的雜交。常用的雜交條件，采用上述高嚴(yán)謹(jǐn)至中等嚴(yán)謹(jǐn)度的洗滌條件，是在低于Tm約占20-25℃溫度下在6xSSC(或6xSSPE，標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽水-EDTA)，5xDenhardt試劑、0.5％SDS、100μg/ml變性片段化的鮭精DNA溶液中雜交。如果采用混合的探針，宜采用四甲基氯化銨(TMAC)代替SSC(Ausubel，1987，1999)為了獲得上述各種天然IREN樣序列，可采用各種組織的天然DNA或RNA樣品，用天然IREN cDNA或其一部分作為探針，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的篩選和分離方法(見Sambroo K等，1989建立標(biāo)準(zhǔn)方法)。
同樣，為制備上述IREN的各種合成的編碼類似物、片段或衍生物的TRAF結(jié)合性蛋白樣序列的類似物、片段或衍生物，可采用一些標(biāo)準(zhǔn)方法，如本文以下制備這種類似物、片段和衍生物所詳述的那樣。
“基本上對應(yīng)于”IREN的多肽或蛋白質(zhì)，不僅包括IREN本身也包括IREN類似物的多肽或蛋白質(zhì)。
基本上對應(yīng)于IREN的類似物是其中IREN的氨基酸序列有一個或多個氨基酸被其他氨基酸所替代、缺失和/或插入的那些多肽，只要所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)顯示與IREN有著基本上相同或更高的生物活性。
為了基本上對應(yīng)于IREN，該蛋白質(zhì)(如同工型)序列中的變化通常相當(dāng)小。雖然變化的數(shù)量可能超過10個，優(yōu)選不多于10個變化，更優(yōu)選不多于5個，最優(yōu)選不超過3個這些變化。雖然可采用任何技術(shù)來尋找基本上對應(yīng)于IREN的潛在的生物活性蛋白，一種這樣的技術(shù)是在編碼該蛋白DNA上使用任何技術(shù)來尋找基本上對應(yīng)于IREN的潛在的生物活性蛋白，一種技術(shù)是在編碼該蛋白DNA上使用常規(guī)誘變技術(shù)來產(chǎn)生一些修飾。然后可篩選這些克隆所表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合TRAF蛋白(如TRAF2)的能力，和在上述胞內(nèi)通路的調(diào)節(jié)/介導(dǎo)中調(diào)節(jié)TRAF蛋白(如TRAF2)活性的能力。
“保守性”變化是預(yù)計不會改變蛋白質(zhì)活性的那些變化，通常先篩選出預(yù)計不會實(shí)質(zhì)性改變該蛋白質(zhì)的大小、電荷或構(gòu)象，因而預(yù)計不會改變其生物性能的那些變化。
IREN的保守性替代，包括多肽中至少一個氨基酸殘基被一不同氨基酸保守性替代的類似物。這種替代宜按表1A提供的名單進(jìn)行，通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)可確定那種替代可提供結(jié)構(gòu)功能性質(zhì)改進(jìn)的合成多肽分子，同時保留IREN的特征性生物活性。
表1A

另外，IREN的其他替代基團(tuán)，是多肽中至少一個氨基酸殘基被除去，在其位置上按照表1B插入了一個不同的殘基的那些替代。多肽中可進(jìn)行的替代類型可根據(jù)不同物種同源蛋白之間氨基酸變化頻率的分析，如表1-2中Schulz等提供的那樣(GE“蛋白結(jié)構(gòu)原理”，Springer-Verlag，New York，NY，1978)和Creighton，T.E“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子性能”(W.H.Freeman & Co，SanFrancisco，CA 1983)的圖3-9。根據(jù)這種分析，其他的保守性替代本文定義為以下5組之一中的氨基酸互換表1B1.脂肪族，無極性或低極性α殘基丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(脯氨酸，甘氨酸)2.極性帶負(fù)電殘基和其酰胺天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺
3.極性帶正電殘基組氨酸，精氨酸，賴氨酸4.脂肪族無極性大殘基甲硫氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸(半胱氨酸)；和5.芳香族大殘基苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸。
上表括號內(nèi)的三個氨基酸殘基在蛋白結(jié)構(gòu)中具有特殊作用。甘氨酸是唯一缺乏任何側(cè)鏈的殘基，使其鏈有可屈曲性，這傾向促進(jìn)二級結(jié)構(gòu)而非α螺旋的形成。脯氨酸由于其異常的幾何形狀，緊緊約束了該鏈，一般傾向于產(chǎn)生β轉(zhuǎn)角樣結(jié)構(gòu)，在某些情況下半胱氨酸可能參與二硫鍵的形成，這在蛋白折疊中是重要的。Schulz等(同上)將上述組1和組2合并。還有酪氨酸，由于其氫鍵潛能而具有與絲氨酸和蘇氨酸等顯著相近的性質(zhì)(kinship)。
如上所述本發(fā)明的保守性氨基酸替代是本領(lǐng)域熟知的，預(yù)計氨基酸替代后仍保留了該多肽的生物和結(jié)構(gòu)特性。本發(fā)明的大多數(shù)缺失和替代不會使蛋白質(zhì)或多肽分子的特征產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性變化?！疤卣鳌毙宰兓苑前菪苑绞蕉x為二級結(jié)構(gòu)，如α螺旋或β片層兩者變化和生物活性的變化。例如，結(jié)合TRAF蛋白質(zhì)和/或介導(dǎo)TRAF蛋白對細(xì)胞死亡效應(yīng)的變化。
產(chǎn)生本發(fā)明可用于獲得IREN類似物的蛋白質(zhì)的氨基酸替代例子，包括任何已知的方法步驟美國專利RE33653，4959314，4588585和4737462(授與Mark等)；5116943(授與Koths等)；4965195(授與Namen等)；4879111(授與Chong等)；和5017691(授與Lee等)；賴氨酸取代的蛋白質(zhì)見美國專利4904584(Shaw等)。
除了上述討論過不會明顯改變IREN活性的保守性替代外，能導(dǎo)致IREN類似物生物活性提高的保守性替代或較不保守和更加隨機(jī)的變化也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
當(dāng)要驗(yàn)證替代或缺失的確切效果時，本領(lǐng)域技術(shù)人員懂得可通過常規(guī)結(jié)合試驗(yàn)和細(xì)胞死亡試驗(yàn)來評價替代，缺失等的效果。用這類標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)進(jìn)行篩檢不需要過多實(shí)驗(yàn)。
通常在編碼IREN的DNA中進(jìn)行核苷酸定點(diǎn)誘變，在基因水平上制備這些類似物，由此產(chǎn)生編碼該類似物的DNA，然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中合成該DNA并表達(dá)多肽。這些類似物通常顯示出與天然存在的蛋白質(zhì)相同的或質(zhì)量提高的生物活性，Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublications and Wiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY，1989。
可通過編碼較早制備的類似物或天然形式IREN的DNA的位點(diǎn)特異性誘變，來制備編碼本發(fā)明的IREN突變蛋白、或編碼相同的多肽但由于已知的基因密碼簡并性所允許的變化而與天然序列不同的其他核苷酸序列。位點(diǎn)特導(dǎo)性誘變可通過使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列、以及足夠數(shù)目的毗連核苷酸，以提供大小和序列復(fù)雜性足以在待跨越的缺失連接處兩側(cè)形成穩(wěn)定的二聚體的引物序列，來產(chǎn)生類似物。通常優(yōu)先引物長20~25個核苷酸，在待改變的序列各側(cè)5-10個互補(bǔ)核苷酸。位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，一些出版物如Adelman等，DNA 2183(1983)有舉例說明，其公開的內(nèi)容納入本文作為參考。
大家知道位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)通常采用以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括例如由Messing等Third ClevelandSymposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton編著，Elsevier，Amsterdam(1981)所述的M13噬菌體載體，其公開內(nèi)容納入本文作參考。這些噬菌體易商購獲得，其用途為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。另外，含有單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒載體(Veira等Meth Enzymol 1533 1987)也可以用于獲得單鏈DNA。
通常首先獲得其序列中含有編碼有關(guān)多肽的DNA序列的單鏈載體來進(jìn)行本發(fā)明的定點(diǎn)誘變。用自動化DNA/寡核苷酸合成法合成制備帶有所需突變序列的寡核苷酸引物。然后使該引物與含蛋白序列的單鏈載體退火和經(jīng)受DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段的作用，完成突變鏈的合成，這樣，突變序列和第二鏈帶有所需突變。然后用此異源二聚體載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)菌，如大腸桿菌JM101細(xì)胞，挑選出含有重組載體(帶有突變序列排列)的克隆。
選出這種克隆后，可取出突變的IREN序列，將其置于適當(dāng)?shù)妮d體中，一般為可用來轉(zhuǎn)染適當(dāng)宿主類型的轉(zhuǎn)運(yùn)或表達(dá)載體。
因此采用已知的DNA或RNA擴(kuò)增技術(shù)，如PCR和寡核苷酸化學(xué)合成，可在體外原位和/或體內(nèi)檢測、獲得和/或修飾編碼IREN蛋白的基因或核酸。PCR通過重復(fù)DNA聚合酶反應(yīng)可擴(kuò)增(數(shù)量增加)特異性DNA序列。可用該反應(yīng)作為克隆反應(yīng)的替代，所需要的就是要知道核酸序列。為了進(jìn)行PCR，需設(shè)計與感興趣序列互補(bǔ)的引物，用自動化DNA合成產(chǎn)生這些引物。因?yàn)榭稍O(shè)計能與該基因任何部分雜交的引物，故可創(chuàng)造條件使互補(bǔ)堿基對錯配能被耐受，這些錯配區(qū)域的擴(kuò)增可能導(dǎo)致誘變產(chǎn)物的合成，產(chǎn)生具有新性能的肽(即定點(diǎn)誘變)。參見Ausubel，同上第16章。也可用逆轉(zhuǎn)錄酶將互補(bǔ)DNA(cDNA)合成與PCR聯(lián)合，可用RNA作為合成促乳素(prolactin)受體胞外域的起始材料而無須克隆。
PCR引物的涉及需包含新的限制性酶切位點(diǎn)或其他特征，諸如待擴(kuò)增的基因區(qū)段的末端的末端密碼子。這種在被擴(kuò)增范圍序列5′和3′端的限制性酶切位點(diǎn)的安置對于編碼IREN蛋白或片段來說，是為連接載體中其他序列或克隆位點(diǎn)所定身設(shè)計的。
PCR和其他擴(kuò)增RNA和/或DNA的方法是本領(lǐng)域熟知的，根據(jù)本文的說明和指導(dǎo)用于本發(fā)明而無須過多實(shí)驗(yàn)。已知的DNA或RNA擴(kuò)增方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和有關(guān)的擴(kuò)增方法(參見美國專利4683195，4683202，4800159，4965188(Mallis等)；4795699和4921794(Tabor等)；5142033(Innis)；5122464(Wilson等)；5091310(Innis)；5066584(Gyllensten等)；4889818(Gelfand等)；4994370(Silver等)；4766067(Biswas4656134(Ringold)；和Innis等編著“PCR ProtocolsA Guide to Method andApplications)和采用針對靶序列的反義RNA作為雙鏈DNA合成的模板進(jìn)行RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增(美國專利5130238，授與Malek等，商品名NASBA)；和將DNA擴(kuò)增與抗體標(biāo)記聯(lián)合運(yùn)用的免疫PCR(Ruzicka等，Science 260487，1993)；Sano等，Science 258120，1992；Sano等，Biotechniques 91378，1991)這些專利和參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均納入本文作參考。
就TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)而言，可如上所述以類似物方式制備IREN的生物活性片段或其同工型。TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)的合適片段，是保留了TRAF結(jié)合性蛋白的能力和能直接或間接介導(dǎo)TRAF蛋白或與TRAF蛋白相關(guān)的其他蛋白的生物活性的那些片段。因此，可制備具有上述類似物那樣的顯性失活或顯性陽性效應(yīng)的IREN片段。應(yīng)明白這些片段代表了本發(fā)明的一種特異類型的類似物，即它們是全長IREN序列或其同工型衍生的IREN部分，每一這樣的部分或片段均具有上述所需活性之一種，這種片段可能是一種肽。
同樣可用標(biāo)準(zhǔn)方法修飾IREN、其類似物或片段的一個或多個氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)，或?qū)REN、其類似物或片段與另一分子，如抗體、酶、受體等偶聯(lián)來制備衍生物，這是本領(lǐng)域熟知的，因此本文的“衍生物”包括可用本領(lǐng)域已知方法，從殘基的側(cè)鏈功能基團(tuán)或N-或C-末端基團(tuán)制備的衍生物，這包括在本發(fā)明中。衍生物可以具有化學(xué)基團(tuán)如碳水化合物或磷酸根，只要這種組分具有與IREN蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包含羧基的脂族酯，羧基與氨、或與伯胺、仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺，氨基酸殘基的游離氨基與?；?如烷酰基或碳環(huán)芳?；?形成的N-酰基衍生物，或游離羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基)與脂?；纬傻腛-?；苌铩?br> 術(shù)語“衍生物”只包括那些沒有一個氨基酸改變?yōu)槎畟€常見天然存在氨基酸之另一個的衍生物。
IREN蛋白是一種由氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)或多肽。包含了本文定義的整個IREN蛋白序列的較長序列組成的多肽，包括在這種多肽范圍內(nèi)，只要加入的氨基酸不影響本發(fā)明蛋白質(zhì)的基本和新的特性，即如果它們保留或提高了IREM的生物活性；或可將它們切斷產(chǎn)生具有IREN生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。例如本發(fā)明包括含有IREN與其他氨基酸或肽融合的蛋白質(zhì)。
如上所述，應(yīng)理解本發(fā)明的IREN、同工型、片段、衍生物、突變蛋白等，是胞內(nèi)結(jié)合和/或介導(dǎo)/調(diào)節(jié)任何TRAF蛋白活性的蛋白質(zhì)。具體說，是能如上所述調(diào)節(jié)或介導(dǎo)TRAF2相關(guān)胞內(nèi)信號傳遞活性，特別是在TRAF2和TNF/NGF受體家族各成員或它們的相關(guān)銜接子蛋白(如上和如下詳述)之間相互反應(yīng)后，涉及TRAF2調(diào)節(jié)NF-κB活性的那些蛋白質(zhì)。本發(fā)明的IREN及其各種同工型、類似物、片段等(見實(shí)施例)看來能非常特異性地結(jié)合TRAF2，并對調(diào)節(jié)NF-κB活性起作用。以及IREN顯性失活類似物/突變蛋白也能調(diào)節(jié)這種活性。
本發(fā)明范圍中所提供的所有上述已提高的修飾保護(hù)了所編碼的蛋白質(zhì)、或多肽或它們的類似物和衍生物至少結(jié)合TRAF2的225-501氨基酸序列的能力。
本發(fā)明的所有蛋白質(zhì)和多肽由于其結(jié)合TRAF2的能力被視為TRAF2信號傳遞的介質(zhì)或調(diào)節(jié)劑。因此本發(fā)明所述分子在例如TRAF2配體結(jié)合CD30、CD40、淋巴毒素β(LT-β)受體、P55或P75TNF受體以及上述已提到的其他受體和銜接子蛋白的信號傳遞過程中具有作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活。特別令人感興趣的是本發(fā)明的IREN蛋白及其同工型。
這種新穎的克隆、蛋白質(zhì)、其類似物、片段和衍生物具有許多可能的用途，例如(i)在需要調(diào)節(jié)功能的情況下，例如抗腫瘤或免疫刺激應(yīng)用等需要誘導(dǎo)TRAF2效應(yīng)時，它們可用于調(diào)節(jié)NF-κB活性、及它們所結(jié)合的TRAF2和受體的功能。此時也可用已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，將本發(fā)明蛋白質(zhì)、其類似物、片段或衍生物導(dǎo)入細(xì)胞來調(diào)節(jié)TRAF2或受體的作用。例如，因?yàn)楸景l(fā)明DNA克隆編碼的蛋白質(zhì)是胞內(nèi)蛋白，應(yīng)將它們導(dǎo)入需要TRAF2作用的細(xì)胞中，故需要一種專用于將這些蛋白質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的系統(tǒng)。做此事的一種方法是構(gòu)造一種重組動物病毒，例如，牛痘苗衍生的病毒?？蓪⒁韵聝煞N基因?qū)肱６徊《镜腄NA中編碼能結(jié)合細(xì)胞所特異性表達(dá)的表面蛋白質(zhì)，如AID(HIV)病毒的gp120蛋白質(zhì)(它能特異性結(jié)合某些細(xì)胞CD4淋巴細(xì)胞和有關(guān)白細(xì)胞)的配體的基因；或能特異性結(jié)合攜帶有受體(結(jié)合TRAF2)的細(xì)胞的其他配體的基因，這樣該重組病毒載體將能結(jié)合這些細(xì)胞和本發(fā)明基因編碼的蛋白質(zhì)。這樣，病毒表面表達(dá)了細(xì)胞表面結(jié)合蛋白，將把該病毒特異性導(dǎo)向腫瘤細(xì)胞或其他帶有受體的細(xì)胞，然后該蛋白的編碼序列通過病毒導(dǎo)入細(xì)胞，一旦在細(xì)胞中表達(dá)將增強(qiáng)此受體或TRAF2的作用，在這些細(xì)胞中導(dǎo)致所需的免疫刺激作用。可通過標(biāo)準(zhǔn)方法(見Sambrook等，1989)構(gòu)建這種重組動物病毒。另一種可能性是以寡核苷酸形式導(dǎo)入蛋白質(zhì)編碼序列，可被細(xì)胞吸收和表達(dá)。
(ii)它們可用于調(diào)節(jié)NF-κB的活性、TRAF2或其結(jié)合的受體的作用，例如當(dāng)AIDS中發(fā)生組織損傷、敗血性休克、或移植物抗宿主排斥時，此時需要阻斷已誘導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳遞。在此情況下，例如可能以標(biāo)準(zhǔn)方法向細(xì)胞導(dǎo)入具有本發(fā)明蛋白的反義編碼序列的寡核苷酸，它將有效地阻斷編碼此蛋白的mRNA的翻譯，從而阻斷其表達(dá)導(dǎo)致對不良效應(yīng)的抑制。另外，可使用其他寡核苷酸，即能以干擾其他分子與此蛋白結(jié)合的方式保持其結(jié)合TRAF2的能力，同時不介導(dǎo)該分子的任何激活或調(diào)節(jié)的寡核苷酸。因具有這些特性，所述分子能破壞TRAF2與其天然配體的相互作用，因此起著抑制劑作用，能消除TRAF2介導(dǎo)的效應(yīng)，如NF-κB的激活?？捎蒙鲜鲋亟M病毒(該重組病毒所攜帶的第二序列是寡核苷酸序列)方法將此種寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中。
另一種可能性是利用針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的特異性抗體來抑制這些蛋白質(zhì)的胞內(nèi)信號傳遞活性。抑制不良效應(yīng)的另一種方法是采用最近開發(fā)的核酶方法。核酶是能特異性切割RNA的催化性RNA分子?？蓪嗣缸骰蚬こ谈脑靵砬懈钏x出的靶RNA，例如編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的mRNA。這種核酶具有針對該蛋白的mRNA的特異性序列，能與其反應(yīng)(互補(bǔ)結(jié)合)然后切割此mRNA，導(dǎo)致該蛋白表達(dá)下降(或完全喪失)，表達(dá)水平的下降取決于靶細(xì)胞中核酶的表達(dá)水平。為了將核酶導(dǎo)入所選的細(xì)胞(如攜帶有IREN蛋白的細(xì)胞)可使用任何合適的載體，如質(zhì)粒、動物病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體，它們常用于此目的(也參見上述(i)，其中該病毒含有編碼所選核酶序列的cDNA作為第二序列)(關(guān)于核酶的綜述，方法等參見Chen等，1992；Zhao和Pick，1993)(iii)它們可用于分離、鑒定和克隆能結(jié)合它們的其他蛋白質(zhì)，如參與TRAF2下游胞內(nèi)信號傳遞過程的其他蛋白質(zhì)。例如，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA序列可用于酵母雙雜交系統(tǒng)，此系統(tǒng)中將編碼的蛋白質(zhì)用作“誘餌”來分離、克隆和鑒定cDNA或基因組DNA文庫中的能結(jié)合該克隆的蛋白質(zhì)的其他序列(捕食的)的編碼蛋白質(zhì)。以相同方法也可確定本發(fā)明蛋白質(zhì)能否結(jié)合其他細(xì)胞蛋白質(zhì)，如TNF/NGF受體超家族的其他受體。
(iv)該編碼的蛋白質(zhì)、其類似物、片段或衍生物也可用于分離、鑒定和克隆同樣類型的其他蛋白質(zhì)，如那些能結(jié)合TRAF2或功能相關(guān)蛋白質(zhì)并參與胞內(nèi)信號傳遞的蛋白質(zhì)。在此種應(yīng)用中，可采用上述酵母雙雜交系統(tǒng)或可用最近開發(fā)的使用非嚴(yán)謹(jǐn)性Southern雜交再進(jìn)行PCR克隆的系統(tǒng)(Wilks等，1989)。
(v)運(yùn)用本發(fā)明編碼的蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段或衍生物的另一方法是在親和層折方法中使用它們來分離和鑒定它們能結(jié)合的其他蛋白或因子，例如，與TRAF2相關(guān)的蛋白或參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的其他蛋白和因子。在此種應(yīng)用中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)其同工型、類似物、片段或衍生物可分別連接于親和層析基質(zhì)上，然后與細(xì)胞抽提物或懷疑參與胞內(nèi)信號傳遞的分離的蛋白質(zhì)或因子接觸，親和層析后可洗脫、分離和特性分析結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)、其類似物、片段或衍生物的其他蛋白質(zhì)和因子。
(vi)如上述，本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其類似物、片段或衍生物還可用作免疫原(抗原)來產(chǎn)生其特異性抗體。也可用這些抗體，從細(xì)胞抽提物或產(chǎn)生它們的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中，純化本發(fā)明蛋白質(zhì)、其類似物或片段。這些抗體還可用于診斷目的，以鑒定與該受體系統(tǒng)功能異常(如TRAF2誘導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)活性過高或低下)相關(guān)的疾病。這類疾病應(yīng)與本發(fā)明蛋白質(zhì)所涉及的胞內(nèi)信號傳遞功能障礙相關(guān)，故這些抗體可作為重要診斷工具。術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAb)、嵌合性抗體、抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體?？梢钥扇苄曰蚪Y(jié)合形式標(biāo)記抗體及其片段，如缺乏完整抗體Fc段的Fab和F(ab’)2片段，它們能結(jié)合抗原。
(vii)本發(fā)明有用的抗體及其片段可用于定性或定量檢測樣品中本發(fā)明的克隆，或檢測表達(dá)本發(fā)明克隆的細(xì)胞是否存在。這可采用熒光標(biāo)記抗體結(jié)合光學(xué)顯微鏡，流式細(xì)胞計數(shù)或熒光分光檢測的免疫熒光技術(shù)來實(shí)施。
本發(fā)明有用的抗體及其片段可用于免疫熒光或免疫電鏡進(jìn)行組織學(xué)原位檢測本發(fā)明的克隆?？刹杉∪说慕M織標(biāo)本，在該標(biāo)本中加入本發(fā)明的標(biāo)記抗體進(jìn)行這種原位檢測。宜向生物樣品施涂或覆蓋的形式加入標(biāo)記抗體(或片段)來提供抗體(或片段)，通過應(yīng)用此法，不僅可能測定該克隆的存在，還可了解其在所檢查組織中的分布?？刹捎帽景l(fā)明普通技術(shù)人員不難懂得的改進(jìn)的各種各樣組織學(xué)方法(如染色法)，以實(shí)現(xiàn)這種原位檢測。
本發(fā)明克隆的這種試驗(yàn)一般包括在能鑒定該編碼蛋白質(zhì)的標(biāo)記抗休存在下培育生物樣品，如生物液體、組織抽提物、新鮮收獲的細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞)或已在組織培養(yǎng)中的細(xì)胞，并以本領(lǐng)域熟知的許多技術(shù)之一檢測該抗體。
(viii)本發(fā)明編碼的蛋白質(zhì)憑借其結(jié)合其他胞內(nèi)蛋白的能力也可用作許多其他蛋白的間接調(diào)節(jié)劑，該其他胞內(nèi)蛋白直接結(jié)合的還有其他胞內(nèi)蛋白或跨膜蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
為了調(diào)節(jié)這些其他胞內(nèi)蛋白或跨膜蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，可將本明蛋白質(zhì)以(ii)中所述許多方法導(dǎo)入細(xì)胞中。還應(yīng)明白可用一種熟知的標(biāo)準(zhǔn)篩選方法進(jìn)行本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離鑒定和特征分析。例如，這些篩選方法之一，酵母雙雜交方法可用于鑒定本發(fā)明的蛋白質(zhì)。同樣可采用其他方法，如親和層析、DNA雜交等本領(lǐng)域熟知的方法來分離鑒定和特征分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或分離、鑒定和特征分析能結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的其他蛋白質(zhì)、因子、受體等。
而且，可以上述和下述采用本發(fā)明蛋白質(zhì)的類似方式來使用所發(fā)現(xiàn)的能結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，以分離、鑒定和特征分析能結(jié)合本發(fā)明結(jié)合性蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的其他蛋白質(zhì)、因子等，和可代表參與相關(guān)信號傳遞過程還要下游的因子，或可能具有它們的信號傳遞活性而因此代表參與不同信號傳遞過程的蛋白質(zhì)。
可通過任何標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法(見Sambrook等1989)產(chǎn)生本發(fā)明的DNA序列及編碼蛋白質(zhì)，在此法中用含有這些蛋白質(zhì)的編碼序列的適當(dāng)?shù)恼婧嘶蛟溯d體轉(zhuǎn)化適合的真核或原核宿主細(xì)胞。因此本發(fā)明還涉及到產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的這類表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化的宿主。如上所述，這些蛋白質(zhì)也包括它們的生物活性類似物、片段和衍生物，編碼它們的載體也包括編碼這些蛋白質(zhì)的類似物和片段的載體，轉(zhuǎn)化的宿主包括產(chǎn)生這些類似物和片段的那些宿主。這些蛋白質(zhì)的衍生物是通過對該蛋白質(zhì)或其類似物或片段進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)修飾，由轉(zhuǎn)化的宿主產(chǎn)生的衍生物。
本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)TRAF2介導(dǎo)的效應(yīng)的藥物組合物，該藥物組合物含有任一種或多種以下活性成分(i)亞克隆入一適當(dāng)表達(dá)載體的本發(fā)明的一種或多種DNA序列及其部分；(ii)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其生物活性片段、類似物、衍生物或它們的混合物(iii)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)、其生物活性片段、類似物或衍生物的重組動物病毒載體。
該藥物組合物可用于治療疾病，對病人的有效量取決于體重和其他因素，由醫(yī)師決定。
如上所述，本發(fā)明TRAF結(jié)合蛋白的一個具體實(shí)施例是TRAF2-結(jié)合蛋白IREN。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)是IREN能特異性地與TRAF2結(jié)合，并因而是TRAF2的介質(zhì)/調(diào)節(jié)劑，因此IREN能夠介導(dǎo)/調(diào)節(jié)TRAF2在NF-κB激活過程中的活性，所以它在細(xì)胞存活途徑中可能通過TRAF2獨(dú)立地或與其他蛋白質(zhì)(如p55TNF和p75 TNF受體、FAS/APOl受體、MORT-1、RIP和TRADD)一起發(fā)揮功能而起作用?；诒景l(fā)現(xiàn)，按需要設(shè)計出能夠增強(qiáng)或抑制TRAF2-IREN相互作用的藥物是至關(guān)重要的。例如，當(dāng)需要調(diào)節(jié)TNF所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性時，就可以通過調(diào)節(jié)TRAF2-IREN的相互作用或通過特異性地調(diào)節(jié)TRAF2和/或IREN，從而調(diào)節(jié)NF-κB的誘導(dǎo)作用。同樣，例如當(dāng)需要調(diào)節(jié)TNF所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性時，就可以通過調(diào)節(jié)TRAF2-IREN的相互作用或通過調(diào)節(jié)TRAF2和/或IREN對NF-κB的特異性誘導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)NF-κB的誘導(dǎo)作用。這類藥物對許多疾病有很大幫助。這其中(請參見上面的論述)包括急性肝炎，其中對肝臟的急性損傷似乎反映了在受FAS配體誘導(dǎo)之后FAS/APOl受體所介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞死亡情況；自身免疫所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，例如會導(dǎo)致糖尿病的胰腺βLangerhans細(xì)胞死亡；在移植物(如腎臟、心臟和肝臟)排斥中的細(xì)胞死亡；在多發(fā)性硬化癥中的腦少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡；和艾滋病抑制的T細(xì)胞自殺，這造成了艾滋病病毒的增殖并導(dǎo)致艾滋病的產(chǎn)生。
IREN或其一種或多種可能的具有生物學(xué)活性的同工型、類似物或片段，可能作為IREN本身或IREN-TRAF2相互作用的“天然”抑制劑，并因此可以作為對NF-κB激活作用的抑制劑。因此，這些調(diào)節(jié)劑可用作如上所述的特異性調(diào)節(jié)劑，例如在需要增加TNF細(xì)胞毒效應(yīng)時所使用的調(diào)節(jié)劑。事實(shí)上，正如下面例示的那樣，根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)分離出了各種不同的IREN類似物和突變蛋白，它們能夠調(diào)節(jié)NIK、NEMO和IKK-1及其片段所介導(dǎo)的對NF-κB激活的誘導(dǎo)作用。以及阻斷細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)、佛波醇豆蔻酸乙酸酯(phorbolmyristate acetate)、HTLV-1蛋白TAX所介導(dǎo)的誘導(dǎo)作用。同樣，還可篩選其他物質(zhì)如肽、有機(jī)化合物、抗體等，以獲得能夠抑制TRAF2-IREN相互作用或IREN活性的特異性藥物。
按類似方式，在如上所述的各種需要調(diào)節(jié)NF-κB激活作用的情況下，可以通過例如本文上述的各種標(biāo)準(zhǔn)方法(例如將編碼IREN和/或TRAF2的DNA引入細(xì)胞以調(diào)節(jié)表達(dá)，或者制備合適的含有IREN和/或TRAF2的制劑以便直接引入細(xì)胞，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何其他方法)，來調(diào)節(jié)IREN和/或TRAF2在細(xì)胞中的數(shù)量。同樣，還可篩選其他物質(zhì)如肽、有機(jī)化合物等，以獲得能夠增強(qiáng)IREN活性或增強(qiáng)TRAF2-IREN相互作用的特異性藥物。
一種如何來設(shè)計和篩選IREN-TRAF2相互作用的肽調(diào)節(jié)劑的、不起限定作用的例子，是根據(jù)早先對ICE或ICE樣蛋白酶的肽抑制劑、ICE的底物特異性的研究結(jié)果以及通過肽合成技術(shù)進(jìn)行表位分析的策略。已發(fā)現(xiàn)，ICE有效切割某個肽的最低要求，涉及在切割位點(diǎn)左側(cè)的4個氨基酸，并且在P1位置強(qiáng)烈優(yōu)選天冬氨酸和在P1位的右側(cè)有足夠的甲胺(Sleath等人1990；Howard等人，1991；Thornberry等人，1992)。此外，一種縮寫為Ac-DEVD-AMC的熒光團(tuán)底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a(4-甲基-香豆酰-7-酰胺)，對應(yīng)于一段聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，此底物在FAS-R刺激和其他調(diào)亡過程(Kaufmann，1989；Kaufmann等人，1993；Lazebnik等人，1994)之后不久就發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞中被切割，而且該底物可被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一個成員)和MACH蛋白酶有效地切割。
因?yàn)樵诘孜颬1位的天冬氨酸顯得很重要，所以第四個氨基酸殘基為天冬氨酸并且在前3個殘基位置上有各種不同組合的四肽，便可以被快速地篩選是否能結(jié)合于蛋白酶的活性位點(diǎn)，例如采用Geysen開發(fā)的技術(shù)(Geysen，1985；Geysen等人，1987)，在該技術(shù)中對位于固相載體上的大量肽進(jìn)行篩選，確定它們是否與抗體有特異性的相互作用。MACH蛋白酶與特異性肽的結(jié)合，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員技能范圍之內(nèi)各種熟知的檢測方法(例如放射標(biāo)記法)來進(jìn)行檢測。已表明，Geysen的這種方法能夠在每個工作日至少測試4000種肽。
按類似的方式，能夠闡明TRAF2與IREN之間(或任何其他TRAF蛋白與TRAF結(jié)合蛋白之間)相互作用的準(zhǔn)確的結(jié)合區(qū)域或者同源區(qū)域，然后可以篩選能用于阻斷該相互作用的肽，例如合成的、序列類似于結(jié)合區(qū)域或互補(bǔ)于結(jié)合區(qū)域的肽，從而使該肽能夠與天然IREN(或TRAF2結(jié)合蛋白)競爭與TRAF2(或TRAF)的結(jié)合。
由于設(shè)計能夠選擇性地抑制TRAF2-IREN(或TRAF-TRAF結(jié)合蛋白)之間的相互作用，而不干擾胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑所涉及的其他成員(例如細(xì)胞死亡途徑中的MACH蛋白酶，它是CED3/ICE蛋白酶家族的成員)的生理性細(xì)胞死亡過程的肽抑制劑是有利的，所以可進(jìn)一步合成在分析(例如上述的某種分析)中能結(jié)合于TRAF2(或TRAF)或IREN(或IRAF-結(jié)合蛋白)的肽庫，以便作為熒光底物肽來測試與這些其他蛋白質(zhì)的選擇性結(jié)合情況，從而選擇出僅對TRAF2/IREN(或TRAF/TRAF-結(jié)合蛋白)特異結(jié)合的種類。例如，然后，經(jīng)確定對TRAF2/IREN特異的肽可以被修飾以提高細(xì)胞通透性并可逆或不可逆地抑制TRAF2和/或IREN的活性。Thornberry等人(1994)報道了一種四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2，6-(CF3)]Ph，它是ICE的強(qiáng)失活劑。類似地，Milligan等人(1995)報道，具有氯甲基酮基團(tuán)的四肽抑制劑(不可逆地)或具有醛基團(tuán)的四肽抑制劑(可逆地)，會抑制ICE。此外，已表明芐氧基羧基-Asp-CH2OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等人，1995)。因此，按類似方式，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(O)-DCB基團(tuán)，對選擇性地結(jié)合于例如TRAF2或IREN的四肽進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生TRAF2/IREN活性的肽抑制劑。此外，為了提高通透性，例如可以對肽進(jìn)行化學(xué)修飾或衍生處理，以提高它們通過細(xì)胞膜的通透性，并協(xié)助將這些肽運(yùn)送通過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。Muranishi等人(1991)報道了用月桂酸對促甲狀腺素釋放激素進(jìn)行衍生處理，形成了一種親脂的、具有良好的通過細(xì)胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等人(1991)還報道，將甲硫氨酸氧化成亞砜并用其酮亞甲基異酯(COCH2)(ketomethylene isoester)代替肽鍵，以幫助肽轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜。這些方法僅僅是本領(lǐng)域技術(shù)人員技能之內(nèi)的、已知的修飾和衍生方法中的一部分而已。
此外，能夠抑制例如IREN活性(通過抑制IREN-TRAF2相互作用、TRAF蛋白和TRAF-結(jié)合蛋白之間相互作用等)的藥物或肽抑制劑，可以與協(xié)助進(jìn)入細(xì)胞的分子進(jìn)行偶連或復(fù)合，美國專利No.5,149,782公開，可以將待運(yùn)輸通過細(xì)胞膜的分子與膜共混劑偶連在一起，這些膜共混劑有例如融合多肽、形成離子通道的多肽、其他膜多肽、和長鏈脂肪酸如肉豆蔻酸和棕櫚酸。這些膜共混劑將分子偶連物插入細(xì)胞膜的脂類雙分子層中，然后協(xié)助它們進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
Low等人的美國專利5,108,921回顧了通過受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制來跨膜運(yùn)送分子(例如，但并不僅限于，蛋白質(zhì)、核酸)的已有方法。這些受體系統(tǒng)包括那些識別下列物質(zhì)的系統(tǒng)半乳糖、甘露糖、6-磷酸-甘露糖、運(yùn)鐵蛋白、脫唾液酸糖蛋白、鈷胺傳遞蛋白(維生素B12)、α-2巨球蛋白、胰島素和其他的肽生長因子如表皮生長因于(EGF)。Low等人講授，營養(yǎng)物的受體如生物素和葉酸的受體，可有利地被用于增強(qiáng)通過細(xì)胞膜的運(yùn)輸，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)細(xì)胞的膜表面上存在生物素和葉酸受體的信號及多種生物素和葉酸受體并且有相應(yīng)受體介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸過程。因此，待輸送入細(xì)胞質(zhì)的化合物與配體如生物素或葉酸間所形成的復(fù)合物，與具有生物素或葉酸受體的細(xì)胞膜接觸之后，就啟動了受體所介導(dǎo)的跨膜運(yùn)輸機(jī)制，并從而允許所需的化合物進(jìn)入細(xì)胞。
已知ICE能夠容忍P2位置上自由替換，而且這種對自由替換的容忍性被加以利用，以開發(fā)強(qiáng)有力的和高選擇性的、具有生物素標(biāo)記的親和標(biāo)記物(Thornberry等人，1994)。因此，可以對P2位以及可能可以對四肽抑制劑的N-端進(jìn)行修飾或衍生處理，例如添加生物素分子，從而提高這些肽抑制劑通過細(xì)胞膜的通透性。此外，在本領(lǐng)域中知曉，可以將所需的肽序列與引導(dǎo)肽/信號肽序列融合在一起以產(chǎn)生”嵌合肽”，這樣就能夠使“嵌合肽”被運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
正如肽領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的那樣，根據(jù)本發(fā)明，TRAF-TRAF結(jié)合蛋白的相互作用(如TRAF2-IREN相互作用)的肽抑制劑，包括肽模擬型的藥物和抑制劑，它們可以被快速地加以篩選，以確定是否與例如TRAF2/IREN相結(jié)合，從而設(shè)計出可能更穩(wěn)定的抑制劑。
還應(yīng)理解的是，上述的用于協(xié)助或增強(qiáng)肽抑制劑被運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜的相同手段，也可被用于TRAF-結(jié)合蛋白，例如IREN，其類似物、其片段或其同種型，以及在胞內(nèi)發(fā)揮它們功效的其他肽和蛋白質(zhì)。
至于在此處全文中提及的抗體，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、嵌合抗體、針對能夠以可溶或固定形式被標(biāo)記的抗體的抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體、以及用各種已知技術(shù)產(chǎn)生的它們的片段，例如(但并不限于)酶切、肽合成或重組技術(shù)。
多克隆抗體是異質(zhì)的抗體分子群體，它們來自用抗原免疫的動物血清。單克隆抗體含有基本上均質(zhì)的對抗原特異的抗體群體，該群體含有基本相似的表位結(jié)合位點(diǎn)，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來獲得單克隆抗體。參見例如Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975)；美國專利No.4,376,110；Ausubel等人編，Harlow and Lane，ANTIBODIESA LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等人編，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience N.Y.，(1992-1996)，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容都全都在此引用作為參考。這些抗體可以是任何種類的免疫球蛋白，其中包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD和它們的任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以在體外、原位或體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。在體內(nèi)或原位下生產(chǎn)高效價單克隆抗體，是目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
嵌合抗體是這樣的分子，該分子的不同部分來自不同的動物物種，例如具有鼠單克隆抗體的可變區(qū)以及人的免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。嵌合抗體主要用于降低應(yīng)用中的免疫原性以及增加產(chǎn)量。例如在雜交瘤產(chǎn)生的鼠單克隆抗體具有較高效率，但在人中也具有更高免疫原性的情況下，可以使用這種人/鼠嵌合單克隆抗體。嵌合抗體及其生產(chǎn)方法在本領(lǐng)城中是已知的(Cabilly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813273-3277(1984)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984)；Boulianne等人，Nature，312643-646(1984)；Cabilly等人，歐洲專利申請125023(1984年11月14日出版)；Neuberger等人，Nature，314268-270(1985)；Taniguchi等人，歐洲專利申請171496(1985年2月19日出版)；Morrison等人，歐洲專利申請173494(1986年3月5日出版)；Neuberger等人，PCT申請WO 8601533(1986年3月13日出版)；Kudo等人，歐洲專利申請184187(1986年6月11日出版)；Sahagan等人，J.Immunol 1371066-1074(1986)；Robinson等人，國際專利申請No。WO8702671(1987年5月7日出版)；Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443(1987)；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218(1987)；Better等人，Science 2401041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，ANTIBODIESA LABORATORY MANUAL，同上)。這些文獻(xiàn)全部在此引用作為參考。
抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體是這樣的抗體，它識別通常與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的獨(dú)特決定簇。Id抗體的制備，是通過免疫與單克隆抗體來源動物相同物種和基因型的動物(例如小鼠品種)，其中該單克隆抗體就是制備的抗-Id所要針對的。被免疫的動物會識別免疫抗體的獨(dú)特型決定簇，并通過產(chǎn)生針對這些獨(dú)特型決定簇的抗體(抗-Id抗體)而進(jìn)行應(yīng)答。參見例如美國專利NO.4,699,880，該專利全部在此引用作為參考。
抗-Id抗體還可用作“免疫原”，在另一動物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，以產(chǎn)生所謂的抗-抗-Id抗體。該抗-抗-Id抗體與最初誘導(dǎo)抗-Id的單克隆抗體在表位方面會相同。因此，通過使用針對mAb的獨(dú)特型決定簇的抗體，可以鑒別出表達(dá)具有相同特性的抗體的克隆。
因此，本發(fā)明生產(chǎn)的針對IREN、其同工型，其類似物、其片段或衍生物的單克隆抗體，可用于在合適的動物如BALB/c小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗-Id抗體。可使用來自該被免疫小鼠的脾細(xì)胞，來產(chǎn)生分泌抗-Id mAb的抗-Id雜交瘤。此外，抗-Id mAb還可被偶連于載體如匙孔嘁血藍(lán)蛋白(KLH)上，然后再用于免疫其他的BALB/c小鼠。來自這些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗體，該抗體具有最初單克隆抗體的結(jié)合特性，并對上述的IREN蛋白、其類似物、其片段或其衍生物的表位是特異的。
這樣，抗-Id mAb就具有它們自有的獨(dú)特型表位即結(jié)構(gòu)上與被評價的表位相類似的獨(dú)特位(idiotopes)，如GRB蛋白-a。
術(shù)語“抗體”還包括完整的分子及其片段兩者，例如能夠結(jié)合抗原的Fab和F(ab’)2。Fab和F(ab’)2片段缺少完整抗體的Fc片段，能夠快速地從循環(huán)系統(tǒng)中被清除，并且與完整抗體相比具有更低的非特異性組織結(jié)合特性(Wahl等人，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
應(yīng)理解，根據(jù)本發(fā)明公開的用于完整抗體分子的方法，本發(fā)明中有用的Fab和F(ab’)2以及其他的抗體片段，可用于檢測和定量分析IREN蛋白。這些片段通?？墒褂美缒竟系鞍酌?產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)等酶的蛋白酶解切割而產(chǎn)生。
如果一種抗體能特異性地與某分子反應(yīng)從而使該分子與該抗體結(jié)合，那么就稱該抗體“能夠結(jié)合”該分子。術(shù)語“表位”指任何分子中能夠被抗體識別而且也能被抗體結(jié)合的部分。表位或“抗原決定族”通常是由分子表面的化學(xué)活性基團(tuán)如氨基酸或糖的側(cè)鏈所構(gòu)成，而且具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征和特異的電荷特征。
“抗原”是能夠被抗體結(jié)合的、并且還能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生抗體(該抗體能夠結(jié)合于該抗原的表位)的分子或分子的一部分?？乖删哂幸粋€或一個以上表位。上述的特異反應(yīng)指抗原會以高度選擇性的方式與其相應(yīng)的抗體反應(yīng)，而不會與許多由其他抗原所產(chǎn)生的其他抗體反應(yīng)，本發(fā)明中所使用的抗體(包括抗體片段)可以定量或定性地檢測樣品中的IREN蛋白，或者檢測是否存在表達(dá)本發(fā)明中IREN蛋白的細(xì)胞。這可以用免疫熒光技術(shù)，采用熒光標(biāo)記的抗體(參見下面)并結(jié)合光學(xué)顯微術(shù)、流式細(xì)胞計量術(shù)或熒光計量術(shù)檢測來實(shí)現(xiàn)。
在組織學(xué)上，可使用本發(fā)明所用的抗體(或其片段)，如在免疫熒光或免疫電子顯微鏡中，來原位檢測本發(fā)明的IREN蛋白。原位檢測可這樣進(jìn)行取一份病人的組織樣品，然后將標(biāo)記的本發(fā)明抗體提供給該樣品；抗體(或其片段)的提供宜通過將標(biāo)記的抗體(及其片段)施涂或覆蓋在生物樣品上。通過使用這一程序，不僅可以確定是否存在IREN蛋白，而且可以確定其在受檢組織中的分布。使用本發(fā)明，一般技術(shù)人員會很容易地知道，各種不同的組織學(xué)方法(例如染色程序)都能被加以修改以實(shí)現(xiàn)這種原位檢測。
這些分析本發(fā)明IREN蛋白的方法通常包括將生物樣品如生物液體、組織提取物、新收獲的細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞)、或在組織培養(yǎng)中孵育過的細(xì)胞，與能夠鑒別IREN蛋白的可檢測標(biāo)記抗體一起溫育，然后用本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任一種來檢測抗體。
生物樣品可以用固相支持物或載體如硝酸纖維素，或者用能夠固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍椎钠渌滔嘀С治锘蜉d體來進(jìn)行處理，然后用合適的緩沖液洗滌該支持物或載體，再根據(jù)本發(fā)明如上所述的那樣用可檢測的標(biāo)記抗體進(jìn)行處理。再用緩沖液第二次洗滌該固相支持物或載體，以去除未結(jié)合的抗體，接著用常規(guī)方法檢測所述固相載體或載體上所結(jié)合的標(biāo)記的數(shù)量。
“固相支持物”、“固相載體”、“固體支持物”、“固體載體”、“支持物”、“載體”指任何能夠結(jié)合抗原或抗體的支持物或載體。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍淀粉酶、天然的或改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵石。對于本發(fā)明目的，載體的性質(zhì)可以是不溶的，或者有某種程度的可溶性。支持物材料幾乎可以包括實(shí)際上任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型，只要所偶連的分于能夠結(jié)合于抗原或抗體。因此，支持物或載體的結(jié)構(gòu)可以是球形(如珠)、圓柱形(如試管的內(nèi)表面或棒的外表面)?；蛘?，表面可以是平坦的，如板、測試條帶等，優(yōu)選的支持物或載體包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道可用于結(jié)合抗體或抗原的其他合適載體，并且能夠通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定這些載體。
如上所述的本發(fā)明的某批抗體的結(jié)合活性，可以用眾所周知的方法進(jìn)行測定。通過采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定每次測定的操作條件和最佳試驗(yàn)條件。
其他的步驟，諸如洗滌、攪拌、振蕩、過濾等，可以被增加到分析方法中，并且這些步驟都是常規(guī)的或是具體情況下所必需的。
本發(fā)明的抗體能夠被標(biāo)記的一種方法是將該抗體與酶相連，進(jìn)行酶免疫分析(EIA)。然后，當(dāng)該酶暴露于合適的底物時，酶會與底物反應(yīng)，從而產(chǎn)生可被檢測(例如通過分光光度分析、熒光分析、或肉眼觀察)的化學(xué)組分子。能夠用于可檢測地標(biāo)記抗體的酶包括(但并不限于)蘋果酸脫氫醇、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸酯脫氫酶、丙糖磷酸酯異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。采用酶的生色團(tuán)底物，利用比色方法就可以完成檢測。檢測的實(shí)現(xiàn)，還可以通過將酶與底物反應(yīng)的程度與類似方法制備的標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行肉眼比較。
檢測還可用各種其他的免疫分析方法實(shí)現(xiàn)。例如，通過放射性標(biāo)記抗體或抗體片段，就可以通過采用放射免疫分析法(RIA)來檢測R-PTP酶。對于RIA的全面描述可在Laboratory Techniques and Biochemistrv in MolecularBiology，Work，T.S.等人，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其參見Chard，T.所寫的標(biāo)題為“An Introduction to RadioimmuneAssay and Related Techniques(放射免疫分析和相關(guān)技術(shù)的介紹)”的章節(jié)，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。放射性同位素可用g計數(shù)器或閃爍計數(shù)器等設(shè)備，或通過放射性自顯影而進(jìn)行檢測。
也可以用熒光化合物來標(biāo)記本發(fā)明的抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體被暴露于適當(dāng)波長的光時，就能因熒光而檢測出其存在與否。在最常用的熒光標(biāo)記化合物中，有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、綠膿菌素、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
抗體還可以用發(fā)出熒光的金屬如152E或其他鑭系金屬進(jìn)行標(biāo)記?？捎眠@些金屬的整合基團(tuán)如二亞乙基三胺五乙酸(ETPA)使之附著于抗體。
還可以通過將抗體偶連于化學(xué)發(fā)光化合物，對抗體進(jìn)行可檢測標(biāo)記。然后，帶有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體的存在與否，可通過檢閱在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生發(fā)光的情況而進(jìn)行檢測。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子是魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)、熱吖啶嗡酯(theromatic acridiniumester)、咪唑、吖啶嗡鹽(acridinium salt)和草酸酯。
同樣，還可以用生物發(fā)光化合物來標(biāo)記本發(fā)明抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在，可通過檢測發(fā)光而加以確定，用于標(biāo)記用途的重要生物發(fā)光化合物是熒光素(luciferin)、熒光素酶和水母蛋白。
本發(fā)明的抗體分子可用于免疫測量分析，也以“雙位點(diǎn)”或“夾心分析”為人們所知。在典型的免疫測量分析中，將一定量的未標(biāo)記抗體(或抗體片段)結(jié)合于固體支持物或載體上，然后加入一定量可檢測的被標(biāo)記可溶抗體，從而可以檢測和/或定量分析在固相抗體、抗原和標(biāo)記抗體之間形成的三元復(fù)合物。
典型的(且優(yōu)選的)免疫測量分析包括“正向”分析法，在該分析法中固定在固相上的抗體先與測試樣品接觸，從而通過形成二元的固相抗體-抗原復(fù)合物而將抗原從樣品中取出。在溫育合適時間之后，洗滌固相支持物或載體以去除殘留的液體樣品(包括未反應(yīng)的抗原，如果有的話)，然后再與含有未知數(shù)量的標(biāo)記抗體(功能為“報道分子)的溶液接觸。在第二次溫育以便讓標(biāo)記抗體，與通過未標(biāo)記抗體而結(jié)合于固相支持物或載體上的抗原進(jìn)行復(fù)合之后，第二次洗滌固相支持物或載體，以去除未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。
在另一種“夾心”分析法(該方法可與本發(fā)明的抗原一起使用)中，使用所謂的“同時”和“反向”分析。同時分析包括一個簡單的溫育步驟，因?yàn)楣潭ㄓ诠滔嘀С治锘蜉d體的抗體和標(biāo)記抗體兩者被同時加入到測試樣品中。在溫育結(jié)束之后，洗滌固相支持物或載體以去除殘余的液體樣品或未復(fù)合的標(biāo)記抗體，然后再像常規(guī)“正向”夾心分析那樣，測定與固相支持物或載體相連的標(biāo)記抗體的存在。
在“反向”分析中，按步驟先將標(biāo)記抗體溶液加至液體樣品中，然后在溫育適當(dāng)時間之后，再加入固定于固相支持物或載體的未標(biāo)記抗體。在第二次溫育之后，以常規(guī)方式洗滌固相載體，以洗去殘余的測試樣品和未反應(yīng)的標(biāo)記抗體溶液。再象“同時”或“正向”分析那樣測定與固體支持物或載體相連的標(biāo)記抗體。
如上所述，本發(fā)明還涉及含有重組動物病毒載體的藥物組合物，該載體編碼IREN蛋白，還編碼能夠結(jié)合于特定靶細(xì)胞(如癌癥細(xì)胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，從而能引導(dǎo)IREN蛋白序列插入到細(xì)胞中。本發(fā)明作為活性成份的的另一類藥物組合物，其中包含(a)具有編碼IREN序列的反義序列的寡核苷酸序列；或(b)阻斷IREN蛋白與TRAF相互作用的藥物。
本發(fā)明的藥物組合物含有足夠數(shù)量的活性成分以達(dá)到其所需用途。此外，藥物組合物還可含有合適的藥學(xué)上可接受的載體，其中包括賦形劑和輔助劑，它們可協(xié)助將活性化合物加工成可作為藥物使用的制劑，并且它們可使制劑給所需對象施用時更穩(wěn)定。這些都是本領(lǐng)城技術(shù)人員所熟知的。
IREN蛋白及其同工型或同種型，被懷疑在不同組織中以明顯不同的水平進(jìn)行表達(dá)，而且與各種在胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑所涉及的其他蛋白質(zhì)的表達(dá)相類似的方式，具有不同形式的同種型。這正如在上述共同擁有且都未審定的專利申請中所指出的那樣。這些差別可能對FAS/APOl-配體和TNF應(yīng)答的組織特異性特征有影響。正如其他CED3/ICE同源物(Wang等人，1994；Alnemri等人，1995)，本發(fā)明人在以前(在上述的專利申請中)已表明含有不完整CED3/ICE區(qū)域的MACH同工型(如MACHα3)，被發(fā)現(xiàn)對共表達(dá)的MACHα1或MACHα2分子的活性有抑制作用；它們還被發(fā)現(xiàn)可阻斷FAS/APOl和p55-R的死亡誘導(dǎo)過程。在細(xì)胞中表達(dá)這些抑制性的同工型可形成一個細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，以對付FAS/APOl和TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。MACH同工型的廣泛非均一性(這種非均一性大大超過了CED3/ICE家族中任何其他蛋白酶中所觀察到的情況)，應(yīng)能允許對活性MACH同工型的功能進(jìn)行極其精細(xì)的調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明，已分離出了TRAF-結(jié)合蛋白IREN的類似物/突變蛋白。這些IREN類似物/突變蛋白(參見上面的論述和下面的實(shí)施例)，例如NF-κB活性調(diào)節(jié)的缺失的IREN突變體。因此，如上所述，按照它們與TRAF蛋白的相互作用以及它們對TRAF蛋白或TRAF所介導(dǎo)的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)所造成的影響，IREN蛋白或有可能其同工型在不同的組織中有不同的效應(yīng)。
還有可能某些可能的IREN同工型有一些其他功能。例如，IREN或某些IREN類似物或同工型還可作為某些分子的停靠位點(diǎn)起作用，而這些分子是在其他的，例如FAS/APOl和TNF受體通過與TRAF2的相互作用或甚至不依賴TRAF2而發(fā)揮非細(xì)胞毒效應(yīng)中所涉及的分子。
因?yàn)镕AS/APOl和TNF受體獨(dú)特的能夠造成細(xì)胞死亡的能力，以及TNF受體能夠引發(fā)其他導(dǎo)致組織破壞的活性的能力，所以這些受體功能發(fā)生異常對生物體就特別有害。事實(shí)上，這些受體的功能過度或缺陷都會導(dǎo)致表現(xiàn)出各種病癥病理表現(xiàn)(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鑒別出參與受體信號傳導(dǎo)活動的分子并找出調(diào)控這些分子活性的方法，就能夠指明新的治療途徑?？紤]到了TRAF蛋白(如TRAF2)可能的重要作用及在NF-κB激活調(diào)節(jié)過程中TRAF-IREN的相互作用，設(shè)計能夠調(diào)節(jié)TRAF2-IREN相互作用的藥物是特別重要的，當(dāng)需要?dú)缂?xì)胞(通過抑制NF-κB激活)，與之相反，當(dāng)需要保留細(xì)胞時，(增強(qiáng)NF-κB激活)。
本發(fā)明還涉及能夠結(jié)合于本發(fā)明的IREN蛋白并從而能夠調(diào)控/介導(dǎo)IREN蛋白活性的蛋白質(zhì)或其他配體。這些蛋白質(zhì)或配體可用上述的任何方法進(jìn)行篩選、分離和產(chǎn)生。例如，可以分離出大量新的、能夠結(jié)合于本發(fā)明IREN蛋白的配體(包括蛋白質(zhì))(這些新的蛋白質(zhì)/配體不包括已知的TRAF2和TRAF1)。
正如上面詳細(xì)論述，這些新的IREN蛋白-結(jié)合蛋白/配體如IREN-結(jié)合蛋白，可以作為例如IREN所介導(dǎo)的活性或例如TRAF2-IREN相互作用所介導(dǎo)的活性的抑制劑或增強(qiáng)劑，因此它們在上述的各種病理和其他情況中有著重要作用。這些IREN蛋白-結(jié)合蛋白/配體的另一功能是作為特異性的試劑用于純化IREN蛋白，例如通過親和色譜層析，其中將這些新的結(jié)合蛋白/配體附著在合適的層析基質(zhì)上，形成固相或親和支持物/基質(zhì)，然后讓含有了如IREN的溶液、提取物等通過，從而以這種方式協(xié)助純化。目前，這些親和色譜層析方法是本領(lǐng)域中眾所周知的并且通常是標(biāo)準(zhǔn)化的工藝。
同樣，本發(fā)明的所有上述IREN蛋白、其類似物、其片段、其同工型和衍生物，可用于通過親和色譜層析來純化各種與它們發(fā)生結(jié)合的TRAF蛋白。例如，IREN、其類似物、其片段和IREN的突變蛋白(參見下面的實(shí)施例)可用于親和色譜層析純化TRAF2。
現(xiàn)在結(jié)合下面不起限定作用的實(shí)施例和附圖，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
還應(yīng)注意下列程序i)雙雜交篩選和雙雜交β-半乳糖苷酶表達(dá)測試；ii)蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)、代謝標(biāo)記和免疫沉淀；iii)體外結(jié)合；iv)細(xì)胞毒性的測定；和v)Northern分析和序列分析，以及在下列實(shí)施例中所用的其他程序，在本發(fā)明人以前關(guān)于其他胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白和途徑的出版物(參見例如Boldin等人，1995a、1995b和Boldin等人1996)中已有詳細(xì)描述。這些程序在共同擁有和待批的以色列申請Nos.114615、114986、115319、116588、117932和120367，以及相應(yīng)的PCT申請No.PCT/US96/10521中也有詳細(xì)描述。因此，所有這些出版物和專利申請的全部公開內(nèi)容在本申請中被完全引用而包括，至少只要涉及詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)程序時被引用而包括。
實(shí)施例材料和方法i)cDNA文庫a)B細(xì)胞cDNA文庫使用來自人B細(xì)胞并用寡聚dT為引物所構(gòu)建的文庫(Durfee等人，1993)，將文庫的cDNA插人基于pACT的載體pSE1107的XboI位點(diǎn)中，與GAL4的激活結(jié)構(gòu)域相融合。
b)λgt10睪丸cDNA文庫使用來自人睪丸的cDNA文庫。該文庫是以隨機(jī)的六聚核苷酸為引物所建的文庫，平均插入片段大小為200-400bp。
ii)酵母菌株在轉(zhuǎn)化和篩選中使用兩種酵母菌株作宿主菌株HF7c菌株被用于雙雜交篩選，SFY526菌株被用于β-半乳糖苷酶分析。兩種菌株都攜帶營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記trp1和leu2，就是說這些酵母菌株不能在缺少色氨酸和亮氨酸的極限合成培養(yǎng)基中生長，除非它們被含有這些基因(TRP1，LEU2)的野生型的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化。這兩種酵母菌株在其GAL4和GAL80基因中帶有缺失突變(分別為gal4-542和gal80-538突變)。
SFY526和HF7c菌株在它們的基因型中攜帶lacZ報道基因，在SFY526菌株中被融合于UAS和GAL1啟動子的TATA部分，在HF7c中3個拷貝的GAL417聚體的共有序列和CYC1啟動子的TATA部分被融合于lacZ。GAL1 UAS和GAL417聚體都會對GAL4轉(zhuǎn)錄激活物作出響應(yīng)。此外，HF7c菌株攜帶融合于UAS和GAL1啟動子的TATA部分的HIS3報道基因。
iii)人TRAF2的克隆人TRAF2是從HL60 cDNA文庫中，通過PCR而克隆到的(對于TRAF2序列和其他細(xì)節(jié)，請參見Rothe等人，1994；Rothe等人1995a；Cheng等人，1996；Hsu等人1996；和Wallach，1996)。使用的引物是a)30堿基的正向引物CAGGATCCTCATGGCTGCAGCTAGCGTGAC(SEQ ID No1)，該引物對應(yīng)于hTRAF2中從第一個甲硫氨酸(帶下劃線)的密碼子開始的編碼序列，并包含帶BamHI位點(diǎn)的接頭；b)32堿基的反向引物GGTCGACTTAGAGCCCTGTC AGGTCCACAATG(SEQ IDNo2)，該引物含有hTRAF2基因的終止密碼子(帶下劃線)，并且在接頭中有SalI限制性酶切位點(diǎn)。PCR程序是最初變性步驟為94℃，2分鐘，隨后為30個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃1分鐘，64℃1分鐘和72℃40秒。擴(kuò)增出的人TRAF2然后被插入到pGBT9載體的BamHI-SalI位點(diǎn)中，與GAL4 DNA結(jié)合域相連。
iv)B細(xì)胞文庫的雙雜交篩選雙雜交篩選是一種用于鑒別與某一特定分子(該分于被用作“誘餌”)有關(guān)的因子的技術(shù)(參見上述出版物和專利申請中的細(xì)節(jié))。在本發(fā)明中，被克隆入載體pGBT9的TRAF2被用作誘餌。TRAF2與篩選的B細(xì)胞cDNA文庫在酵母菌株HF7c中共表達(dá)。PCR所克隆的TRAF2是與GAL4 DNA結(jié)合域重組的融合蛋白，而被篩選的cDNA文庫被融合于pSE1107載體中的GAL4激活結(jié)構(gòu)域。在HF7c中的報道基因是HIS3，它被融合于會對GAL4轉(zhuǎn)錄激活物作出響應(yīng)的GAL1啟動子上游的激活序列(UAS)。含有pGBT9和pSE1107兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子會因能在無色氨酸和亮氨酸的手板上生長而被選擇出。在第二個步驟中，表達(dá)兩種雜合蛋白(這兩種蛋白會相互作用，從而激活GAL1-HIS3)的克隆，被從平板上挑出，其中該平板不含色氨酸、亮氨酸和組氨酸，并且含有50mM 3-氨基三唑(3AT)。
v)β-半乳糖苷酶分析按照Clontech Laboratories’s手冊(對于細(xì)節(jié)，可參見上述的出版物和專利申請)，對雙雜交篩選中被挑出的陽性克隆，在SFY526酵母細(xì)胞中進(jìn)行l(wèi)acZ顯色測試。簡而言之，讓轉(zhuǎn)化子在30℃生長2-4天，直到直徑達(dá)到約2毫米，然后將其轉(zhuǎn)移至Whatman濾膜上，對濾膜進(jìn)行凍/融處理以使細(xì)胞通透化，然后再浸泡在含有0.33毫克/毫升X-gal和0.35mM β-巰基乙醇的緩沖液(16.1毫克/毫升Na2HPO4.7H2O；5.5毫克/毫升NaH2PO4.H2O；0.75毫克/毫升KCl；0.75毫克/毫升MgSO4.7H2O，PH＝7)。監(jiān)視克隆是否顯現(xiàn)藍(lán)色，出現(xiàn)藍(lán)色就表示誘導(dǎo)了β-半乳糖苷酶。
vi)克隆cDNA的表達(dá)構(gòu)建兩種表達(dá)載體；a)基于pUHD10-3載體，它含有IREN的開放閱讀框(ORF)，并且該ORF與血凝素(Hemeaglutinine，HA)表位相融合。
b)基于pUHD10-3的載體，在該載體中FLAG的八肽序列被正好插入克隆的TRAF2前面，因而被命名為FLAG/B6/TRAF2。
用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣法(例如在Ausubel F.M.等人編的Current Protocols inMolecular Biology中所述的方法)，將含有IREN的ORF的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染入Hela的HtTA1克隆(對于這些細(xì)胞，參見Gossen，M.和Bujard，M.(1992))，該轉(zhuǎn)染或者單獨(dú)進(jìn)行，或者是與FLAG/B6/TRAF2進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
vii)熒光素酶分析通常，通過用冷PBS洗滌3次，然后再懸浮于400微升抽提緩沖液(0.1MK2HPO4/KH2PO4，pH＝7.8；1mM DTT)中收獲5×105個轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過在液氮中冰融3次而使細(xì)胞裂解，離心除去細(xì)胞碎片(10,000×g，5分鐘)。對于熒光素酶分析，將200微升熒光素酶緩沖液(25mM甘氨酰甘氨酸，15mMK2HPO4/KH2PO4，pH＝7.8，15mM MgSO4，4mM EDTA，2mM ATP，1mM DTT)加至50微升裂解液中。隨后，將100微升0.2mM D-熒光素、25mM甘氨酰甘氨酸、1mMDTT加至反應(yīng)體系。用Lumitron發(fā)光計裝置，通過讀取10秒內(nèi)的累積光發(fā)射，測定熒光素酶活性(對于其他細(xì)節(jié)，可參見上述的出版物和專利申請)。
實(shí)施例1IREN的克隆和雙雜交試驗(yàn)用材料和方法(iv)中所述的雙雜交技術(shù)，從B細(xì)胞制備的cDNA文庫中篩選與TRAF2相結(jié)合的蛋白，只有在既表達(dá)了TRAF2又表達(dá)了能與TRAF2相互作用的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化子，GAL4 DNA結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域才會結(jié)合在一起。結(jié)果是該報道基因被激活并表達(dá)，在該例子中HIS被融合入UAS和GAL1啟動子的TATA部分。
篩選到了約2000個能夠在Trp-、Leu-、His-3AT平扳上生長的克隆。從165個隨機(jī)挑選的陽性克隆中所制備的DNA，被用于與克隆在pGBT9載體中的TRAF2一起瞬時共同轉(zhuǎn)染SFY526酵母菌株，如材料和方法(v)中所述，對轉(zhuǎn)化的SFY526酵母克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性分析。顯現(xiàn)的藍(lán)色表示酵母菌落中含有能編碼與TRAF2結(jié)合的蛋白質(zhì)或多肽的cDNA。
根據(jù)它們在3AT平板上的生長能力以及在顯色測驗(yàn)中所測得的誘導(dǎo)lacZ的能力，鑒別到了能編碼新型蛋白IREN的6種獨(dú)立的克隆。在所檢測的陽性克隆中，2個是編碼已知蛋白的cDNA；TRAF2本身能夠自我締合并形成同源二聚體，以及淋巴毒素β-受體(已表明其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可結(jié)合TRAF2)。
對陽性克隆作進(jìn)一步的結(jié)合特異性試驗(yàn)分析，即分析它們與無關(guān)誘餌的相互作用情況。如表2所示，IREN僅與TRAF2和TRAF1反應(yīng)，而不結(jié)合于被分析檢驗(yàn)的多種無關(guān)蛋白中的任何一種，如核纖層蛋白(lamin)和細(xì)胞周期蛋白D(Cyclin D)。IREN也不結(jié)合于p55和p75 TNF受體的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，以及MORT、NIK、NIK突變體1-400、A20。
為了縮小與IREN相互反應(yīng)的TRAF2分子的區(qū)城，制備了另兩個構(gòu)建物，一個構(gòu)建物包括TRAF2分子的N端部分，即氨基酸1-224標(biāo)記為RING1-224，該部分包括了環(huán)指和鋅指基序。第二個構(gòu)建物僅含有TRAF2C末端部分，即氨基酸225-501，它覆蓋了“TRAF結(jié)構(gòu)域”和額外的42個氨基酸。在雙雜交試驗(yàn)中將這兩種構(gòu)建物用作誘餌。結(jié)果清楚地顯示，IREN不與含有TRAF2分子1-224位氨基酸的構(gòu)建物發(fā)生作用，但是它們都與含有“TRAF結(jié)構(gòu)域”的C末端的構(gòu)建物結(jié)合，而且與它們結(jié)合于全長TRAF2分子有相同效率(表2)。缺失分析表明IREN及其同工型的TRAF2結(jié)合區(qū)域局限于第198-388位的氨基酸區(qū)域(表2)。
表2IREN相互作用的酵母雙雜交試驗(yàn)

IREN cDNA的開放閱讀框編碼一個541個氨基酸的蛋白，同時其cDNA也包含有一個與聚腺苷酸一樣的短3’端UTR(圖3A和圖3B)。
IREN開放閱讀框的5’端結(jié)構(gòu)域被發(fā)現(xiàn)含有一段與另一已知蛋白(IDU73941，從Rap2結(jié)合蛋白的雙雜交篩選過程中克隆到的(Janoueix-Lerosey Iet al 1998))以及另外一些數(shù)據(jù)庫中找到的未知蛋白(如兩個人類基因KIAA0871、KIAA0842和一個C.Elegans基因ID CAA21666)有同源性的區(qū)域。
在IREN的序列中發(fā)現(xiàn)有一段存在于51個氨基酸結(jié)構(gòu)域中的肽序列(IDSLSL326-331)，此肽正好也穿越NIK的769-820位氨基酸，它對雙雜交試驗(yàn)中IKK-1與NIK的結(jié)合及NIK過量表達(dá)所引起的NF-κB激活都是必不可少的(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例2IREN的進(jìn)一步的研究和功能特性通過使用一個基于pcDNA3且包含融合有HA表位的IREN開放閱讀框的載體，使融合有HA表位的IREN cDNA表達(dá)在人腎細(xì)胞系293中，然后IREN與抗HA的抗體進(jìn)行免疫沉淀。
使用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣方法(方法參照Current protocols in MolecularBiology，eds.Ausubel，F(xiàn).M，等)，用IREN-HA蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后細(xì)胞在含有10％小牛血清的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)時間的末端，細(xì)胞溶解于放射免疫沉淀緩沖液中(10mMTris-HCl PH7.5，150mM NaCl，1％Nonident P-40，1％deoxycholate，0.1％SDS，1mM EDTA；1ml/5×105細(xì)胞)，用無關(guān)的兔抗血清和蛋白G-Sephorose珠(Pharmacia，Sweden)共孵育裂解物，進(jìn)行預(yù)處理。在4℃，用裂解物的上清和抗HA的單克隆抗體(clone 12CA5)Field，J等，1988)共孵育一個小時進(jìn)行免疫沉淀。表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠分析，接著用抗HA的抗體做WesternBlot免疫印跡，該IREN編碼的蛋白顯示出一條大約60KD的條帶。
用報道基因試驗(yàn)研究IREN對NF-κB激活作用。用含有連于熒光素酶報道基因的HIV LTR的pcDNA3載體，與僅含有IREN cDNA的pcDNA3質(zhì)粒，或與含有編碼下列蛋白(IKK-1、全長NEMO、C端缺失的NEMO、NIK、NIK激酶缺陷型突變體(NIK mut)、C端缺失的IREN突變體(IREN1-197)、或者N端缺失的IREN突變體(IREN198-541)的任何一種pcDNA3質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染293 EBNA細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染采用上文材料和方法(vii)中所述的標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣方法(方法參照Current protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel，F(xiàn).M，等)。在與鼠IKK-1(即一種NIK酶活性的已知底物(Regnier CH，等1997))一起共轉(zhuǎn)染時，通過熒光素酶試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)人IREN能有效地誘導(dǎo)293細(xì)胞的NF-κB活性(見圖10)。
在與C端缺失的NEMO突變體(CΔNEMO氨基酸1-309)共轉(zhuǎn)染時，(根據(jù)報導(dǎo)，NEMO能阻斷JKKs酶促活性(Rothwarf DM等，1988))，發(fā)現(xiàn)此共同轉(zhuǎn)染能抑制IREN和IKK1共轉(zhuǎn)染時所誘導(dǎo)的NF-κB活性(見圖10)。
IREN和IKK1共轉(zhuǎn)染所誘導(dǎo)的NF-κB活性與全長NEMO和IKK1共表達(dá)所誘導(dǎo)的活性相當(dāng)，NEMO并沒有能夠進(jìn)一步加強(qiáng)IREN和IKK1所誘導(dǎo)的NF-κB活性(圖10)與CΔNEMO不同的是NIK激酶缺陷型突變體(NIK mut，氨基酸參見共同擁有和待批的專利申請WO 97/37016，Malinin等，1996)共轉(zhuǎn)染后，它并不能阻斷IREN和IKK1共轉(zhuǎn)染所誘導(dǎo)的NF-κB活性(圖10)。
IREN與NIK DNA以2∶1倍的比例共表達(dá)時，能有效地加強(qiáng)NF-κB的誘導(dǎo)作用。全長NEMO與NIK共表達(dá)時，會阻斷NIK誘導(dǎo)的NF-κB活性，這種抑制可通過IREN的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)(圖10)。正如早期所述，參見(共同擁有和待批的專利申請WO 97/37016，Malinin et al，1996)，NIK mut能有效地阻斷CD120a過量表達(dá)所誘導(dǎo)的NF-κB活性，這種作用無法通過IREN的共表達(dá)來改變(圖10)。
綜合上述的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得出結(jié)論IREN在NF-κB的信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，在NIK的信號下游和NEMO、IKK1的信號上游發(fā)揮著作用，同時也是NIK與IKK-1之間相互作用的一種調(diào)節(jié)劑。
因此，可以假設(shè)某些缺失型IREN突變體可能會干擾從NIK激酶到NEMO-IKK復(fù)合物的信號流。C端缺失突變體IREN1-197對NIK誘導(dǎo)的NF-κB活性確沒有任何影響(數(shù)據(jù)沒列出)。然而N端缺失IREN突變體(IREN△N；IREN198-541)嚴(yán)重抑制了NIK誘導(dǎo)的NF-κB活性，其抑制程度與NEMO相當(dāng)。
實(shí)施例3激酶試驗(yàn)單獨(dú)用編碼鼠IKK1的pcFLAG CHUK轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞(2×106)或聯(lián)合pcNIK或pc20.4(編碼NEMO蛋白)或pcHIS-IREN(編碼帶His標(biāo)記的IREN)或pcHIS-IREN△N(即pcHIS-IREN198-541，編碼帶His標(biāo)記且N端缺失的IREN突變體作為顯性失活的結(jié)構(gòu)域起作用)轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用裂解緩沖液裂解(緩沖液配方1％NP-40，50mM Hepes PH7.5，100mM NaCl，10％甘油，1mM EDTA，20mM β-甘油磷酸，20mM PNPP，1mM Na3VaO4，1mM NaF，1mM偏亞硫酸氫鈉，1mM Bezamidine，1mM DTT，蛋白酶完全抑制劑(Boehringer)。
離心，去除細(xì)胞碎片，補(bǔ)加氯化鈉到250mM的濃度，蛋白與抗FLAG的單克隆抗體發(fā)生免疫沉淀，用含0.1％NP-40和250mM NaCl的裂解緩沖液的洗滌緩沖液充分洗滌，用30μl含有1mg/ml FLAG肽的緩沖液洗脫下來。洗脫液的上清用于體外做激酶反應(yīng)試驗(yàn)，以大腸桿菌(E.coli)生產(chǎn)的GST-IκB為底物，激酶反應(yīng)緩沖液中含有50mM -甘油磷酸、2mM DTT、20mM MgCl2、1mMNa3VaO4、1mM EDTA/EGTA，同時含有32P-γATP。通過SDS-PAGE分離該反應(yīng)物，蛋白的磷酸化可通過曝光于X-射線底片來檢測。作為對照，可通過用抗FLAG抗體做Western Blot免疫印跡來檢測裂解物中的蛋白量。
N端缺失的IREN突變體被發(fā)現(xiàn)是一個顯性失活分子，在IREN、IKK1與NEMO共表達(dá)時所做的激酶活性試驗(yàn)中，它能阻斷IKK1的活性。
IKK1和NEMO都過量表達(dá)，而不僅僅是IKK1過量表達(dá)，這樣能誘導(dǎo)出很強(qiáng)的IKK1激酶活性，這可通過其自身磷酸化和大腸桿菌產(chǎn)生的GST-IκB融合蛋白的磷酸化來檢測)。IREN198-541與IKK1和NEMO共表達(dá)，導(dǎo)致了活性的顯著降低(圖11)，但這并沒有影響IKK1和NEMO的表達(dá)水平，全長IREN沒有這種影響(圖11，中列)。
實(shí)施例4IREN-10B和IREN-E的克隆及測序?yàn)榱髓b別出IREN的拼接變異體，用IREN的前端600bp作為探針對上文提到的源于MCF7細(xì)胞系的噬菌體cDNA文庫進(jìn)行篩選，從兩個獨(dú)立的克隆中鑒別到了似乎是兩種不同的IREN變異體。這兩種克隆的頭5’端1595bp與IREN是一致的，但它們的3’引物端還有一個額外的編碼序列。這個區(qū)含有一個PX結(jié)構(gòu)域，它是功能未知的一個保守區(qū)域(有可能是一個蛋白與蛋白之間相互作用的結(jié)構(gòu)域)，這種結(jié)構(gòu)域在某些信號分子(包括PI3激酶)中也有出現(xiàn)。在克隆10B和克隆E中，該P(yáng)X結(jié)構(gòu)域的側(cè)面有兩段短的同源區(qū)。在這兩種克隆中，這些區(qū)域的下游區(qū)域是不同的。兩種IREN拼接變異體的比較見圖9。
5’端引物UTR的暫時序列(用Kozak序列，從序列的開始到第一個ATG)表明在IREN和IREN 10B、IREN-E同工型中，這些序列是相同的。
TRAF2的結(jié)合區(qū)域是位于IREN198-388處，在所有這三種拼接同工型中都是一致的(見圖9所示)。因此，IREN 10B在雙雜交試驗(yàn)中也能與TRAF2相互作用。盡管沒有觀察到IREN的自身連接，但是IREN 10B在雙雜交試驗(yàn)中卻發(fā)生自身連接現(xiàn)象，然而它卻不會與IREN相互作用(表II)。
一種IREN 10B的缺失突變體，它缺失了PX結(jié)構(gòu)域，但是卻含有一個IREN所沒有的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，所以它也能自身連接，這也暗示了這個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域在IREN 10B自身的相互作用中起到了作用。
實(shí)施例5與IREN 10B和IREN相互作用的蛋白采用上文所述的酵母雙雜交系統(tǒng)，用IREN 10B篩選B細(xì)胞文庫，目的是為了確定能與IREN 10B相互作用的其他蛋白，結(jié)果確定了能與IREN10B強(qiáng)且異性相互作用的三種蛋白。
1)網(wǎng)格蛋白(clathrin)裝配蛋白2的mul亞基(AP50，CLAPM1；GENE BANK序列號U36188)，它能與IREN 10B強(qiáng)相互作用，但與IREN僅有微弱的相互作用。
2)FB1或Amida基因，它跟IREN 10B、IREN都能發(fā)生特異性的強(qiáng)相互作用。這個基因早先被認(rèn)為是一個融合在兒童時期前B白血病細(xì)胞中的E2A基因上的一段序列(Brambillasca等，Leukemia 13(3)，369-375，1999)。最近發(fā)現(xiàn)，它在過量表達(dá)時能誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。它是位于細(xì)胞核上的，且參與了神經(jīng)細(xì)胞特異的立即早期基因(Arc基因)的模運(yùn)輸(Irie等，J.Biol.Chem275，(2000)2647-2653)。
3)TRAX基因，它能與IREN 10B發(fā)生強(qiáng)相互作用，但與IREN僅有非常微弱的相互作用。這個基因與DNA結(jié)合蛋白Translin有高度的同源性，可能參與了Translin的核內(nèi)定位。(Aoki等，F(xiàn)EBS Lett 401，109-112，1997)。
綜合了解了IREN 10B與上述蛋白的特異性的強(qiáng)相互作用后，因而IREN很可能在信號蛋白的控制流中發(fā)揮了積極的作用。
實(shí)施例6IREN 10B與一種未知的能磷酸化IREN 10B的激酶發(fā)生強(qiáng)相互作用N端融合有6-HIS標(biāo)記的IREN 10B和IREN，通過瞬時轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞且在其中表達(dá)。轉(zhuǎn)染24小時后，用免疫沉淀的方法純化蛋白。免疫沉淀物進(jìn)行PAGE分析及用抗HIS的抗體作免疫染色，結(jié)果顯示兩種蛋白的表達(dá)水平一樣。對兩種免疫沉淀物做激酶反應(yīng)試驗(yàn)，IREN 10B蛋白被強(qiáng)磷酸化，顯示了它是結(jié)合了一種未知的能以IREN 10B為底物的酶。IREN自身僅僅被微弱的磷酸化，這可能是由于非特異性結(jié)合激酶引起的，這暗示了上述的激酶是與IREN 10B的C端序列相互作用，很可能就是其PX結(jié)構(gòu)域，(圖2)。
實(shí)施例7IREN可能是一種基因家族的一個成員。
通過在最新的genebank(包含有絕大多數(shù)的近乎完整的人類基因組序列)上作BLAST比對分析，結(jié)果顯示至少有部分IREN基因拷貝與1個非常緊密相關(guān)的同工型，在核苷酸水平上有97-98％的同源性，且定位于5號染色體的幾個位置上，它具有保守的外顯子結(jié)構(gòu)。在兩種同工型中，每一種的外顯子4-7都編碼氨基酸113-406(與圖3B、4、5中的核苷酸序列559-759位相對應(yīng)，[SEQID NO4，SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，一一對應(yīng)])。因此TRAF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域在4種不同的染色體上都是保守的，而別的外顯子只在這些染色體中的一條或兩條染色體上存在。這些數(shù)據(jù)可能顯示了以不同的N端或C端延伸的以多種大小表達(dá)的IREN變異體，是作為一類能調(diào)節(jié)TRAF1或TRAF2依賴的信號傳導(dǎo)途徑的分子(圖13A)。
通過對EST數(shù)據(jù)庫作BLAST比對分析，顯示了至少有部分高度保守型的IREN表達(dá)在老鼠和牛中。與兩種IREN基因同工型(一種是本專利所描述的，另一種是上述所提到的在別的染色體位置上找到的)相對應(yīng)的ESTs，它們在EST庫中都能找得到，這顯示了這兩種緊密相關(guān)的同工型都是活性基因(圖13B)。
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序列表<110>耶達(dá)研究發(fā)展有限公司(Yeda Research and Development Co.Ltd)D.沃勒克(Wallach，David)N.馬利寧(Malinin，Nikolay)I.辛哈(Sinha，Indranil)S.勒(Leu，Stefan)<120>IREN蛋白，其制備和應(yīng)用<130>399<150>131719<151>1999-09-02<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的DNA序列<400>1caggatcctc atggctgcag ctagcgtgac30<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>2ggtcgactta gagccctgtc aggtccacaa tg 32<210>3<211>143<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3ggtaccgagc tcggatccac tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattct gcggatgtac 60ccatacgatg ttccagatac gctgaatttc gaggccacga aggccggcgg cgcggcgcag 120gcaccggccc ggggagaggc acc 143<210>4<211>1782<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4atgagcggat cacagaacaa tgacaaaaga caatttctgc tggagcgact gctggatgca 60gtgaaacagt gccagatccg ctttggaggg agaaaggaga ttgcctcgga ttccgacagc120agggtcacct gtctgtgtgc ccagtttgaa gccgtcctgc agcatggctt gaagaggagt180cgaggattgg cactcacagc ggcagcgatc aagcaggcag cgggctttgc cagcaaaacc240gaaacagagc ccgtgttctg gtactacgtg aaggaggtcc tcaacaagca cgagctgcag300cgcttctact ccctgcgcca catcgcctca gacgtgggcc ggggtcgcgc ctggctgcgc360tgtgccctca acgaacactc cctggagcgc tacctgcaca tgctcctggc cgaccgctgc420aggctgagca ctttttatga agactggtct tttgtgatgg atgaagaaag gtccagtatg480cttcctacca tggcagcagg tctgaactcc atactctttg cgattaacat cgacaacaag540gatttgaacg ggcagagtaa gtttgctccc accgtttcag acctcttaaa ggagtcaacg600cagaacgtga cctccttgct gaaggagtcc acgcaaggag tgagcagcct gttcagggag660atcacagcct cctctgccgt ctccatcctc atcaaacctg aacaggagac cgaccccttg720cctgtcgtgt ccaggaatgt cagtgctgat gccaaatgca aaaaggagcg gaagaagaaa780aagaaagtga ccaacataat ctcatttgat gatgaggaag atgagcagaa ctctggggac840gtgtttaaaa agacacctgg ggcaggggag agctcagagg acaactccga ccgctcctct900gtcaatatca tgtccgcctt tgaaagcccc ttcgggccta actccaatgg aagtcagagc960agcaactcat ggaaaattga ttccctgtct ttgaacgggg agtttgggta ccagaagctt 1020gatgtgaaaa gcatcgatga tgaagatgtg gatgaaaacg aagatgacgt gtatggaaac 1080tcatcaggaa ggaagcacag gggccactcg gagtcgcccg agaagccact ggaagggaac 1140acctgcctct cccagatgca cagctgggct ccgctgaagg tgctgcacaa tgactccgac 1200atcctcttcc ctgtcagtgg cgtgggctcc tacagcccag cagatgcccc cctcggaagc 1260ctggagaacg ggacaggacc agaggaccac gttctcccgg atcctggact tcggtacagt 1320gtggaagcca gctctccagg ccacggaagt cctctgagca gcctgttacc ttctgcctca 1380gtgccagagt ccatgacaat tagtgaactg cgccaggcca ctgtggccat gatgaacagg 1440aaggatgagc tggaggagga gaacagatca ctgcgaaacc tgctcgacgg tgagatggag 1500cactcagccg cgctccggca agaggtggac accttgaaaa ggaaggtggc tgaacaggag 1560gagcggcagg gcatgaaggt ccaggcgctg gccagctatc tttgctattt tgtgaggaga 1620ttctaacccc acgtgagaac catgtggtgg agaaatggag ggagagagaa atccaacagt 1680tcctgatagt ctcatttgag ctcctggatc cagtctttcc tgaagctgtg tttcctctgg 1740acttttcatg tatgtgagcc aataaattgc tttcattcct tg 1782<210>5<211>3139<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5atgagcggat cacagaacaa tgacaaaaga caatttctgc tggagcgact gctggatgca 60gtgaaacagt gccagatccg ctttggaggg agaaaggaga ttgcctcgga ttccgacagc120agggtcacct gtctgtgtgc ccagtttgaa gccgtcctgc agcatggctt gaagaggagt180cgaggattgg cactcacagc ggcagcgatc aagcaggcag cgggctttgc cagcaaaacc240gaaacagagc ccgtgttctg gtactacgtg aaggaggtcc tcaacaagca cgagctgcag300cgcttctact ccctgcgcca catcgcctca gacgtgggcc ggggtcgcgc ctggctgcgc360tgtgccctca acgaacactc cctggagcgc tacctgcaca tgctcctggc cgaccgctgc420aggctgagca ctttttatga agactggtct tttgtgatgg atgaagaaag gtccagtatg480cttcctacca tggcagcagg tctgaactcc atactctttg cgattaacat cgacaacaag540gatttgaacg ggcagagtaa gtttgctccc accgtttcag acctcttaaa ggagtcaacg600cagaacgtga cctccttgct gaaggagtcc acgcaaggag tgagcagcct gttcagggag660atcacagcct cctctgccgt ctccatcctc atcaaacctg aacaggagac cgaccccttg720cctgtcgtgt ccaggaatgt cagtgctgat gccaaatgca aaaaggagcg gaagaagaaa780aagaaagtga ccaacataat ctcatttgat gatgaggaag atgagcagaa ctctggggac840gtgtttaaaa agacacctgg ggcaggggag agctcagagg acaactccga ccgctcctct900gtcaatatca tgtccgcctt tgaaagcccc ttcgggccta actccaatgg aagtcagagc960agcaactcat ggaaaattga ttccctgtct ttgaacgggg agtttgggta ccagaagctt 1020gatgtgaaaa gcatcgatga tgaagatgtg gatgaaaacg aagatgacgt gtatggaaac 1080tcatcaggaa ggaagcacag gggccactcg gagtcgcccg agaagccact ggaagggaac 1140acctgcctct cccagatgca cagctgggct ccgctgaagg tgctgcacaa tgactccgac 1200atcctcttcc ctgtcagtgg cgtgggctcc tacagcccag cagatgcccc cctcggaagc 1260ctggagaacg ggacaggacc agaggaccac gttctcccgg atcctggact tcggtacagt 1320gtggaagcca gctctccagg ccacggaagt cctctgagca gcctgttacc ttctgcctca 1380gtgccagagt ccatgacaat tagtgaactg cgccaggcca ctgtggccat gatgaacagg 1440aaggatgagc tggaggagga gaacagatca ctgcgaaacc tgctcgacgg tgagatggag 1500cactcagccg cgctccggca agaggtggac accttgaaaa ggaaggtggc tgaacaggag 1560gagcggcagg gcatgaaggt ccaggcgctg gccagagaga acgaggtgct caaagtccaa 1620ctgaagaaat atgtaggagc tgtccagatg ctgaaaagag aaggtcaaac agctgaagtg 1680ccaaatcttt ggagtgttga tggagaagtt acagtagctg aacagaagcc gggagaaatt 1740gctgaagaac tcgcaagctc ctacgaaaga aagctcatcg aggtggcaga gatgcatggc 1800gagctgattg agttcaacga gcgcctgcac agggccctgg tagccaagga agccctcgtg 1860tcccagatga ggcaggagct catcgatctc cggggaccgg tgcctggaga tttgagtcaa 1920acgtccgaag accagagttt gtcggatttt gaaatatcaa accgggcgct gatcaacgtc 1980tggatcccct cagtgtttct ccggggcaaa gcagcaaatg cattccacgt gtatcaggtc 2040tacatccgga taaaagacga tgaatggaat atttatcgcc ggtatacaga gttcaggagt 2100ttgcaccaca agttacaaaa caagtaccct caagtgaggg cctacaactt cccacccaaa 2160aaggccattg gaaacaagga tgccaagttt gtggaggaac ggagaaagca gctccagaat 2220tacctgcgca gcgtcatgaa caaagtcatc cagatggtcc ccgagttcgc tgccagcccc 2280aagaaggaga ccctcatcca gctgatgccc ttcttcgtcg acatcacccc gcccggagag 2340cctgtgaaca gccggcccaa agcagcttcc cgctttccca aactgtcccg gggtcagccc 2400cgggagaccc gcaacgtgga gccccagagc ggtgacctct gacctcgaca aaaccgcagc 2460cacgggccct gtgcgtggca ccagctgcgt ccaccccagc cactgccgct ggcccctcac 2520ctcagcgtga caaccacgtc ccactggtga tcctgagagc acacgattcc caacagttac 2580acaacacccc gattaaacta atcagtcttc gagccgcatg ataccgtgac ccgagagacc 2640aaggcagcac ctcgctggag agactgggac acacagtcct tctgcttctg gggtctaccc 2700tgggctgcaa gggctgttcc tccaccttcc tatagttcag ggctggcagg agggtgggca 2760ccaggtcagg ctgggtgcgc catggttgag aggcaaaggt gatcccctat ataggaaggt 2820tcatgcagag ccagcctctc cactctttcc catgtgggga ctagaatgac tattagcctc 2880ttcctttgct ttttaaggtt attacctggc ctaacctagg gatggctggc tgtggggggg 2940gggggtgggc atggttcctt tcactgcatt ttccaccaac agtcattaga cacctggcac 3000tgtcacagct cacttttcca gagggatatt cctgtggctt tggcaaggag ccattagtga 3060tgtgcaactt gagttcagag aacttcccct acctccccca tggctggctt caggaaggac 3120cagtgccctc catagcctg3139<210>6<211>2873<212>DNA<213>homo sapiens<400>6atgagcggat cacagaacaa tgacaaaaga caatttctgc tggagcgact gctggatgca 60gtgaaacagt gccagatccg ctttggaggg agaaaggaga ttgcctcgga ttccgacagc120agggtcacct gtctgtgtgc ccagtttgaa gccgtcctgc agcatggctt gaagaggagt180cgaggattgg cactcacagc ggcagcgatc aagcaggcag cgggctttgc cagcaaaacc240gaaacagagc ccgtgttctg gtactacgtg aaggaggtcc tcaacaagca cgagctgcag300cgcttctact ccctgcgcca catcgcctca gacgtgggcc ggggtcgcgc ctggctgcgc360tgtgccctca acgaacactc cctggagcgc tacctgcaca tgctcctggc cgaccgctgc420aggctgagca ctttttatga agactggtct tttgtgatgg 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Asp Ala Lys Cys Lys Lys Glu245 250 255Arg Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Asn Ile Ile Ser Phe Asp Asp Glu260 265 270Glu Asp Glu Gln Asn Ser Gly Asp Val Phe Lys Lys Thr Pro Gly Ala275 280 285Gly Glu Ser Ser Glu Asp Asn Ser Asp Arg Ser Ser Val Asn Ile Met290 295 300Ser Ala Phe Glu Ser Pro Phe Gly Pro Asn Ser Asn Gly Ser Gln Ser305 310 315 320Ser Asn Ser Trp Lys Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Gly Glu Phe Gly325 330 335Tyr Gln Lys Leu Asp Val Lys Ser Ile Asp Asp Glu Asp Val Asp Glu340 345 350Asn Glu Asp Asp Val Tyr Gly Asn Ser Ser Gly Arg Lys His Arg Gly355 360 365His Ser Glu Ser Pro Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Thr Cys Leu Ser370 375 380Gln Met His Ser Trp Ala Pro Leu Lys Val Leu His Asn Asp Ser Asp385 390 395 400Ile Leu Phe Pro Val Ser Gly Val Gly Ser Tyr Ser Pro Ala Asp Ala405 410 415Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asn Gly Thr Gly Pro Glu Asp His Val Leu420 425 430Pro Asp Pro Gly Leu Arg Tyr Ser Val Glu Ala Ser Ser Pro Gly His435 440 445Gly Ser Pro Leu Ser Ser Leu Leu Pro Ser Ala Ser Val Pro Glu Ser450 455 460Met Thr Ile Ser Glu Leu Arg Gln Ala Thr Val Ala Met Met Asn Arg465 470 475 480Lys Asp Glu Leu Glu Glu Glu Asn Arg Ser Leu Arg Asn Leu Leu Asp485 490 495Gly Glu Met Glu His Ser Ala Ala Leu Arg Gln Glu Val Asp Thr Leu500 505 510Lys Arg Lys Val Ala Glu Gln Glu Glu Arg Gln Gly Met Lys Val Gln515 520 525Ala Leu Ala Ser Tyr Leu Cys Tyr Phe Val Arg Arg Phe530 535 540<210>8<211>813<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>8Met Ser Gly Ser Gln Asn Asn Asp Lys Arg Gln Phe Leu Leu Glu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Ala Val Lys Gln Cys Gln Ile Arg Phe Gly Gly Arg Lys20 25 30Glu Ile Ala Ser Asp Ser Asp Ser Arg Val Thr Cys Leu Cys Ala Gln35 40 45Phe Glu Ala Val Leu Gln His Gly Leu Lys Arg Ser Arg Gly Leu Ala50 55 60Leu Thr Ala Ala Ala Ile Lys Gln Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr65 70 75 80Glu Thr Glu Pro Val Phe Trp Tyr Tyr Val Lys Glu Val Leu Asn Lys85 90 95His Glu Leu Gln Arg Phe Tyr Ser Leu Arg His Ile Ala Ser Asp Val100 105 110Gly Arg Gly Arg Ala Trp Leu Arg Cys Ala Leu Asn Glu His Ser Leu115 120 125Glu Arg Tyr Leu His Met Leu Leu Ala Asp Arg Cys Arg Leu Ser Thr130 135 140Phe Tyr Glu Asp Trp Ser Phe Val Met Asp Glu Glu Arg Ser Ser Met145 150 155 160Leu Pro Thr Met Ala Ala Gly Leu Asn Ser Ile Leu Phe Ala Ile Asn165 170 175Ile Asp Asn Lys Asp Leu Asn Gly Gln Ser Lys Phe Ala Pro Thr Val180 185 190Ser Asp Leu Leu Lys Glu Ser Thr Gln Asn Val Thr Ser Leu Leu Lys195 200 205Glu Ser Thr Gln Gly Val Ser Ser Leu Phe Arg Glu Ile Thr Ala Ser210 215 220Ser Ala Val Ser Ile Leu Ile Lys Pro Glu Gln Glu Thr Asp Pro Leu225 230 235 240Pro Val Val Ser Arg Asn Val Ser Ala Asp Ala Lys Cys Lys Lys Glu245 250 255Arg Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Asn Ile Ile Ser Phe Asp Asp Glu260 265 270Glu Asp Glu Gln Asn Ser Gly Asp Val Phe Lys Lys Thr Pro Gly Ala275 280 285Gly Glu Ser Ser Glu Asp Asn Ser Asp Arg Ser Ser Val Asn Ile Met290 295 300Ser Ala Phe Glu Ser Pro Phe Gly Pro Asn Ser Asn Gly Ser Gln Ser305 310 315 320Ser Asn Ser Trp Lys Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Gly Glu Phe Gly325 330 335Tyr Gln Lys Leu Asp Val Lys Ser Ile Asp Asp Glu Asp Val Asp Glu340 345 350Asn Glu Asp Asp Val Tyr Gly Asn Ser Ser Gly Arg Lys His Arg Gly355 360 365His Ser Glu Ser Pro Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Thr Cys Leu Ser370 375 380Gln Met His Ser Trp Ala Pro Leu Lys Val Leu His Asn Asp Ser Asp385 390 395 400Ile Leu Phe Pro Val Ser Gly Val Gly Ser Tyr Ser Pro Ala Asp Ala405 410 415Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asn Gly Thr Gly Pro Glu Asp His Val Leu420 425 430Pro Asp Pro Gly Leu Arg Tyr Ser Val Glu Ala Ser Ser Pro Gly His435 440 445Gly Ser Pro Leu Ser Ser Leu Leu Pro Ser Ala Ser Val Pro Glu Ser450 455 460Met Thr Ile Ser Glu Leu Arg Gln Ala Thr Val Ala Met Met Asn Arg465 470 475 480Lys Asp Glu Leu Glu Glu Glu Asn Arg Ser Leu Arg Asn Leu Leu Asp485 490 495Gly Glu Met Glu His Ser Ala Ala Leu Arg Gln Glu Val Asp Thr Leu500 505 510Lys Arg Lys Val Ala Glu Gln Glu Glu Arg Gln Gly Met Lys Val Gln515 520 525Ala Leu Ala Arg Glu Asn Glu Val Leu Lys Val Gln Leu Lys Lys Tyr530 535 540Val Gly Ala Val Gln Met Leu Lys Arg Glu Gly Gln Thr Ala Glu Val545 550 555 560Pro Asn Leu Trp Ser Val Asp Gly Glu Val Thr Val Ala Glu Gln Lys565 570 575Pro Gly Glu Ile Ala Glu Glu Leu Ala Ser Ser Tyr Glu Arg Lys Leu580 585 590Ile Glu Val Ala Glu Met His Gly Glu Leu Ile Glu Phe Asn Glu Arg595 600 605Leu His Arg Ala Leu Val Ala Lys Glu Ala Leu Val Ser Gln Met Arg610 615 620Gln Glu Leu Ile Asp Leu Arg Gly Pro Val Pro Gly Asp Leu Ser Gln625 630 635 640Thr Ser Glu Asp Gln Ser Leu Ser Asp Phe Glu Ile Ser Asn Arg Ala645 650 655Leu Ile Asn Val Trp Ile Pro Ser Val Phe Leu Arg Gly Lys Ala Ala660 665 670Asn Ala Phe His Val Tyr Gln Val Tyr Ile Arg Ile Lys Asp Asp Glu675 680 685Trp Asn Ile Tyr Arg Arg Tyr Thr Glu Phe Arg Ser Leu His His Lys690 695 700Leu Gln Asn Lys Tyr Pro Gln Val Arg Ala Tyr Asn Phe Pro Pro Lys705 710 715 720Lys Ala Ile Gly Asn Lys Asp Ala Lys Phe Val Glu Glu Arg Arg Lys725 730 735Gln Leu Gln Asn Tyr Leu Arg Ser Val Met Asn Lys Val Ile Gln Met740 745 750Val Pro Glu Phe Ala Ala Ser Pro Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Leu755 760 765Met Pro Phe Phe Val Asp Ile Thr Pro Pro Gly Glu Pro Val Asn Ser770 775 780Arg Pro Lys Ala Ala Ser Arg Phe Pro Lys Leu Ser Arg Gly Gln Pro785 790 795 800Arg Glu Thr Arg Asn Val Glu Pro Gln Ser Gly Asp Leu805 810<210>9<211>784<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>9Met Ser Gly Ser Gln Asn Asn Asp Lys Arg Gln Phe Leu Leu Glu Arg1 5 10 15Leu Leu Asp Ala Val Lys Gln Cys Gln Ile Arg Phe Gly Gly Arg Lys20 25 30Glu Ile Ala Ser Asp Ser Asp Ser Arg Val Thr Cys Leu Cys Ala Gln35 40 45Phe Glu Ala Val Leu Gln His Gly Leu Lys Arg Ser Arg Gly Leu Ala50 55 60Leu Thr Ala Ala Ala Ile Lys Gln Ala Ala Gly Phe Ala Ser Lys Thr65 70 75 80Glu Thr Glu Pro Val Phe Trp Tyr Tyr Val Lys Glu Val Leu Asn Lys85 90 95His Glu Leu Gln Arg Phe Tyr Ser Leu Arg His Ile Ala Ser Asp Val100 105 110Gly Arg Gly Arg Ala Trp Leu Arg Cys Ala Leu Asn Glu His Ser Leu115 120 125Glu Arg Tyr Leu His Met Leu Leu Ala Asp Arg Cys Arg Leu Ser Thr130 135 140Phe Tyr Glu Asp Trp Ser Phe Val Met Asp Glu Glu Arg Ser Ser Met145 150 155 160Leu Pro Thr Met Ala Ala Gly Leu Asn Ser Ile Leu Phe Ala Ile Asn165 170 175Ile Asp Asn Lys Asp Leu Asn Gly Gln Ser Lys Phe Ala Pro Thr Val180 185 190Ser Asp Leu Leu Lys Glu Ser Thr Gln Asn Val Thr Ser Leu Leu Lys195 200 205Glu Ser Thr Gln Gly Val Ser Ser Leu Phe Arg Glu Ile Thr Ala Ser210 215 220Ser Ala Val Ser Ile Leu Ile Lys Pro Glu Gln Glu Thr Asp Pro Leu225230 235 240Pro Val Val Ser Arg Asn Val Ser Ala Asp Ala Lys Cys Lys Lys Glu245 250 255Arg Lys Lys Lys Lys Lys Val Thr Asn Ile Ile Ser Phe Asp Asp Glu260 265 270Glu Asp Glu Gln Asn Ser Gly Asp Val Phe Lys Lys Thr Pro Gly Ala275 280 285Gly Glu Ser Ser Glu Asp Asn Ser Asp Arg Ser Ser Val Asn Ile Met290 295 300Ser Ala Phe Glu Ser Pro Phe Gly Pro Asn Ser Asn Gly Ser Gln Ser305 310 315 320Ser Asn Ser Trp Lys Ile Asp Ser Leu Ser Leu Asn Gly Glu Phe Gly325 330 335Tyr Gln Lys Leu Asp Val Lys Ser Ile Asp Asp Glu Asp Val Asp Glu340 345 350Asn Glu Asp Asp Val Tyr Gly Asn Ser Ser Gly Arg Lys His Arg Gly355 360 365His Ser Glu Ser Pro Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Thr Cys Leu Ser370 375 380Gln Met His Ser Trp Ala Pro Leu Lys Val Leu His Asn Asp Ser Asp385 390 395 400Ile Leu Phe Pro Val Ser Gly Val Gly Ser Tyr Ser Pro Ala Asp Ala405 410 415Pro Leu Gly Ser Leu Glu Asn Gly Thr Gly Pro Glu Asp His Val Leu420 425 430Pro Asp Pro Gly Leu Arg Tyr Ser Val Glu Ala Ser Ser Pro Gly His435440 445Gly Ser Pro Leu Ser Ser Leu Leu Pro Ser Ala Ser Val Pro Glu Ser450 455 460Met Thr Ile Ser Glu Leu Arg Gln Ala Thr Val Ala Met Met Asn Arg465 470 475 480Lys Asp Glu Leu Glu Glu Glu Asn Arg Ser Leu Arg Asn Leu Leu Asp485 490 495Gly Glu Met Glu His Ser Ala Ala Leu Arg Gln Glu Val Asp Thr Leu500 505 510Lys Arg Lys Val Ala Glu Gln Glu Glu Arg Gln Gly Met Lys Val Gln515 520 525Ala Leu Ala Arg Glu Asn Glu Val Leu Lys Val Gln Leu Lys Lys Tyr530 535 540Val Gly Ala Val Gln Met Leu Lys Arg Glu Gly Gln Thr Ala Glu Val545 550 555 560Pro Asn Leu Trp Ser Val Asp Gly Glu Val Thr Val Ala Glu Gln Lys565 570 575Pro Gly Glu Ile Ala Glu Glu Leu Ala Ser Ser Tyr Glu Arg Lys Leu580 585 590Ile Glu Val Ala Glu Met His Gly Glu Leu Ile Glu Phe Asn Glu Arg595 600 605Leu His Arg Ala Leu Val Ala Lys Glu Ala Leu Val Ser Gln Met Arg610 615 620Gln Glu Leu Ile Asp Leu Arg Gly Pro Val Pro Gly Asp Leu Ser Gln625 630 635 640Thr Ser Glu Asp Gln Ser Leu Ser Asp Phe Glu Ile Ser Asn Arg Ala645 650 655Leu Ile Asn Val Trp Ile Pro Ser Val Phe Leu Arg Gly Lys Ala Ala660 665 670Asn Ala Phe His Val Tyr Gln Val Tyr Ile Arg Ile Lys Asp Asp Glu675 680 685Trp Asn Ile Tyr Arg Arg Tyr Thr Glu Phe Arg Ser Leu His His Lys690 695 700Leu Gln Asn Lys Tyr Pro Gln Val Arg Ala Tyr Asn Phe Pro Pro Lys705 710 715 720Lys Ala Ile Gly Asn Lys Asp Ala Lys Phe Val Glu Glu Arg Arg Lys725 730 735Gln Leu Gln Asn Tyr Leu Arg Ser Val Met Asn Lys Val Ile Gln Met740 745 750Val Pro Glu Phe Ala Ala Ser Pro Lys Lys Glu Thr Leu Ile Gln Leu755 760 765Met Pro Phe Phe Val Asp Trp Ile Ser Leu Val Trp Lys Trp Pro Arg770 775 780
權(quán)利要求
1.一種編碼能結(jié)合TRAF的蛋白質(zhì)的DNA序列，其特征在于，該DNA序列選自a)含有圖3所示核苷酸序列的本文命名為IREN的cDNA序列；b)含有圖4所示核苷酸序列的本文命名為IREN-10B的cDNA序列；c)含有圖5所示核苷酸序列的本文命名為EIREN-E的cDNA序列；d)序列(a)-(c)的編碼能至少結(jié)合TRAF2的225-501氨基酸序列的生物活性蛋白質(zhì)的片段；e)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)-(d)序列雜交并編碼能至少結(jié)合TRAF2的225-501氨基酸序列的生物活性蛋白質(zhì)的DNA序列；和f)對(a)-(e)所定義的DNA具有基因密碼子簡并性并編碼能至少結(jié)合TRAF2的225-501氨基酸序列的生物活性蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其選自本文命名為IREN，IREN-10和IREN-E的cDNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的DNA序列，其編碼的蛋白質(zhì)能調(diào)節(jié)NF-κB的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA序列，其選自本文定義為cDNA IREN所含有的序列。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的DNA序列，其包含本文所定義的編碼蛋白質(zhì)IREN的DNA序列。
6.編碼蛋白質(zhì)IREN、其同工型、片段或類似物的DNA序列，其特征在于，所述IREN、其同工型、片段或類似物能結(jié)合TRAF2，并能調(diào)節(jié)NF-κB的活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的DNA序列，其特征在于，該DNA序列選自a)天然IREN蛋白質(zhì)的編碼區(qū)衍生的cDNA序列；b)在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與(a)序列雜交并編碼生物活性IREN的DNA序列；和c)對(a)和(b)所定義的序列具有密碼子簡并性并編碼生物活性IREN蛋白DNA序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的DNA序列，其至少含有圖6所示序列的一部分并至少編碼一種活性IREN蛋白質(zhì)、其同工型、類似物或片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA序列，其編碼的IREN蛋白質(zhì)、其同工型、片段或類似物至少具有圖6所示氨基酸序列的一部分。
10.一種含有權(quán)利要求1-9任一項所述DNA序列的載體。
11.一種權(quán)利要求10所述的能被真核宿主細(xì)胞表達(dá)的載體。
12.一種權(quán)利要求10所述的能被原核宿主細(xì)胞表達(dá)的載體。
13.包含權(quán)利要求10-12中任一項所述載體的轉(zhuǎn)化的真核或原核宿主細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的DNA序列編碼的IREN蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物，其特征在于，所述蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物至少能結(jié)合TRAF2蛋白質(zhì)的氨基酸225-501之間的部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是本文命名為克隆10B所編碼的蛋白質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物，它們是權(quán)利要求1-9中任一項所述的DNA序列編碼的蛋白質(zhì)IREN、其同工型、片段、類似物和衍生物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的蛋白質(zhì)IREN、其同工型、片段、類似物和衍生物，其所述蛋白質(zhì)、其同工型、類似物、片段和衍生物，至少具有圖6所示氨基酸序列的一部分。
18.一種產(chǎn)生權(quán)利要求14-16中任一項所述的蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物的方法，其特征在于，該方法包括在適合所述蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求14-16要求中任一項所述的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，如需要，影響其翻譯后修飾，以獲得所述蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物，分離所述被表達(dá)的蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物。
19.針對權(quán)利要求14或15所述的IREN蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物的特異性的，或針對權(quán)利要求16或17所述的IREN蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物的特異性的抗體，或該抗體的活性片段或衍生物。
20.一種調(diào)節(jié)或介導(dǎo)細(xì)胞中NF-κB的活性或權(quán)利要求14-17中任一項所述的蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物所結(jié)合的TRAF2或其他分子所調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的任何其他胞內(nèi)信號傳遞活動的方法，所述方法包括以適合胞內(nèi)導(dǎo)入的方式，向所述細(xì)胞導(dǎo)入一個或多個所述蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物來處理所述細(xì)胞；或以運(yùn)載所述序列的合適載體形式，向所述細(xì)胞導(dǎo)入所述的一個或多個蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物的DNA序列；所述載體能將所述序列插入到所述細(xì)胞中從而在所述細(xì)胞中表達(dá)所述序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的細(xì)胞處理包括向所述細(xì)胞以運(yùn)載所述序列的合適載體形式導(dǎo)入編碼所述蛋白質(zhì)，同工型、片段、類似物和衍生物的DNA序列；所述載體能將所述序列插入到所述細(xì)胞中，從而在所述細(xì)胞中表達(dá)所述序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述的細(xì)胞處理是用重組動物病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，該方法包括以下步驟(a)構(gòu)建一重組動物病毒載體，其攜帶有病毒表面蛋白(配體，其能結(jié)合所述待處理細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞表面受體)的編碼序列，和編碼選自權(quán)利要求14-17中任一項所述蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物的蛋白質(zhì)(當(dāng)其在所述細(xì)胞中表達(dá)時，能調(diào)節(jié)/介導(dǎo)NF-κB的活性或由TRAF2或其他所述分子調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的任何其他胞內(nèi)信號傳遞活動)的第二序列。(b)用(a)所述的載體感染所述細(xì)胞。
23.一種調(diào)節(jié)受TRAF2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的方法，其特征在于，該方法包括用權(quán)利要求19所述的抗體或其活性片段或衍生物處理所述細(xì)胞，所述處理是將含所述抗體或其活性片段或衍生物的合適組合物施加于所述細(xì)胞，當(dāng)所述細(xì)胞的IREN蛋白或其部分暴露在細(xì)胞外表面時配制胞外用的所述組合物；當(dāng)所述IREN蛋白是胞內(nèi)蛋白時，所述組合物研制成胞內(nèi)用制劑。
24.一種調(diào)節(jié)受TRAF2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的方法，其特征在于，該方法包括用權(quán)利要求1-8中任一項所述的編碼IREN蛋白的DNA序列至少一部分的反義序列的寡核苷酸序列處理所述細(xì)胞，所述寡核苷酸序列能阻斷IREN蛋白質(zhì)的表達(dá)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中通過權(quán)利要求22所述的病毒(其含有的編碼所述寡核苷酸序列的所述病毒的第二序列)，將所述寡核苷酸序列導(dǎo)入所述細(xì)胞。
26.一種調(diào)節(jié)受TRAF2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的方法，其特征在于，該方法包括采用一種核酶程序，在該程序中將能與編碼權(quán)利要求14-17中任一項所述IREN蛋白的胞內(nèi)mRNA序列相互反應(yīng)的核酶序列的載體，以允許該核酶序列在所述細(xì)胞中表達(dá)的形式導(dǎo)入所述細(xì)胞中，當(dāng)所述核酶序列在所述的細(xì)胞中表達(dá)時，它與所述細(xì)胞mRNA序列相互作用并切割該mRNA序列，導(dǎo)致抑制所述細(xì)胞的所述IREN蛋白質(zhì)的表達(dá)。
27.一種分離和鑒定權(quán)利要求14-17中任一項所述的能直接結(jié)合TRAF2蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括采用酵母雙雜交程序，在該程序中，一個雜交載體攜帶有編碼所述TRAF2的序列，第二個雜交載體攜帶有來自cDNA或基因組DNA文庫的序列，因此用二載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞并分離轉(zhuǎn)化陽性的細(xì)胞，然后提取所述第二雜交載體以獲得能結(jié)合編碼所述TRAF2蛋白質(zhì)的序列。
28.根據(jù)權(quán)利要求20-27中任一項所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是IREN、或至少是其同工型、片段、類似物和衍生物的一種。
29.一種調(diào)節(jié)受TRAF2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，其特征在于，作為活性組分，該組合物至少含有如權(quán)利要求14-17中任一項所述的IREN蛋白質(zhì)、其生物活性片段、類似物和衍生物之一或它們的混合物
30.一種調(diào)節(jié)受TRAF2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，其特征在于，作為活性組分，該組合物含有編碼能結(jié)合細(xì)胞表面受體和編碼權(quán)利要求14-17中任一項所述的至少一種IREN蛋白質(zhì)、其同工型、活性片段或類似物的重組動物病毒載體。
31.一種調(diào)節(jié)受TRAF2調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的藥物組合物，其特征在于，作為活性組分，該組合物含有編碼權(quán)利要求1-8中任一項所述的IREN蛋白質(zhì)mRNA序列的反義序列的寡核苷酸序列。
32.一種預(yù)防或治療與NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)疾病、或TRAF2所介導(dǎo)的或權(quán)利要求14-17任一項所述蛋白質(zhì)所結(jié)合的其他分子所介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含有效量的IREN-10B編碼蛋白質(zhì)或DNA編碼分子，或包含能破壞所述IREN-10B編碼蛋白質(zhì)與TRAF2、或與任何與IREN-10B編碼蛋白結(jié)合的其他分子相互反應(yīng)的分子。
33.一種預(yù)防或治療NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)疾病、或TRAF2所介導(dǎo)的或 14-17任一項所述蛋白質(zhì)所結(jié)合的其他分子所介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含有效量的IREN蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物，或DNA編碼分子，或包含能破壞所述蛋白質(zhì)IREN、其同工型、片段、類似物和衍生物與TRAF2、或與所述IREN蛋白質(zhì)、其同工型、片段、類似物和衍生物結(jié)合的任何其他分子相互反應(yīng)的分子。
34.一種預(yù)防或治療NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)疾病、或TRAF2所介導(dǎo)的或蛋白質(zhì)IREN所結(jié)合的其他分子所介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含有能干擾蛋白質(zhì)IREN活性的分子。
35.一種預(yù)防或治療與NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)的疾病，或與TRAF2所介導(dǎo)的、或權(quán)利要求15所述IREN-10B編碼蛋白結(jié)合的其他分子所介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)的疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含有交量的IREN-10B編碼的蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的DNA分子，或包含能破壞IREN-10B編碼所述蛋白質(zhì)與TRAF2或IREN-10B編碼所述蛋白質(zhì)所結(jié)合的任何其他分子相互反應(yīng)的分子。
36.一種預(yù)防或治療與NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)的疾病，或與TRAF2介導(dǎo)的或權(quán)利要求16或17所述的蛋白質(zhì)IREN，同工型，片段，類似物或衍生物所結(jié)合的其他分子介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)的疾病的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含有效量的蛋白質(zhì)IREN，或其同工型，片段、類似物或衍生物，或編碼它們的DNA分子，或包含能破壞蛋白質(zhì)所述IREN，其同工型，片段、類似物或衍生物與TRAF2或所述蛋白質(zhì)IREN，同工型，片段，類似物或衍生物所結(jié)合的任何其他分子相互反應(yīng)的分子。
37.一種預(yù)防或治療與NF-κB誘導(dǎo)相關(guān)的疾病，或與TRAF2介導(dǎo)的或權(quán)利要求14～17中所述蛋白質(zhì)結(jié)合的其他分子介導(dǎo)的任何其他活性相關(guān)的疾病的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要的病人有效量的權(quán)利要求14～17中任一項所述的蛋白質(zhì)或其同工型，片段，類似物和衍生物及它們的混合物，或編碼它們的DNA分子或給予有效量的能破壞權(quán)利要求14～17中任一項所述的蛋白質(zhì)或同工型，片段，類似物和衍生物及它們的混合物與TRAF2或與權(quán)利要求14～17中任一項所述的蛋白質(zhì)或同工型，片段，類似物和衍生物及它們的混合物所結(jié)合的任何其他分子相互反應(yīng)的分子。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)由IREN所編碼。
39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是IREN。
40.一種篩選能結(jié)合權(quán)利要求14-17中任一項所述的蛋白質(zhì)的配體的方法，其特征在于，該方法包括使細(xì)胞提取物與連接有所述蛋白質(zhì)的親和層折介質(zhì)接觸，從而該配體結(jié)合所述基質(zhì)，并洗脫、分離和分析所述配體。
41.一種篩選能結(jié)合權(quán)利要求14～17中任一項所述蛋白質(zhì)的配體的編碼DNA序列的方法，其特征在于，該方法采用酵母雙雜交程序，在該程序中，一個雜交載體攜帶有編碼所述蛋白的序列，第二個雜交載體攜帶有選自cDNA或基因組DNA文庫的序列，用所述二載體轉(zhuǎn)化酵母宿主細(xì)胞，分離陽性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并提取所述第二雜交載體以獲得所述配體的編碼序列。
42.一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)變TRAF2所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的方法，其特征在于，該方法包括(a)篩選能結(jié)合至少含有TRAF2的氨基酸殘基225-501的TRAF2一部分的多肽的配體(b)鑒定和特征分析，通過所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的具有所述結(jié)合能力的配體，而非TRAF2或TNF/NGF受體家族的受體。(c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
43.一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)權(quán)利要求17～20中任一項所述蛋白質(zhì)所調(diào)節(jié)或介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，其特征在于，該方法包括(a)篩選能結(jié)合至少含有圖6所示IREN序列一部分的多肽的配體；(b)鑒定和特征分析，通過所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的具有所述結(jié)合能力的配體，而非TRAF2或TNF/NGF受體家族的受體；(c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式的所述配體。
44.一種鑒定和產(chǎn)生能調(diào)節(jié)受蛋白質(zhì)IREN所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的配體的方法，其特征在于，該方法包括(a)篩選能至少結(jié)合圖6所示IREN序列之一部分的配體；(b)鑒定和特征分析通過所述篩選步驟發(fā)現(xiàn)的具有所述結(jié)合能力的配體，而非TRAF2或TNF/NGF下受體家族的受體；(c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式所述配體。
45.一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)IREN所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，其特征在于，該方法包括(a)篩選能調(diào)節(jié)受蛋白質(zhì)IREN所調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；(b)鑒定和特征分析所述分子；和(c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式所述分子。
46.一種鑒定和產(chǎn)生能直接或間接調(diào)節(jié)權(quán)利要求14～17中任一項所述蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的細(xì)胞活性的分子的方法，其特征在于，該方法包括(a)篩選能調(diào)節(jié)受權(quán)利要求14～17中任一項所述蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)/介導(dǎo)的活性的分子；(b)鑒定和特征分析所述分子；和(c)產(chǎn)生基本上分離的和純化形式所述分子。
全文摘要
提供編碼TRAF結(jié)合性蛋白質(zhì)的DNA序列,其編碼的蛋白質(zhì)和它們在治療或預(yù)防與NF－κB誘導(dǎo)相關(guān)的疾病,或與TRAF所介導(dǎo)的活性相關(guān)的疾病中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/50GK1384878SQ00815013
公開日2002年12月11日 申請日期2000年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月2日
發(fā)明者D·沃勒克, N·馬利寧, I·辛哈, S·勒 申請人:耶達(dá)研究發(fā)展有限公司