miR-106b-5p及其檢測引物和其反義核苷酸序列在診斷、治療缺血性腦卒中領(lǐng)域中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微小核糖核酸的應(yīng)用領(lǐng)域，更具體地說，設(shè)及miR-106b-5p的檢測引物 和反義核巧酸序列在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦卒中（S化oke)屬于中醫(yī)的"中風(fēng)"范疇，是好發(fā)于中老年人的一種常見病、多發(fā) 病、難治病，其病殘率、病死率、復(fù)發(fā)率仍居高不下。據(jù)2013年報(bào)道，腦卒中已經(jīng)成為中國人 死亡的主要原因。腦卒中最常見的類型是缺血性腦卒中。目前，缺血性腦卒中的診斷主要依 賴接診醫(yī)生的臨床觀察和影像學(xué)證據(jù)。在缺血性腦卒中的早期，臨床表現(xiàn)并不總是很典型， 計(jì)算機(jī)斷層掃描的影像變化并不顯著，磁共振成像雖然可W發(fā)現(xiàn)輕度缺血性腦卒中，但是 一些急性期患者躁動不安不能立即進(jìn)行檢查。鑒于目前診斷方法的單一 W及早期發(fā)現(xiàn)與預(yù) 后判斷的困難，我們亟待找到一種比目前現(xiàn)有方法更簡單可靠的新方法來鑒定疾病的發(fā)生 W及判斷病理階段。盡管已有一些標(biāo)志物應(yīng)用于基礎(chǔ)研究，如S-100A蛋白、神經(jīng)元特異性締 醇化酶、降巧素基因相關(guān)膚、超敏C反應(yīng)蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子m等，但對缺血性腦卒中診斷 的敏感性及特異性都未盡如人意，因此尚不能推薦任何指標(biāo)進(jìn)行常規(guī)的臨床檢測。可W說， 找到一種簡便、快速、靈敏、特異性高的檢測標(biāo)志物已經(jīng)成為目前臨床診斷該類疾病的重中 之重。
[0003] 微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一種短（19-25nt)的非編碼的內(nèi)源性RNA，參 與多種生物學(xué)功能。miRNAs表達(dá)異常與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、屯、血管疾病W及感染性疾病 等的發(fā)生密切相關(guān)。隨著人們認(rèn)識的深入，miRNAs在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛。miRNAs在腦 組織中表達(dá)存在著時(shí)間特異性，可用作臨床診斷腦缺血后腦損傷和預(yù)后的非常有前景的生 物標(biāo)記物。研究表明，miRNAs在血清和血漿中也有穩(wěn)定的表達(dá)。有學(xué)者報(bào)道外周血中的 miRNAs可作為腫瘤及其他疾病診斷的一種新的標(biāo)志物。缺血性腦卒中患者外周血miRNAs升 高的原因可能是腦缺血壞死組織表達(dá)的miRNAs W-定的方式釋放入外周血中。因此，選取 缺血性腦卒中患者血清中的miRNAs作為研究對象，通過檢測血清miRNA能夠解決具體問題。 檢測血清miRNAs有W下幾個優(yōu)勢：首先，血清較易獲得，甚至在平常體檢的時(shí)候即可收集 到;其次，血清miRNAs反映的是整個機(jī)體的生理病理情況，其檢測結(jié)果具有指導(dǎo)意義;第Ξ， 血清中某些特定的miRNAs可W提示腦組織的病變，可作為疾病診斷的一個指標(biāo)?？傊瑱z測 血清miRNAs,簡單易行且效果顯著，從血清miRNAs的特異性變化運(yùn)一角度發(fā)現(xiàn)腦卒中并且 區(qū)分類型，將建立一種更敏感、更精確的、早期確診腦卒中的全新技術(shù)。
[0004] 與傳統(tǒng)生物標(biāo)志物相比，血清miRNAs標(biāo)志物具有穩(wěn)定、易于檢測且定量精確等優(yōu) 點(diǎn)，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性。盡管如此，由于miRNAs種類繁多，迄今為止，經(jīng) 發(fā)現(xiàn)命名的miRNAs多達(dá)3100個，難W找到特異的miRNAs,并且血清中的miRNA表達(dá)豐度普遍 較低。目前，國內(nèi)外較少有關(guān)于檢測血清特異性miRNAs用于缺血性腦卒中臨床診斷的報(bào)道。 miR-106b位于染色體7q22.1，21nt長。有報(bào)道稱miR-10化可參與人類淋己瘤、前列腺癌、結(jié) 直腸癌、胃癌的發(fā)生和進(jìn)展。迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p可作為癒痛、胃癌等的檢測標(biāo) '志物（Wan邑 J,Yu JT,Tan L,et al .Genome-wide circulating microRNAexpression profiling indicates biomarkers for epilepsy[J].Sci Rep,2015,5:9522;ShiotaniA, Murao T,Kimura Y,et al. Identification of serummiRNAs as novel non-invasive biom曰rkers for detection ofhigh risk for early gastric c曰ncer[J]. Brit J Cancer，2013,109(9) :2323-2330);然而，還沒有將miR-106b-5p用于急性缺血性腦卒中標(biāo) 志物的報(bào)道。
[000引當(dāng)前針對缺血性腦卒中治療的研究主要是從神經(jīng)保護(hù)、抗凝、溶栓、增加血流量及 降血壓等角度進(jìn)行。腦卒中臨床治療的一線藥物是溶栓藥，但溶栓療法具有治療時(shí)間窗小、 再灌注損傷嚴(yán)重等一系列不足，且其不斷被報(bào)道存在破壞血腦脊液屏障、增加出血風(fēng)險(xiǎn)、加 劇興奮性神經(jīng)毒性等嚴(yán)重不良反應(yīng)。miRNA是基因表達(dá)和蛋白翻譯過程中的調(diào)節(jié)分子，在腦 卒中的發(fā)生發(fā)展過程中起到調(diào)控的樞紐作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 1.要解決的問題
[0007] 針對現(xiàn)有的腦卒中治療方法存在治療時(shí)間窗小、破壞血腦脊液屏障等不足之處， 本發(fā)明提供了 miR-106b-5p的檢測引物和反義核巧酸序列在制備治療缺血性腦卒中藥物中 的應(yīng)用;本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 miR-106b-5p的新醫(yī)藥用途，即作為急性缺血性腦卒中的輔助檢測指 標(biāo)，或者針對miR-106b-5p設(shè)計(jì)干擾片段，直接用于急性缺血性腦卒中的防治。
[000引 2.技術(shù)方案
[0009] 為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0010] miR-106b-5p在制備診斷缺血性腦卒中的試劑盒中的應(yīng)用。
[001。 miR-106b-5p在制備治療缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選地，包括檢測miR-106b-5p的檢測引物序列，檢測引物序列包括逆轉(zhuǎn)錄引物的 序列、上游引物序列和下游引物序列;其中，
[0013] 逆轉(zhuǎn)錄引物的序列為：5 ' -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATCTGCAC- 3 '，上游引物序列為：5 ' -ACACTCCAGCTGGGTAAAGTGCTGACAGT-3 '，Taqman巧光探針序列為： 5'-ATCTCAACTGA-3'，下游引物序列為:5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。
[0014] 上述的miR-106b-5p的檢測引物序列在制備診斷急性缺血性腦卒中的試劑盒中的 應(yīng)用。
[001引miR-106b-5p的反義核巧酸序列在制備治療急性缺血性腦卒中藥物中的應(yīng)用。 [0016]優(yōu)選地血3-10613-59的反義核巧酸序列為5'-41]抓6〔4抓61〇6〔4抓1]1^-3'。
[0017] 原理:在采用miRNAs忍片技術(shù)探究急性缺血性腦卒中患者血清miRNAs表達(dá)譜時(shí)， 首次意外發(fā)現(xiàn)miR-10化-5p在缺血性腦卒中患者外周血清中表達(dá)相對升高，由此發(fā)明人聯(lián) 想到miR-106b-5p在缺血性腦卒中患者血清中具體地絕對表達(dá)量，是否成為一種新穎而有 效診斷急性缺血性腦卒中的標(biāo)志物，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-106b-5p與急性缺血性腦卒中具有 相關(guān)性，使其可W成為急性缺血性腦卒中臨床檢測的輔助指標(biāo)，為該疾病的防治提供了祀 點(diǎn)。
[001引 3.有益效果
[0019] 相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：
[0020] (1)本發(fā)明首次證明miR-106b-5p與急性缺血性腦卒中的相關(guān)性，使其可W成為急 性缺血性腦卒中臨床檢測的輔助指標(biāo)，為該疾病的診斷提供了祀點(diǎn)；
[0021 ] (2)本發(fā)明分析了大量急性缺血性腦卒中病人與正常人血清中miR-106b-5p的表 達(dá)水平，診斷靈敏性和特異性較好，miR-106b-5p的檢測引物序列可用于制備診斷急性缺血 性腦卒中的試劑盒；
[0022] (3)本發(fā)明首次證明針對miR-106b-5p設(shè)計(jì)的反義核巧酸序列可有效降低腦缺血 再灌注損傷模型大鼠腦梗死面積，改善神經(jīng)功能評分，有制備治療急性缺血性腦卒中藥物 的應(yīng)用價(jià)值；
[0023] (4)miR-106b-5p作為腦卒中生物治療的祀分子比編碼基因作為祀分子更加有效， miR-106b-5p干預(yù)可W治療腦卒中，miR-106b-5p可W作為急性缺血性腦卒中的檢測指標(biāo)， 也可作為治療祀標(biāo)。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明采用磁珠法分離外周血miRNAs的操作過程示意圖；
[0025] 圖2為本發(fā)明中mi