多肽及其用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及多肽及其用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的多肽的序列為：igvgvgagayilaryalnhp。通過靜脈注射本發(fā)明的肽使其穿透血腦屏障，進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)Na+/K+?ATPase β1的穩(wěn)定性，促進(jìn)Na+跨膜濃度梯度形成和維持，谷氨酸攝取能力明顯增強(qiáng)。缺血性腦卒中病理過程中伴隨谷氨酸的大量堆積，運(yùn)用本發(fā)明的多肽治療，可以減輕缺血損傷。
【專利說明】
多化及其用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及多膚NDRG2141-160、連接TAT制備TAT-NDRG2141-16G融合膚段，W及該融合膚段穿過血腦屏障與化Vr-ATPasem結(jié)合，促進(jìn)星形膠 質(zhì)細(xì)胞谷氨酸攝取能力，并有效降低腦細(xì)胞外液興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的濃度。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要由突觸前膜釋放，與突 觸后膜上的谷氨酸受體結(jié)合，介導(dǎo)神經(jīng)元興奮和興奮傳遞。突觸間隙的谷氨酸必須保持在 較低的濃度，從而保證谷氨酸受體的高度敏感W及避免谷氨酸堆積誘發(fā)的興奮性毒性損 傷。多種神經(jīng)系統(tǒng)病變，包括急性腦缺血和腦外傷、慢性神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、 癒痛等均與腦中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸誘發(fā)的興奮性神經(jīng)毒性損傷有關(guān)。目前針對興奮性 毒性損傷的治療，主要集中在突觸后膜的谷氨酸受體，比如開發(fā)了一系列醒DAR(-種谷氨 酸受體)括抗劑，如美金剛等。但是運(yùn)類谷氨酸受體括抗劑對缺血性腦卒中患者的臨床療效 不佳，有很多副作用，可能與括抗劑徹底阻斷谷氨酸的生理效應(yīng)有關(guān)。因此，對于缺血性腦 卒中的治療，急需尋找新的、更安全、更有效的藥物祀點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 由于突觸間隙缺乏使谷氨酸失活的酶，谷氨酸的清除主要依賴突觸周圍的星形膠 質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取多余的谷氨酸。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體攝取谷氨酸的同時(shí)將化+同 向轉(zhuǎn)運(yùn)到星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，因此跨細(xì)胞膜的化+濃度差驅(qū)動(dòng)著谷氨酸的攝取。而分布于星形 膠質(zhì)細(xì)胞膜表面的化Vr-ATPase負(fù)責(zé)將細(xì)胞中的化+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，維持跨細(xì)胞膜的Na+濃 度差。如果從星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的角度考慮增加其攝取能力，有可能減輕谷氨酸介 導(dǎo)的興奮性神經(jīng)損傷。
[0004] NDRG2(Human N-myc downstream regulated gene 2)基因主要在哺乳動(dòng)物星形 膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。發(fā)明人在前期研究中發(fā)現(xiàn)NDRG2可W與NaVK+-ATPasePl亞基相互作用，促 進(jìn)化VK+-AlTase的酶活性和Na+轉(zhuǎn)運(yùn)。Na Vf-AlTasem亞基是化VlC-AlTase的組成性亞 基，可W促進(jìn)全酶正確定位于細(xì)胞膜發(fā)揮其酶活性。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，NDRG2通過與化7r-AlTasem亞基相互作用，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸。發(fā)明人進(jìn)一步篩選到NDRG2141-160 運(yùn)20個(gè)氨基酸片段是其與化Vr-ATPasePl相互作用并穩(wěn)定化Vr-ATPasePl、促進(jìn)谷氨酸 攝取的關(guān)鍵片段。用該關(guān)鍵片段處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，可W增強(qiáng)Na Vr-ATPasePl蛋白穩(wěn)定性、 促進(jìn)NaVK+-ATPase介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)谷氨酸攝取。
[0005] 為此，本發(fā)明的目的之一是提供一種多膚。
[0006] 本發(fā)明所提供的多膚序列為：igvgvgagayilaryalnhp。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是上述多膚用于促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸能力的應(yīng)用。 [000引本發(fā)明的目的之S是上述多膚用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用。
[0009]考慮到大于6個(gè)氨基酸的多膚一般不能穿過血腦屏障，難W在腦內(nèi)達(dá)到有效的蛋 白濃度。本發(fā)明目的之四是提供一種融合膚。
[0010] 本發(fā)明的融合膚包括穿膜膚和權(quán)利要求1所述多膚，所述穿膜膚為TAT、VP22、 AntP、Polyarginine或Polylysine。
[0011] -種實(shí)施方式中，本發(fā)明融合膚的氨基酸序列為：
[0012] YGRKKRRQRRRigVgVgagayiIaryaInhp。
[0013] 本發(fā)明目的之五是提供上述融合膚用于促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸能力的應(yīng) 用。
[0014] 本發(fā)明目的之六是提供上述融合膚用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用。
[0015] 通過靜脈注射本發(fā)明的膚使其穿透血腦屏障，進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)化 Vr-ATPasePl的穩(wěn)定性，促進(jìn)化+跨膜濃度梯度形成和維持，谷氨酸攝取能力明顯增強(qiáng)。缺 血性腦卒中病理過程中伴隨谷氨酸的大量堆積，運(yùn)用TAT-NDRG2141-160融合膚治療，腦細(xì)胞 外液谷氨酸濃度明顯降低，腦缺血損傷明顯減輕。
【附圖說明】
[0016] 圖1:高效液相色譜檢測TAT-NDRG2141-16日融合膚純度大于99% ;
[0017] 圖2:體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NDRG2可W與NaYr-ATPasePl亞基相互作用；
[0018] 圖3:將NDRG2逐步截短并利用免疫共沉淀篩選出其與化Vr-ATPasePl相互作用的 位點(diǎn)位于NDRG2蛋白的141-239膚段中；
[0019] 圖4:將NDRG2蛋白的141-239膚段進(jìn)一步截短并連接TAT穿膜膚段：
[0020] TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2i8i-2〇o，TAT-NDRG2201-220，
[0021] TAT-NDRG2221-239,在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中利用免疫共沉淀證實(shí) [00剖 TAT-NDRG2141-16網(wǎng)W顯著干擾內(nèi)源性NDRG2與化Vr-ATPasem亞基相互作用；
[0023] 圖5: TAT-NDRG2141-16日處理體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，能明顯增加化+/T-ATPasePl 蛋白的穩(wěn)定性和半衰期；
[0024] 圖6:使用綠色巧光素 FITC標(biāo)記的谷氨酸(FITC-Glu)檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞對于谷氨 酸的再攝取，發(fā)現(xiàn)TAT-NDRG2141-16日處理后與對照膚段處理組相比，谷氨酸攝取明顯增加；
[00巧]圖7:微透析實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用TAT-NDRG2141-160處理后，腦缺血再灌注模型小鼠腦外 液谷氨酸含量與對照膚段比明顯降低；
[00%] 圖8:TTC染色顯示TAT-NDRG2l4l-l6日處理組，腦缺血再灌注模型小鼠腦梗死體積明 顯減少。
【具體實(shí)施方式】
[0027] W下實(shí)驗(yàn)中所選用穿膜膚為TAT，攜帶與其融合的膚段穿透血腦屏障并進(jìn)入細(xì)胞 膜，實(shí)現(xiàn)該功能的穿膜膚還有VP22、An巧、Polyarginine或Polylysine等。實(shí)施例1:多膚的 構(gòu)建
[002引發(fā)明人前期研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NDRG2可W與化+/r-ATPase化 亞基相互作用（圖2)，并抑制Na7K+-ATPasePl亞基的降解。通過逐步截短N(yùn)DRG2，發(fā)明人篩選 并發(fā)現(xiàn)NDRG2第141-239片段中，包含兩種蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)（圖3)。為進(jìn)一步明確運(yùn) 99個(gè)氨基酸中與NDRG2相互作用的最重要的膚段，發(fā)明人將運(yùn)99個(gè)膚段進(jìn)一步截短，得到：
[0029] NDRG2i41-16〇，NDRG2i61-18〇，NDRG2i81-2。。，NDRG2201-220和 NDRG2221-239。
[0030] 實(shí)施例2:TAT-NDRG2i41-16〇的構(gòu)建及篩選
[0031] I.發(fā)明人將NDRG2蛋白141-239膚段截短并連接TAT穿膜膚段：
[0032] TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-200，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239 0
[0033] 2.WTAT-NDRG2141-16日融合膚的構(gòu)建方法為例，各融合膚段的制備方法和步驟如 下：
[0034] (A)稱取Ig氯樹脂于150ml的反應(yīng)器中，用50ml的DCM浸泡；
[0035] (B)2小時(shí)后，用DMF洗涂樹脂，然后抽干，如此重復(fù)四次，將樹脂抽干后待用；
[0036] (C)稱取182mg化OC-Asn(化t)-〇H(根據(jù)樹脂取代度計(jì)算）于IOml的離屯、管中，加 入5ml的DCM將其溶解，然后加入1ml的DIEA振蕩搖勻Imin,待溶液澄清后加入到反應(yīng)器中， 然后將反應(yīng)器置于30°C的搖床中反應(yīng)；
[0037] (D) 2小時(shí)后，用IOML的甲醇封頭（甲醇:DIEA: DCM= 1:1:2)半小時(shí)，然后用DMF洗涂 四次，抽干待用；
[003引化）向反應(yīng)器中加入20ML的20 %贓晚（贓晚/DMF = 1: 4)，放在脫色搖床上搖晃 20min，W此來脫去樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫完保護(hù)后用DMF洗涂四次，然后抽干；
[0039] (F)取少量樹脂用巧S酬法檢測（檢A(巧S酬）、檢B(化晚）各兩滴，100°C反應(yīng) Imin),樹脂有顏色，說明脫保護(hù)成功；
[0040] (G)稱取一定量的Fmoc-Ser(tbu)-〇H和冊BT于IOml的離屯、管中，加入5m的DMF將其 溶解，然后加入0.5ml的DI訝辰蕩搖勻Imin,待溶液澄清后加入到反應(yīng)器中，然后將反應(yīng)器置 于30 °C的搖床中反應(yīng)；
[0041 ] (H) 1小時(shí)后，取少量樹脂檢測，用巧S酬法檢測（檢A、檢B各兩滴，10 (TC反應(yīng) Imin )，若樹脂為無色，說明反應(yīng)完全，若樹脂有顏色，說明縮合不完全，繼續(xù)反應(yīng)；
[0042] (I)待反應(yīng)完全后，用DMF洗涂樹脂四次，然后抽干，向反應(yīng)器中加入一定量的20% 贓晚(贓晚/DMF= 1:4)，放在脫色搖床上搖晃20min，W此來脫去樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。脫 完保護(hù)后用DMF洗涂四次，然后抽干檢測保護(hù)是否脫去；
[0043] (J)按照步驟(G)-(I)依次接上剩余氨基酸；
[0044] 化)脫去最后一個(gè)氨基酸Y的保護(hù)后，用切割試劑切割下膚鏈凍干，送純化用高效 液相色譜進(jìn)行純化分離；
[0045] (L)待純化制備檢測純度大于99%可進(jìn)行使用；
[0046] (M)-20°C保存制備好的粉劑，使用時(shí)準(zhǔn)確稱量，溶解于生理鹽水中，離體實(shí)驗(yàn)濃度 為20iiM，在體實(shí)驗(yàn)濃度為lOmg/kg。
[0047] 2.在細(xì)胞水平利用免疫共沉淀的方法證實(shí):體外培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分別用 TAT-NDRG2141-160，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2181-2。。，TAT-NDRG2201-220，TAT-NDRG2221-239 五種 融合膚處理，TAT-NDRG2141-160處理組內(nèi)源性NDRG2與化7K+-ATPasef31亞基相互作用被明顯 阻斷（圖4)，TAT-NDRG2161-180，TAT-NDRG2i8i-2〇o，TAT-NDRG22〇i-22〇，TAT-NDRG2221-239處理組沒 有明顯的阻斷效應(yīng)。
[004引 3. TAT-NDRG2141-160處理星形膠質(zhì)細(xì)胞后，融合膚可通過與化Vr-ATPasem的結(jié)合 和相互作用，提高NaYr-ATPasePl蛋白的穩(wěn)定性（圖5)。
[0049] 實(shí)施例3:TAT-NDRG2i"-16〇的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0050] 1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):對離體培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分別用TAT-Ctrl(對照亂序融合膚） 和TAT-NDRG2141-160處理后，給予200iiM劑量的FITC-Glu(即FITC標(biāo)記的谷氨酸)進(jìn)行處理，采 用活細(xì)胞工作站進(jìn)行圖像采集，檢測兩種膚段對星形膠質(zhì)細(xì)胞再攝取谷氨酸的能力影響， 發(fā)現(xiàn)TAT-NDRG2141-160處理后，星形膠質(zhì)細(xì)胞再攝取谷氨酸的能力明顯增強(qiáng)（圖6)。
[0051] 2.在體實(shí)驗(yàn):給小鼠進(jìn)行大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)手術(shù)，模擬急性缺血性腦卒中，缺 血1小時(shí)后，拔取線栓、恢復(fù)腦血流，同時(shí)經(jīng)鎖骨下靜脈分別注射TAT-Ctrl和TAT-NDRG2141-160。再灌注24小時(shí)后，微透析獲得小鼠紋狀體部位的腦外液樣本，冊LC分析表明， 與對照膚段TAT-Ctrl相比，TAT-NDRG2141-16日可W明顯降低小鼠腦細(xì)胞外液谷氨酸水平（圖 7)，TAT-NDRG2141-16日處理組小鼠腦梗死體積明顯減少（圖8)。人工合成小分子融合膚TAT-NDRG2141-160用于治療缺血性腦卒中藥效確切，有良好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，該多肽的序列如SEQ NO 1所示。2. 權(quán)利要求1所述多肽用于促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸能力的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述多肽用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用。4. 一種融合肽，其特征在于，該融合肽包括穿膜肽和權(quán)利要求1所述多肽，所述穿膜肽 為TAT、VP22、AntP、Polyarginine或Polylysine。5. -種融合肽，其特征在于，該融合肽的氨基酸序列如SEQ NO 2所示。6. 權(quán)利要求4或5所述融合肽用于促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸能力的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求4或5所述融合肽用于制備治療缺血性腦卒中藥物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/42GK105837679SQ201610284885
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】李燕, 尹安琪, 郭航, 熊利澤
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)