一種自聚肽融合cd151蛋白及其制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術研究領域，具體涉及一種自聚肽融合CD151蛋白及其制備方法和應用。所述的自聚肽融合CD151蛋白由豬CD151蛋白PRRSV結合片段和ELK16自聚肽組成，其制備方法包括表達載體構建、融合蛋白表達與純化、PRRSV結合片段確定以及病毒濃縮、純化和檢測。所述自聚肽融合CD151蛋白可用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)濃縮、純化和環(huán)境監(jiān)測中。與其他方法相比，用本發(fā)明的自聚肽融合CD151蛋白濃縮、純化和檢測PRRSV具有敏感、簡單和經濟等優(yōu)點，不僅可用于組織樣品的PRRSV濃縮和純化，還可用于環(huán)境樣品的PRRSV檢測和分離培養(yǎng)。
【專利說明】
一種自聚肽融合CD151蛋白及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術研究領域，具體涉及一種自聚肽融合CD151蛋白的制備方法 及其在豬繁殖與呼吸綜合征病毒濃縮、純化和環(huán)境監(jiān)測中的應用。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種高 度接觸和免疫抑制性傳染病，以母豬繁殖障礙、青年豬死亡率高和所有年齡豬呼吸道癥狀 為特征，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。目前PRRS主要用疫苗免疫進行控制，但滅活苗 免疫保護效果不佳，活疫苗存在安全隱患。病毒濃縮與純化是抗體和疫苗制備的重要環(huán)節(jié)， 現有的PRRSV純化方法主要有密度梯度離心法、超濾膜過濾法和親和層析法，但這些方法均 存在費時、費力、回收率低和費用高等缺點。PRRSV能通過垂直和水平兩種方式傳播，水平傳 播包括接觸病毒感染豬的唾液、鼻液、乳汁、精液、污染物和污水等，因此環(huán)境監(jiān)測是控制 PRRSV流行傳播的重要環(huán)節(jié)。盡管RT-PCR可用于感染組織樣品的PRRSV檢測，但污水、糞尿等 環(huán)境樣品不僅病毒滴度低，而且存在RT-PCR反應抑制物。盡管經典的超速離心、聚乙二醇沉 淀和吸附/洗脫可用于PRRSV濃縮，但這些方法不僅耗時、敏感性低，而且也能濃縮RT-PCR反 應抑制物。
[0003] 受體結合與磁珠捕捉技術（Receptor-binding capture and magnetic sequestration)是近幾年出現的病毒濃縮與純化新技術，其基本原理是利用病毒與受體結 合的特異性，用病毒受體蛋白偶聯(lián)磁珠捕獲病毒。盡管該技術具有快速、高效等優(yōu)點，已成 功用于食品、污水等環(huán)境樣品的病毒濃縮與檢測，但磁珠價格較貴，而且需用專門設備，其 實際應用受到限制。自聚肽（Self-aggregating peptide)能在水溶液中自動裝配成聚合 物，其融合蛋白在重組大腸桿菌內能形成活性包涵體，不僅能用離心等簡單方法分離純化， 而且能直接用于體外實驗，但能否用于病毒捕捉尚無研究報道。
[0004] ⑶151是PRRSV受體之一。本發(fā)明將⑶151蛋白胞外區(qū)與ELK16自聚肽在大腸桿菌中 融合表達，將純化的融合蛋白用于PRRSV濃縮、純化和環(huán)境監(jiān)測。盡管這種策略是容易想到 的，但在具體設計時卻面臨以下技術問題：自聚肽融合CD151蛋白能否在大腸桿菌中表達、 表達的融合蛋白能否保持PRRSV結合活性、結合PRRSV的最小片段是什么、最佳結合和洗脫 條件是什么、能否用于PRRSV的濃縮、純化與環(huán)境監(jiān)測？

【發(fā)明內容】

[0005] 為了解決現有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種自聚肽融合CD151蛋白及其制 備方法與應用。
[0006] 本發(fā)明的自聚肽融合⑶151蛋白，由⑶151蛋白PRRSV結合區(qū)與ELK 16自聚肽組成。 經病毒滴定證明，利用該融合蛋白能從病毒感染細胞和模擬污染環(huán)境樣品中濃縮、純化和 檢測PRRSV。
[0007] 本發(fā)明所述的自聚肽融合CD 151蛋白用下列方法制備：
[0008] (1)將PT連接頭和ELK16編碼序列插入pET-30a載體，獲得融合表達載體PET-PT16;
[0009] (2)將PCR克隆的豬CD151蛋白第158~220位氨基酸(C63)編碼序列插入pET-PT16 載體，獲得重組載體PC63-PT16;
[0010] (3)將重組載體PC63-PT16轉化大腸桿菌，在37 °C誘導融合蛋白表達；
[0011] (3)用14000g離心沉淀融合蛋白；
[0012] (4)用0.2%TritonX-100離心洗滌融合蛋白。
[0013] 其中步驟⑵是:CD151蛋白C63片段具有PRRSV結合活性。
[0014]本發(fā)明還公布了所述的自聚肽融合CD151蛋白在PRRSV濃縮、純化和環(huán)境監(jiān)測中的 應用，其具體方法如下：
[0015] (1)將75μg/ml自聚肽融合CD151蛋白與PRRSV感染細胞或模擬污染環(huán)境水樣混合， 28°C 孵育 60min;
[0016] (2)用14000g離心沉淀蛋白-病毒復合物；
[0017] (3)用pH5 · 0緩沖液洗脫病毒；
[0018] (4)用14000g離心去除自聚肽融合CD151蛋白；
[0019] (5)用病毒滴定法檢測PRRSV。
[0020] 進一步地，公開了上述自聚肽融合⑶151蛋白在PRRSV濃縮、純化和環(huán)境監(jiān)測中的 應用。
[0021] 本發(fā)明采用了以下方法對所自聚肽融合CD151蛋白進行驗證：
[0022] (1)按照常規(guī)方法進行Marc-145細胞PRRSV感染，感染后收集細胞培養(yǎng)上清和裂解 細胞；
[0023] (2)將不同劑量PRRSV接種自來水、細菌裂解液、豬尿液和糞便懸浮液，獲得模擬 PRRSV污染環(huán)境樣品；
[0024] (3)將75μg/ml融合蛋白與PRRSV感染細胞或模擬污染環(huán)境樣品混合，28°C孵育 60min；
[0025] (2)用14000g離心沉淀蛋白-病毒復合物；
[0026] (3)用pH5 · 0緩沖液洗脫病毒；
[0027] (4)用14000g離心去除融合蛋白；
[0028] (5)用病毒滴定法檢測PRRSV。
[0029] 本發(fā)明將容易導致不溶性表達的CD151蛋白跨膜區(qū)去除，分別將胞外區(qū)及其兩個 片段克隆入不同自聚肽融合表達載體，以確保融合蛋白表達;分別將不同融合蛋白與PRRSV 進行共孵育，用病毒滴定法檢測與病毒結合;對融合蛋白結合PRRSV及洗脫條件進行優(yōu)化， 以便洗脫病毒不被滅活;分別將PRRSV接種自來水、細菌裂解液、豬尿液和糞便懸浮液，用融 合蛋白回收病毒，以驗證融合蛋白能否用于PRRSV污染環(huán)境樣品監(jiān)測。與現有的其他方法相 比，用本發(fā)明的自聚肽融合CD151蛋白濃縮、純化和檢測PRRSV具有敏感、簡單和經濟等優(yōu) 點，不僅可用于組織樣品PRRSV濃縮與純化，還可用于環(huán)境樣品PRRSV檢測和分離培養(yǎng)。
【附圖說明】
[0030] 圖1是融合蛋白表達載體的結構示意圖。PT7是T7啟動子，RBS是核糖體結合位點， His-Tag是組氨酸標簽，PT是由17個脯氨酸(P)或蘇氨酸(T)組成的PT連接頭，ELK16為自聚 肽編碼序列，Target指目的基因序列。
[0031]圖2是豬⑶151蛋白結構及其片段表達策略示意圖。LEL是⑶151胞外區(qū)，從115位酪 氨酸(Y115)開始到220位亮氨酸(L220)結束;N63為CD151胞外區(qū)前63個氨基酸片段，從115 位酪氨酸(Y115)開始到177位天冬氨酸(D177)結束;C63為CD151胞外區(qū)后63個氨基酸片段， 從158位絲氨酸(S158)開始到220位亮氨酸(L220)結束。
[0032]圖3是自聚肽融合⑶151蛋白表達與純化電泳圖。Μ為蛋白質分子量Marker，1是重 組菌裂解物，2是裂解重組菌上清，3是裂解重組菌沉淀，4是純化的融合蛋白。
[0033] 圖4是自聚肽融合CD151蛋白結合PRRSV的RT-PCT檢測。Μ是DNA Marker;l是PRRSV 陽性對照，2是His-CD151融合蛋白沉淀病毒，3是ELK16-N63融合蛋白沉淀病毒，4是ELK16-ELE融合蛋白沉淀病毒，5是C63-ELK16融合蛋白沉淀病毒，6是ELK16-B 〇IFNg融合蛋白沉淀 病毒陰性對照。
【具體實施方式】 [0034] 生物材料來源：
[0035] 1. pET_30a載體:從美國Novagen公司引進，本實驗室保存。
[0036] 2.DH5a大腸桿菌:從美國BD Biosciences Clontech公司引進，本實驗室保存。 [0037] 3. BL21 (DE3)大腸桿菌:從美國Novagen公司引進，本實驗室保存。
[0038] 4. VR2332株PRRSV:從美國ATCC引起，本實驗室保存。
[0039] 5.Marc-145細胞:從美國ATCC引起，本實驗室保存。
[0040] 6. pET-IgV-CDl 51載體:本實驗室構建(文獻:張鈺，孫懷昌，黃燕燕，等.豬CD151重 組抗原表達及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用.揚州大學學報（農業(yè)與生命科學版）， 2012,33(2):1-5)。
[00411 7.ELK16-B0IFNg融合蛋白：本實驗室制備（文獻：李光亞.自凝肽融合煙草蝕紋病 毒蛋白酶的表達、純化、活性檢測與應用.揚州大學碩士學位論文，2016)。
[0042]具體操作步驟如下：
[0043] 1.融合表達載體構建
[0044] (1)根據標準密碼子表，將PT連接頭和ELK16氨基酸序列（文獻:Wei Wu，Lei Xing， Bihong Zhou,et al.Active protein aggregates induced by terminally attached self-assembling peptide ELK16in Escherichia coli.Microbial Cell Factories 2011，10:9)推導成核苷酸序列，分別以？1'^16(簡稱?1'16)和?1'^16-?1'(簡稱？16?)兩 種連接方式，將序列送南京金瑞斯生物科技有限公司合成，分別克隆在PUC57載體（美國 Addgene公司）中。
[0045] 5-GGATCCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCGCTGGAACTGG AACTGAAACTGAAACTGGAACTGGAACTGAAACTGAAATAACTCGAG-3(PT16,SEQ ID No.l)；
[0046] 5-AGATCTCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGACCCCGCTGGAACTG GAACTGAAACTGAAACTGGAACTGGAACTGAAACTGAAACCGACCCCGCCGACCACCCCGACCCCGCCGACCACCCC GACCCCGACCCCGTAAGGTACC-3(P16P，SEQ ID No.2)。
[0047] (2)用限制酶BamHI和Xhol消化法將PT16序列從pUC57載體上切下，插入pET-30a的 相應位點，獲得融合表達載體pET-PT16(圖1)。
[0048] (3)用限制酶Bglll和ΚρηΙ消化法將P16P序列從pUC57載體上切下，克隆入pET-30a 的相應位點，獲得融合表達載體PET-P16P(圖1)。
[0049] (4)根據豬CD151mRNA序列(GenBank:AK240006)設計下列1對引物，正向引物引入 EcoR頂每切位點，反向引物引入Xho頂每切位點：
[0050] 正向引物：5-TCGAATTCTACCAGCAGCTGAGTGCAG-3(SEQ ID No.3)；
[0051] 反向引物：5-TACTCGAGTTACAGGTGCTCCCGGATGAA-3(SEQ ID Νο·4)。
[0052] 以pET-IgV_CD151為模板，按照LA Taq DNA聚合酶(Fermentas公司）說明書，用PCR 擴增CD151胞外區(qū)（LEL)編碼序列（圖2);用限制酶EcoRI和XhoI消化PCR產物，與相同酶切 pET-P 16P載體連接，獲得重組載體pP 16P-LEL。
[0053] (5)根據豬⑶15ImRNA序列設計下列1對引物，正向引物引入EcoR頂每切位點，反向 引物引入Xho頂每切位點：
[0054] 正向引物：5-TCGAATTCTACCAGCAGCTGAGTGCAG-3(SEQ ID No.5)；
[0055] 反向引物：5-TACTCGAGTTAGTCGCCTGCCTCACCCGA-3(SEQ ID Νο·6)。
[0056] 以pET-IgV_CD151為模板，按照LA Taq DNA聚合酶說明書，用PCR擴增CD151胞外區(qū) 前63個氨基酸(N63)基因片段（圖2);用限制酶EcoRI和Xhol消化PCR產物，與相同酶切pET-P16P載體連接，獲得重組載體pP16P-N63。
[0057] (6)根據豬CD151mRNA序列設計下列1對引物，正向引物引入Ndel酶切位點，反向引 物引入Κρη頂每切位點：
[0058] 正向引物：5-TCCATATGAGCAACAACTCCCAGGACT-3(SEQ ID No.7)；
[0059] 反向引物：5-TAGGTACCCAGGTGCTCCCGGATGAA-3(SEQ ID Νο·8)。
[0060] 以pET-IgV-CD151為模板，按照LA Taq DNA聚合酶說明書，用PCR擴增豬CD151胞外 區(qū)后63個氨基酸(C63)基因片段（圖2);用限制酶Ndel和ΚρηΙ消化PCR產物，與相同酶切pET-PT16載體連接，獲得重組載體pC63-PT16。
[0061] 2.融合蛋白表達與純化
[0062] (1)分別將重組載體 pP16P-LEL、pP16P-N63 和 pC63-PT16 轉化 BL21(DE3)大腸桿菌， 在卡那霉素(50yg/mL)LB平板上培養(yǎng)過夜;挑取單菌落接種卡那霉素 LB培養(yǎng)液，37°C搖床培 養(yǎng)過夜；按1:100比例接種卡那霉素2XYT培養(yǎng)液(Tryptone 16g，Yeast extract 10g，NaCl 5g，調節(jié)pH7 ·4，加去離子水至1L)，37°C搖床培養(yǎng)至0D_ = 0 · 5，加入0 · 2mmol/L IPTG，37°C 誘導表達6h。
[0063] (2)將細菌培養(yǎng)4°C、4000g離心10min，沉淀用細菌裂解液（50mM Tris-HCl，50mM NaCl，ImM EDTA，5 %甘油，pH7.2)離心洗滌3次，用細菌裂解液懸浮，超聲波裂解(20W，10s， 停15s，3min)，4°C、14000g離心20min;沉淀蛋白用含0.2%Triton X-100細菌裂解液離心洗 滌3次，用細菌裂解液離心洗滌3次。SDS-PAGE分析結果顯示:pP16P-LEL、pP16P-N63和pC63-PT16重組菌能表達預期的24kDa、20kDa和 12kDa ELK16-LEL、ELK16-N63和C63-ELK16融合蛋 白；經過3次離心洗滌后，純化融合蛋白為單一蛋白條帶（圖3)。
[0064] 3.CD151蛋白PRRSV結合區(qū)的確定
[0065] (1)用細菌裂解液分別將ELK16-LEL、ELK16-N63和C63-ELK16融合蛋白稀釋為500μ g/mL，各取100yL與等量PRRSV(10 6TCID5Q)混合，4°C孵育60min，設His-CD151融合蛋白陽性 對照，ELK16-B 〇IFNg融合蛋白陰性對照;4°C、14000g離心20min，離心沉淀用細菌裂解液離 心洗滌3次，分別用lOOyL懸浮。
[0066] (2)按照RNAi so?Plus試劑盒（TaKaRa公司）說明書提取病毒RNA，按照RevertAid? Reverse Transcriptase(Fermentas公司）使用說明書進行反轉錄，根據PRRSV 0RF7基因序 列(GenBank: EF473139.1)設計下列1對引物：
[0067] 正向引物：5-GGGGAATGGCCAGYCAGTCAA-3(SEQ ID Νο·9);
[0068] 反向引物：5-GCCAGRGGAAAATGKGGCTTCTC-3(SEQ ID Νο.10)。
[0069] (3)以上述反轉錄產物為模板，按照rTaq DNA polymerase(TaKaRa公司）說明書進 行 PCR 擴增，PCR 程序為：94°(：/5111丨11;94°(：/3〇8,56°(：/3〇8,72°(：/3〇8,30次循環(huán) ；72°(：/1〇1^11。 瓊脂糖凝膠電泳分析結果顯示:從Hi s-CD 151、ELK16-LEL和C63-ELK16融合蛋白沉淀中可以 擴增出PRRSV 0RF7基因片段，在ELK16-N63和ELK16-BoIFNg融合蛋白沉淀中不能擴增出此 基因片段(圖4)，表明CD151蛋白及其C63片段含PRRSV結合區(qū)。
[0070] 4. C63-ELK16融合蛋白結合PRRSV的條件優(yōu)化
[0071] (1)用細菌裂解液將063^16融合蛋白稀釋至0、25、50、75、10(^8/1^，各取10(^1^ 與等量PRRSV混合，4°C孵育60min，4°C、14000g離心20min，離心沉淀用PBS離心洗滌3次，用 PBS溶解，在Marc-145細胞上進行病毒滴定（文獻:Jacobs AC,Hermann JR，Munoz_Zanzi C, Prickett JR,Roof MB,Yoon KJ,Zimmerman JJ.Stability of porcine reproductive and respiratory syndrome virus at ambient temperatures. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2010,22:257-260)。結果顯示：C63-ELK16融合蛋白結合PRRSV 的最佳濃度為75yg/mL。
[0072] (2)將 100yL(75μg/ml)C63-ELK16 融合蛋白與等量 PRRSV 混合，分別在 4、16、28、37 °C孵育60min，如前進行離心沉淀、洗滌和病毒滴定。結果顯示：C63-ELK16融合蛋白結合 PRRSV的最佳溫度為28 °C。
[0073] (3)分別用？財.0、5.0、6.0、7.0、8.0細菌裂解液將063^16融合蛋白稀釋至754 g/mL，各取100yL與等量PRRSV混合，28°C孵育60min，如前進行離心沉淀、洗滌和病毒滴定。 結果顯示:C63-ELK16融合蛋白結合PRRSV的最佳pH為7.0.
[0074] (4)用ρΗ7·0細菌裂解液將C63-ELK16融合蛋白稀釋至75yg/mL，取100yL與等量 PRRSV混合，在28 °C分別孵育15、30、45、60、90min，如前進行離心沉淀、洗滌和病毒滴定。結 果顯示:C63-ELK16融合蛋白結合PRRSV的最佳時間為60min。
[0075] 5. PRRSV洗脫條件的優(yōu)化
[0076] (1)在最佳條件下用C63-ELK16融合蛋白從感染細胞裂解液中沉淀PRRSV，沉淀病 毒用菌體裂解液離心洗滌3次，分別用pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0PBS溶解，4°C孵育 60min;用2倍濃度pH7.0PBS中和，4°C、14000g離心20min。病毒滴定結果顯示：從C63-ELK16 融合蛋白洗脫PRRSV的最佳pH為5.0。
[0077] (2)用C63-ELK16融合蛋白從感染細胞裂解液中沉淀PRRSV，沉淀病毒用菌體裂解 液離心洗滌3次，沉淀病毒用pH5.0PBS溶解，分別在4、16、28、37 °C洗脫10min。病毒滴定結果 顯示:從C63-ELK16融合蛋白洗脫PRRSV的最佳溫度為28°C ·
[0078] (3)用C63-ELK16融合蛋白從感染細胞裂解液中沉淀PRRSV，沉淀病毒用菌體裂解 液離心洗滌3次，用pH5.0PBS溶解，分別在28°C洗脫5、10、15、30、45、60、90min，如前進行離 心。病毒滴定結果顯示:從C63-ELK16融合蛋白洗脫PRRSV的最佳時間為10min。
[0079] 6.自聚肽融合⑶151蛋白的應用
[0080] (1)按照常規(guī)方法培養(yǎng)Marc-145細胞，在90 %細胞密度時進行PRRSV感染，感染后 48h收集細胞培養(yǎng)上清，1000g離心5min;加入同體積PBS，反復凍融細胞3次，1000g離心 5min;用roS(pH7.0)將C63-ELK16融合蛋白稀釋為75yg/mL，各取30yL與等體積PRRSV感染細 胞上清或裂解細胞混合，在最佳條件下（PH7.0，28°C，60min)沉淀PRRSV，病毒滴定結果顯 示:PRRSV回收率分別為70.6 %和64.3 %。在最佳條件(pH5.0，28 °C，10min)下進行PRRSV洗 脫，用2倍濃度pH7.0PBS中和，4°C、14000g離心20min。病毒滴定結果顯示:洗脫后PRRSV回收 率分別52.9%和56.3%。
[0081 ] (2)按照常規(guī)方法培養(yǎng)大腸桿菌，37°C培養(yǎng)過夜后離心，細菌沉淀用PH7.0PBS懸 浮，超聲波裂解，離心收集上清液；向大腸桿菌裂解液加入l〇3、l〇4、l〇5PFU/mL PRRSV，各取 30yL與等體積C63-ELK16融合蛋白（75μg/ml)混合，在最佳沉淀條件下沉淀(pH7.0，28°C， 60min)和洗脫(pH5.0，28°C，10min)病毒。病毒滴定結果顯示:從彡103PFU/mL PRRSV細菌裂 解液能回收到病毒，從103PFU/mL PRRSV細菌裂解液沉淀病毒的回收率為69.5 %。
[0082] (2)向自來水加入103、104或105PFU/mL PRRSV，各取30yL與等體積C63-ELK16融合 蛋白（75μg/ml)混合，在最佳沉淀條件下沉淀（pH7.0，28°C，60min)和洗脫（pH5.0，28 °C， lOmin)病毒。病毒滴定結果顯示:從彡103PFU/mL PRRSV自來水均能回收到病毒，從103PFU/ mL PRRSV自來水沉淀病毒的回收率為62.4%。
[0083] (3)將lmL豬尿液用0·2μπι微孔濾膜過濾除菌，加入105PFU/mL PRRSV，各取30yL與 等體積C63-ELK16融合蛋白（75μg/ml)混合，在最佳沉淀條件下沉淀(pH7.0，28°C，60min)和 洗脫（pH5.0，28 °C，10min)病毒。病毒滴定結果顯示：從豬尿液中沉淀PRRSV的回收率為 57.6%〇
[0084] (4)將0.5g豬糞便用5mL PBS(pH7.0)懸浮，4°C、14000g離心20min，上清用0·2μπι微 孔濾膜過濾除菌;加入105PFU/mL PRRSV，各取30yL與等體積C63-ELK16融合蛋白（75μg/ml) 混合，在最佳沉淀條件下沉淀(pH7.0，28°C，60min)和洗脫(pH5.0，28°C，10min)病毒。病毒 滴定結果顯示:從豬糞便懸浮液中沉淀PRRSV的回收率為50.7%。
【主權項】
1. 一種自聚肽融合CD151蛋白，其特征在于，由豬CD151蛋白PRRSV結合片段和ELK16自 聚肽組成。2. -種制備權利要求1所述自聚肽融合CD151蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將PT連接頭和ELK16自聚肽編碼序列插入pET-30a表達載體，獲得融合表達載體 PET-PT16； (2) 將PCR克隆的豬⑶151蛋白第158~220位氨基酸編碼序列插入pET-PT16載體，獲得 重組載體PC63-PT16; (3) 將重組載體pC63-PT16轉化大腸桿菌，在37 °C誘導融合蛋白表達； (3) 用14000g離心沉淀融合蛋白； (4) 用0.2%TritonX-100離心洗滌融合蛋白。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(2)是:CD151蛋白第158~220位氨基 酸編碼序列具有PRRSV結合活性。4. 權利要求1所述的自聚肽融合CD 151蛋白在PRRSV濃縮、純化和環(huán)境監(jiān)測中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于。具體方法如下： (1) 將75μg/ml自聚肽融合CD151蛋白與PRRSV感染細胞或模擬污染環(huán)境水樣混合，28°C 解育60min; (2) 用HOOOg離心沉淀蛋白-病毒復合物； (3) 用pH5.0緩沖液洗脫病毒； (4) 用HOOOg離心去除自聚肽融合CD151蛋白； (5) 用病毒滴定法檢測PRRSV。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于：步驟（1)是：可用于感染細胞以及污水、尿 液、糞便等環(huán)境樣品PRRSV檢測;步驟(2)是:沉淀的病毒可直接用于動物體內外試驗;步驟 (3)是:純化的PRRSV可用于抗體和疫苗制備。
【文檔編號】C12N15/70GK105906719SQ201610301779
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】孫懷昌, 宗曉銀, 李洋洋, 張鑫宇, 夏曉莉
【申請人】揚州大學