一種抗TNF-α類單克隆抗體的層析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗TNF?α類單克隆抗體的層析方法，屬于生物技術領域。具體公開了一種TNF?α類單抗純化過程中去除宿主蛋白及多聚體的方法。采用離子交換與疏水復合層析的填料，使用低pH緩沖液清除污染物，然后使用更低pH洗脫緩沖液來洗脫目的抗體。本發(fā)明的技術方案，能去除一部分多聚體和大部分宿主蛋白，顯著提高抗體純度，價格更便宜且無proteinA脫落，簡單方便，無需調節(jié)樣品pH值與電導，適合于工藝放大及工業(yè)生產。
【專利說明】
一種抗TNF-α類單克隆抗體的層析方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及單克隆抗體制備，具體涉及抗TNF-α類單克隆抗體的層析的方法。
【背景技術】
[0002] 抗腫瘤壞死因子a(TNF-a)單克隆抗體(Me Ab)在臨床治療敗血癥休克、類風濕性 關節(jié)炎等疾病中有廣泛的應用前景，如英夫利昔單抗（infliximab)、阿達木單抗 (adalimumab)、Golimumab都是TNFa類抗體。其中阿達木單抗是全球首個被批準的抗腫瘤壞 死因子a(TNFa)全人源單克隆抗體。阿達木單抗可阻止TNFa與其細胞表面受體結合，從而阻 斷TNFa的生物學活性，最終減輕炎癥反應并減少破骨細胞激活，達到控制并緩解癥狀體征 的目的。目前，絕大多數(shù)的藥廠采用的是CH0(中國倉鼠卵巢)細胞，該細胞是被WHO和Π )Α認 可用于抗體和重組蛋白等生物制品的生產傳代細胞。
[0003] 傳統(tǒng)純化方法如中國專利CN 102257006Α，公開了通過親和層析捕獲步驟分離和 純化抗體的方法，Protein Α柱由于選擇性高和去雜質能力強，經常被首選進行抗體捕獲， 但其價格昂貴、洗脫的低pH易導致高分子聚合物形成、Protein A配基掉落等缺點，使越來 越多的研究開始關注用非ProteinA工藝來解決現(xiàn)有問題。陽離子層析作為第一步層析，最 大的瓶頸在于樣品的調節(jié)，需要調節(jié)樣品的pH值與電導，而親和和復合離子則不需要，調節(jié) 樣品一方面增大了樣品的體積導致儲液罐和上樣時間都要增大，另一方面調節(jié)過程中往往 會產生沉淀從而造成樣品的損失，因為樣品中含有大量的HCP，pH調節(jié)過程中經過HCP的等 電點從而造成了沉淀。同時陽離子的載量往往低于親和層析。如阿達木的原研公司艾伯維 公司的專利CN103509116A，采用了陽離子+陰離子+疏水填料的以陽離子為第一步的"三步 層析法"，它的陽離子填料載量低于35mg/ml，但其料液需調節(jié)電導和pH，體積變大，導致成 本的增加。歐州專利EP1651665采用了 MEP捕獲純化非抗體蛋白以及類似于抗體的片段，它 用了二步洗脫，第一步洗脫中加入了 35%丙二醇，第二步洗脫中加入了 50%丙二醇，回收率 85%，但其未對單克隆抗體進行優(yōu)化，應用于單克隆抗體后，純度和收率都較低。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術的缺陷，提出一種能夠有效去除至少一種污染 物的抗TNF-a類單抗的純化方法。
【申請人】在研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度變性劑如尿素和表面活性劑 等在復性過程中添加的輔助因子能夠通過提高折疊中間體或伸展肽鏈的延展度而抑制聚 集體生成，除了能更好地去除多聚體，本身還有穩(wěn)定抗體高級結構的作用，抑制多聚體的形 成。因此，在洗脫緩沖液中加入適當?shù)奶砑觿?，能夠有助于去除多聚體等污染物和穩(wěn)定樣 品。通過比較在洗脫液中加入0.1M尿素，既不會影響抗體活性，同時除多聚體的效果最佳。
[0005]
【申請人】同樣在研究中發(fā)現(xiàn)，通過添加脫乙酰化酶(HDAC)酶抑制劑苯丁酸鈉可以顯 著降低酸性峰的比例，達到去除酸性峰的效果，從而間接達到提高純度的效果，減輕下一步 純化的負擔。由于酸性峰受酶的影響，室溫中酶會慢慢催化酸性，為抑制酶的活性，在洗脫 液中加入脫乙酰化酶(HDAC)抑制劑苯丁酸鈉，抑制酶的活性，減緩酶催化酸性峰，減少了酸 性峰，從而間接的提高了抗體純度。經過優(yōu)化，在洗脫液中加入7-9mM苯丁酸鈉，既不會影響 抗體活性，同時提高純度的效果最佳，且對于抗TNF-α類單克隆抗體，復合離子交換作用和 疏水作用的介質的動態(tài)載量遠高于其他抗體。
[0006] 在前期實驗中證明，不加入苯丁酸鈉與尿素，MEP捕獲后的純度只能達到75%- 80 %，多聚體1.5-2.0 %。在加苯丁酸鈉與尿素后純度被大大提高。另外，由于洗脫pH為酸性 環(huán)境，此時絕大部分HCP帶上負電，結合在柱子上，從而達到了除HCP的效果。
[0007] 根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的技術方案提供了一種分離抗TNF-α類單克隆抗體和污染 物的方法，包括對包括以下步驟：
[0008] 1)將抗TNF-α類單抗組合物加載到復合層析材料上；
[0009] 2)用pH約為7.0~7.4的第一清洗緩沖液清洗所述復合層析材料；
[0010] 3)用pH低于第一清洗緩沖液的的第二清洗緩沖液清洗所述復合層析材料；
[0011] 4)用pH低于第二清洗緩沖液、含有乙醇的洗脫緩沖液洗脫；
[0012] 其中，所述抗TNF-a類單抗組合物pH約為6.0~7.0;所述的復合層析材料為離子交 換作用和疏水作用的復合介質;所述的污染物包括宿主細胞蛋白。
[0013] 根據(jù)上述技術方案提供的方法，在一些實施方式中，所述的污染物選自宿主細胞 蛋白、多聚體或細胞培養(yǎng)基。
[0014] 在一些實施方式中，所述的抗TNF-a類單抗組合物是由CH0(中國倉鼠卵巢)細胞發(fā) 酵表達。在其中一些實施方式中，步驟1)執(zhí)行前還包括分離細胞和發(fā)酵液。所述的分離選自 離心和過濾。
[0015] 在一些實施方式中，步驟3)中，第二清洗緩沖液的pH約為5.6~6.0;在其中一些優(yōu) 選的實施方式中，第二清洗緩沖液的pH為約6.0。
[0016] 在一些實施方式中，步驟4)所述的洗脫緩沖液pH約為4.6~4.8;在其中一些優(yōu)選 的實施方式中，步驟4)所述的洗脫緩沖液pH約為4.8。
[0017] 步驟4)所述的洗脫液中含有苯丁酸鈉及尿素;在一些優(yōu)選的實施方式中，苯丁酸 鈉及尿素含量分別為8mM和0.1M。目的是改變溶液的緩沖液環(huán)境，提高洗脫分辨率。其次，步 驟4)所述的洗脫液中含有乙醇;在一些優(yōu)選的實施方式中，乙醇的體積含量約為2 %。在本 發(fā)明的技術方案中，洗脫液中加入乙醇的目的是改變溶液的極性，提高洗脫分辨率，理論 上，能達到該效果的具有極性性質的添加劑，例如聚乙二醇都屬于等同的替代方案。
[0018] 在一些優(yōu)選的實施方式中，步驟2)中，第一清洗緩沖液為50mM ros;步驟3)中第二 清洗緩沖液為50mM PBS，步驟4)中，洗脫緩沖液為50mM NaAc-HAc+150mM NaCl。
[0019] 在一些實施方式中，步驟4)中所述的洗脫緩沖液的電導率為16-18ms/cm。
[0020] 上述實施方式中，復合層析介質可以為PALL公司生產的MEP復合填料。
[0021 ]本文中要純化的"組合物"包含感興趣的抗體和一種或多種污染物。所述組合物可 以是"部分純化的"（即已經進行過一個或多個純化步驟)或者可以是自生成抗體的宿主細 胞或生物體直接獲得的(例如所述組合物可以包含收獲的細胞培養(yǎng)液）。
[0022] 術語"污染物"指與期望的抗體產物不同的物質。污染物包括但不限于：宿主細胞 物質，諸如宿主細胞蛋白（HCP);期望抗體的變體、片段、聚集物或衍生物;細胞培養(yǎng)基成分。
[0023] 術語"清洗緩沖液"在本文中用于指在加載組合物之后且在洗脫感興趣蛋白質之 前流過復合層析材料的緩沖液。清洗緩沖液可用于自復合層析材料清除一種或多種污染 物，基本上不洗脫期望抗體產物。依照本文中發(fā)明的優(yōu)選實施方案，使用"第一清洗緩沖液" 和"第二清洗緩沖液"。
[0024] 術語"洗脫緩沖液"用于自固相洗脫感興趣抗體。在本文中，洗脫緩沖液具有相對 于第二清洗緩沖液更低pH，使得期望抗體產物自復合層析介質中洗脫。
[0025] 術語"多聚體"（D/A)可以理解為相同抗體的非共價結合，由兩個以上的抗體結合 而成的分子。所述抗體可以由單鏈抗體共價結合（例如二硫鍵）的均質或異質多條多肽構 成。本發(fā)明的多聚體可溶于水溶液。例如，二聚體是兩個IgG分子的非特異性結合。多聚體的 形成與對天然抗體折疊和抗體結構的變形影響因素緊密相關。例如，高鹽與極端pH誘導抗 體變性形成多聚體。
[0026] 本發(fā)明中的數(shù)字均為近似值，無論有否使用"大約"或"約"等字眼。數(shù)字的數(shù)值有 可能會出現(xiàn)1%、2%、5%、7%、8%、10%等差異。每當公開一個具有N值的數(shù)字時，任何具有 N+/-1%，N+/-2%，N+/-3%，N+/-5%，N+/-7%，N+/-8% 或N+/-10%值的數(shù)字會被明確地公 開，其中是指加或減，并且N-10%到N+10%之間的范圍也被公開。例如，對于"第二清 洗緩沖液的pH為約6.0"，則有6.0+/-1 %，6.0+/-2 %，6.0+/-3 %，6.0+/-5 %，6.0+/-7 %， 6.0+/-8 %和6.0+/-10 %的值被同時公開，同時，pH6.0-10%到pH6.0+10 %之間的溫度范圍 也屬于公開的范圍，亦即pH5.4-pH6.6及其之間的值，都在第二清洗緩沖液pH值的包含范圍 內。
[0027] 本發(fā)明使用的定義"或"表示備選方案，如果合適的話，可以將它們組合，也就是 說，術語"或"包括每個所列出的單獨備選方案以及它們的組合。例如，"污染物選自宿主細 胞蛋白、多聚體或細胞培養(yǎng)基"表示在一些實施方式中，污染物可以是宿主細胞蛋白、多聚 體、細胞培養(yǎng)基之中的一種，也可以是其一種以上的組合。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明實施例1的純化色譜圖。
[0029] 圖2是本發(fā)明實施例1的非還原純度檢測圖譜。
[0030]圖3是本發(fā)明實施例1-3的上樣前多聚體檢測圖譜。
[0031] 圖4是本發(fā)明實施例1的純化后樣品檢測圖譜。
[0032] 圖5是本發(fā)明實施例2的純化色譜圖。
[0033] 圖6是本發(fā)明實施例2的非還原純度檢測圖譜。
[0034] 圖7是本發(fā)明實施例2的純化后樣品檢測圖譜。
[0035] 圖8是本發(fā)明實施例3的純化色譜圖。
[0036] 圖9是本發(fā)明實施例3的非還原純度檢測圖譜。
[0037] 圖10是本發(fā)明實施例3的純化后樣品檢測圖譜。
【具體實施方式】
[0038] 本發(fā)明采用改造的CH0細胞分泌的單克隆抗體進行抗體的純化制備，該細胞是經 基因工程的CH0細胞，能穩(wěn)定高效表達抗TNF-α (在本發(fā)明實施方式中采用阿達木單抗）；用 機械攪拌式生物反應器，大規(guī)模高密度懸浮培養(yǎng)CH0細胞，首先通過多次離心去除細胞碎片 及有形物，再通過過濾再一步降低濁度，采用離子交換及疏水復合層析介質，當pH大于5.8 時復合層析介質不帶電，調節(jié)組合物pH大于5.8小于目標抗體的平均pi，靠疏水作用結合目 標抗體，然后使用第一清洗緩沖液來清洗層析介質，繼而用更低pH的第二清洗緩沖液清洗 層析介質，最后用pH低于第二清洗緩沖液的洗脫液洗脫目標抗體。具體的包括如下步驟： [0039] (1)選取復合層析介質
[0040]復合層析介質是同時帶有離子交換與疏水作用的填料，其中疏水作用體現(xiàn)于結合 目標抗體，而電荷排斥作用體現(xiàn)于洗脫目標抗體。
[0041 ] (2)調節(jié)待純化樣品（含目標抗體)的pH至6.5-7.0，第一緩沖液的pH約為6.5-7.0， 第二清洗緩沖液的pH約為5.6-6.0，洗脫緩沖液的pH約為4.6-4.8(電導率設定為16-18ms/ cm以及包含0-0 · 15MNaCl，1~4%乙醇，7~10mM苯丁酸鈉以及0 · 05~0 · 3M尿素）
[0042] (3)層析流速設定為200-250cm/h〇
[0043] (4)檢測收集的洗脫樣品，目標抗純體純度至少90%。
[0044] 本發(fā)明實施例中所用水均為去離子水。
[0045] 以下所述的是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明所保護的不限于以下優(yōu)選實施方 式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發(fā)明創(chuàng)造構思的基礎上，做出的若干變形和 改進，都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例中所用的原料或耗材均可以通過商業(yè)途徑獲得。
[0046] 實施例1
[0047] 一)細胞液澄清
[0048] 采用eppendorf離心機，lOOOOg離心CH0細胞培養(yǎng)上清2次，除去細胞及細胞碎片， 過0.2μηι濾膜，進一步降低樣品池度。
[0049] 二)復合層析
[0050] 利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)層析系統(tǒng)，將 1.2ml MEP(PALL公司）復 合層析介質裝載于TricornlO/20(GE公司）層析柱中。以平衡緩沖液(50mM PBS pH7.0)充分 平衡復和層析柱，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以第一 清洗緩沖液（50mM PBS pH7.0)沖洗未結全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導 率、pH保持穩(wěn)定后，然后用第二清洗緩沖液(50mM PBS pH6.0)進行沖洗，待280nm的紫外吸 收回到基純，且電導率、P Η保持穩(wěn)定后，用洗脫緩沖液（5 0 m Μ醋酸緩沖液+0.15 Μ N a C1， pH4.6，1 %乙醇，7mM苯丁酸鈉，0.05M尿素)直接洗脫，收集洗脫液。
[0051] 其純化色譜圖見圖1，其92ml的峰為目的收集峰。詳細洗脫參數(shù)見表1 [0052]表1實施例1的詳細洗脫參數(shù)
[0053]
[0054] 三)結果檢測
[0055] 毛細管凝膠電泳(CGE)測純度：
[0056] 將100yg樣品加入離心管中，用超濾管除鹽，加入碘乙酰胺及上樣緩沖液，加熱 lOmin，放入毛細管樣品盤，進行測定。測定結果見圖2,28.3min的峰為完整抗體峰，經CGE測 定MEP純化后的樣品純度由面積積分計算為92.32%，
[0057]凝膠過濾層析(SEC)測定多聚體(D/A)
[0058] 利用自動化的安捷倫HPLC系統(tǒng)，流動相A(50mM PBS+5%乙腈)平衡Thermo分子篩 分析柱(5μπι)。檢測波長:280nm，流速:0.5ml/min，洗脫梯度：100 % A相，檢測時間：35min，將 樣品用徑〇.2μπι水系濾膜過濾后上樣40yg。檢測結果見表4、圖3與圖4。由表4和圖3、圖4可 見，141^11的峰為多聚體峰，1611^11的峰為單體峰，其0/^含量由4.2降為0.5%。可見，復合層 析能夠有效地去除D/A，有效地保證了產品質量。
[0059] ELISA 測定 HCP
[0060] 用 Cy gnu s 公司的 HCP檢測試劑盒（Immuno enz yme tr i c As say for the Measurement of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins，F(xiàn)015，Cygnus Technologies).參照試劑盒說明書，具體操作步驟如下：
[0061 ] (1)向每個離心管中分別加入200μ1的標準品（0-80ng/ml)、對照品、檢測樣品；
[0062] (2)每個離心管中分別加入400μ 1的堿性磷酸酶標記的抗CH0 HCP抗體；
[0063] (3)蓋好離心管，混勻，室溫孵育2小時
[0064] (4)向96孔板條中轉移已經反應好的以上混合液，每孔200μ1;
[0065] (5)蓋好板條，并放入密封的塑料袋，室溫下200rpm轉動孵育2小時；
[0066] (6)甩干板條中的液體，加清洗液350μ1，再甩干，重復4次；
[0067] (7)每孔中加入200μ1的顯色劑；
[0068] (8)蓋好板條，孵育90min;
[0069] (9)405/492nm 讀值。
[0070] 檢測結果顯示（見表4)，大部分HCP被去除，大約降至1/37,產品中殘留的HCP為 216.45ppm，可見，本發(fā)明提供的方法具有良好的去除HCP效果，與proteinA除HCP效果相差 不大。經計算抗體回收率為94.3 %。
[0071] 實施例2
[0072] 一)細胞液澄清
[0073] 采用eppendorf離心機，10000g離心CH0細胞培養(yǎng)上清2次，除去細胞及細胞碎片， 過0.2μηι濾膜，進一步降低樣品池度。
[0074]二)復合層析
[0075]利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)層析系統(tǒng)，將 1.2ml MEP(PALL公司）復 合層析介質裝載于TricornlO/20(GE公司）層析柱中。以平衡緩沖液(50mM PBS pH7.0)充分 平衡復和層析柱，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導率、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以第 一清洗緩沖液(50mM PBS pH7.0)沖洗未結全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導 率、pH保持穩(wěn)定后，然后用第二清洗緩沖液(50mM PBSpH6.0)進行沖洗，待280nm的紫外吸收 回到基純，且電導率、pH保持穩(wěn)定后，用洗脫緩沖液(50mM醋酸緩沖液+0.15M NaCl，pH4.6， 1 %乙醇，9mM苯丁酸鈉，0.15M尿素)直接洗脫，收集洗脫液。其純化色譜圖見圖5，其89ml的 峰為目的收集峰。詳細洗脫參數(shù)見表2 [0076]表2實施例2的詳細洗脫參數(shù)
[0077]
[0079]三)結果檢測
[0080]毛細管凝膠電泳(CGE)測純度：
[0081 ]將1 〇 〇 μ g樣品加入離心管中，用超濾管除鹽，加入碘乙酰胺及上樣緩沖液，加熱 lOmin，放入毛細管樣品盤，進行測定。測定結果見圖6,28.3min的峰為完整抗體峰，經CGE測 定MEP純化后的產品純度由面積積分計算為92.43 %，
[0082]凝膠過濾層析(SEC)測定多聚體(D/A)
[0083] 利用自動化的安捷倫HPLC系統(tǒng)，流動相A(50mM PBS+5%乙腈)平衡Thermo分子篩 分析柱(5μπι)。檢測波長:280nm，流速:0.5ml/min，洗脫梯度：100 % A相，檢測時間：35min，將 樣品用徑〇.2μπι水系濾膜過濾后上樣40yg。檢測結果見表4、圖3與圖7。由表4和圖7可見， 14min的峰為多聚體峰，16min的峰為單體峰，其D/A含量由4.2降為0.7%?？梢?，復合層析能 夠有效地去除D/A，有效地保證了產品質量。
[0084] ELISA 測定 HCP
[0085] 用 Cy gnu s 公司的 HCP檢測試劑盒（Immuno enz yme tr i c As say for the Measurement of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins,F015,Cygnus Technologies).參照試劑盒說明書，具體操作步驟如下：
[0086] (1)向每個離心管中分別加入200μ1的標準品（0-80ng/ml)、對照品、檢測樣品；
[0087] (2)每個離心管中分別加入400μ1的堿性磷酸酶標記的抗CH0 HCP抗體；
[0088] (3)蓋好離心管，混勻，室溫孵育2小時
[0089] (4)向96孔板條中轉移已經反應好的以上混合液，每孔200μ 1;
[0090] (5)蓋好板條，并放入密封的塑料袋，室溫下200rpm轉動孵育2小時；
[0091] (6)甩干板條中的液體，加清洗液350μ1，再甩干，重復4次；
[0092] (7)每孔中加入200μ1的顯色劑；
[0093] (8)蓋好板條，孵育90min;
[0094] (9)405/492nm 讀值。
[0095] 檢測結果顯示（見表4)，大部分HCP被去除，大約降至1/32,產品中殘留的HCP為 242. OOppm，可見，本發(fā)明提供的方法具有良好的去除HCP效果，與proteinA除HCP效果相差 不大。
[0096] 經計算抗體回收率為93.9%。
[0097] 實施例3
[0098] 一)細胞液澄清
[0099] 采用eppendorf離心機，10000g離心CH0細胞培養(yǎng)上清2次，除去細胞及細胞碎片， 過0.2μηι濾膜，進一步降低樣品池度。
[0100]二)復合層析
[0101] 利用AKTA purifier-100(GE Healthcare)層析系統(tǒng)，將 1.2ml MEP(PALL公司）復 合層析介質裝載于TricornlO/20(GE公司）層析柱中。以平衡緩沖液(50mM PBS pH7.0)充分 平衡復和層析柱，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導、pH保持穩(wěn)定時開始上樣，再以第一 清洗緩沖液(50mM PBS pH7.0)沖洗未結全合蛋白，待280nm的紫外吸收回到基線，且電導、 pH保持穩(wěn)定后，然后用第二清洗緩沖液(50mM PBS pH6.0)進行沖洗，待280nm的紫外吸收回 到基純，且電導、pH保持穩(wěn)定后，用洗脫緩沖液(50mM醋酸緩沖液+0.15MNaCl，pH4.6，3 %乙 醇，9mM苯丁酸鈉，0.15M尿素)直接洗脫，收集洗脫液。其純化色譜圖見圖8，其87ml的峰為目 的收集峰。詳細洗脫參數(shù)見表3
[0102] 表3實施例3的詳細洗脫參數(shù)
[0103]
[0104J 三）結果檢測
[0105] 毛細管凝膠電泳(CGE)測純度：
[0106] 將100yg樣品加入離心管中，用超濾管除鹽，加入碘乙酰胺及上樣緩沖液，加熱 lOmin，放入毛細管樣品盤，進行測定。測定結果見圖9,28.3min的峰為完整抗體峰，經CGE測 定MEP純化后的產品純度由面積積分計算為91.92%，
[0107] 凝膠過濾層析(SEC)測定多聚體(D/A)
[0108] 利用自動化的安捷倫HPLC系統(tǒng)，流動相A(50mM PBS+5%乙腈)平衡Thermo分子篩 分析柱(5μπι)。檢測波長:280nm，流速:0.5ml/min，洗脫梯度：100 % A相，檢測時間：35min，將 樣品用徑0.2μπι水系濾膜過濾后上樣40yg。檢測結果見表4、圖3與圖10。由表4和圖10可見， 141]1丨11的峰為多聚體峰，161]1丨11的峰為單體峰，其0/^含量由4.2降為0.4%?？梢姡琞\^^復合層 析介質能夠有效地去除D/A，有效地保證了產品質量。
[0109] ELISA 測定 HCP
[0110] 用 Cy gnu s 公司的 HCP檢測試劑盒（Immuno enz yme tr i c As say for the Measurement of Chinese Hamster Ovary Host Cell Proteins，F(xiàn)015，Cygnus Technologies).參照試劑盒說明書，具體操作步驟如下：
[0111] (1)向每個離心管中分別加入200μ1的標準品（0-80ng/ml)、對照品、檢測樣品；
[0112] (2)每個離心管中分別加入400μ1的堿性磷酸酶標記的抗CH0 HCP抗體；
[0113] (3)蓋好離心管，混勻，室溫孵育2小時
[0114] (4)向96孔板條中轉移已經反應好的以上混合液，每孔200μ1;
[0115] (5)蓋好板條，并放入密封的塑料袋，室溫下200rpm轉動孵育2小時；
[0116] (6)甩干板條中的液體，加清洗液350μ1，再甩干，重復4次；
[0117] (7)每孔中加入200μ1的顯色劑；
[0118] (8)蓋好板條，孵育90min;
[0119] (9)405/492nm 讀值。
[0120] 檢測結果顯示（見表4)，大部分HCP被去除，大約降至1/35,產品中殘留的HCP為 229.1 lppm，可見，本發(fā)明提供的方法具有良好的去除HCP效果，與proteinA除HCP效果相差 不大。
[0121] 經計算抗體回收率為93.5%。
[0122] 表4實施例1-3的檢測結果
[0123]
【主權項】
1. 一種抗TNF-α類單克隆抗體的層析方法，包括以下步驟： 1) 將抗TNF-α類單抗組合物加載到復合層析材料上； 2) 用pH 7.0~7.4的第一清洗緩沖液清洗所述復合層析材料； 3) 用pH低于第一清洗緩沖液的的第二清洗緩沖液清洗所述復合層析材料； 4) 用pH低于第二清洗緩沖液、含有7~10mM的苯丁酸鈉、0.05~0.3M尿素以及1~4%體 積含量乙醇的洗脫緩沖液洗脫； 其中，所述的抗TNF-a類單抗組合物pH為6.0~7.0;所述的復合層析材料為離子交換作 用和疏水作用的復合介質;所述的污染物包括宿主細胞蛋白。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)為用pH低于第二清洗緩沖液、含有7 ~9mM的苯丁酸鈉、0.05~0.15M尿素以及1~3 %體積含量乙醇的洗脫緩沖液洗脫。3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)為用pH低于第二清洗緩沖液、含有 8mM的苯丁酸鈉、0.1M尿素以及2%體積含量乙醇的洗脫緩沖液洗脫。4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的污染物選自宿主細胞蛋白、多聚體 或細胞培養(yǎng)基。5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的第二清洗緩沖液的pH為5.6 ~6 · 0〇6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的第二清洗緩沖液的pH為6.0。7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的洗脫緩沖液pH為4.6~4.8。8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的洗脫緩沖液pH為4.8。9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的第一清洗緩沖液為50mM roS;步驟3)所述的第二清洗緩沖液為50mM roS;步驟4)所述的洗脫緩沖液為50mM NaAc-HAc+150mM NaCl。10. 根據(jù)權利要求1~9任一項所述的方法，其特征在于，所述復合層析材料為PALL公司 的MEP復合填料。11. 根據(jù)權利要求1~9任一項所述的方法，其特征在于，所述的TNF-α類單克隆抗體為 阿達木單抗。
【文檔編號】C07K1/18GK105837687SQ201610158762
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月18日
【發(fā)明人】楊輝, 馬旭通, 楊彬, 孫文正, 李文佳, 蘇彥景
【申請人】廣東東陽光藥業(yè)有限公司