抗病相關(guān)蛋白在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗病相關(guān)蛋白在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的應(yīng)用中，抗病相關(guān)蛋白是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質(zhì)；A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病相關(guān)的蛋白質(zhì)；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。實驗證明，本發(fā)明的抗病相關(guān)蛋白及其編碼基因可以調(diào)控植物的抗病性，提高抗病相關(guān)蛋白的表達可以提高植物的抗病性，降低抗病相關(guān)蛋白的表達可以降低植物的抗病性，可以利用抗病相關(guān)蛋白及其編碼基因調(diào)控植物的抗病性。
【專利說明】
抗病相關(guān)蛋白在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中抗病相關(guān)蛋白在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻不僅是世界上最為重要的糧食作物，約有全球半數(shù)以上人口以此為食，它還 是單子葉植物研究的模式植物。然而，在可耕地面積不斷減少，人口數(shù)量不斷膨脹的形勢 下，水稻產(chǎn)量已成為影響我國糧食安全的重要因素之一。雖然經(jīng)歷了綠色革命和雜交技術(shù) 的廣泛應(yīng)用，但病蟲害，惡劣的自然環(huán)境等因素依然嚴(yán)重地制約了水稻產(chǎn)量的增長。白葉枯 病是水稻生產(chǎn)中的所遇到的非常嚴(yán)重的病害，水稻感染上白葉枯病后，一般減產(chǎn)20-30%， 甚至絕收。鑒定和分離水稻抗白葉枯病基因，特別是生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的廣譜抗病基因已成 為水稻分子育種的重要環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高植物的抗病性。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了抗病相關(guān)蛋白在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng) 用;所述抗病相關(guān)蛋白的名稱為0sAPX8,是如下Al)、A2)或A3):
[0005] Al)氨基酸序列是序列2的蛋白質(zhì)；
[0006] A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物抗病相關(guān)的蛋白質(zhì)；
[0007] A3)在Al)或A2)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。
[0008] 為了使Al)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0009] 表1、標(biāo)簽的序列
[0011] 上述A2)中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10 個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012] 上述A2)中OsAPXS可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 [0013] 上述A2)中0sAPX8的編碼基因可通過將序列1或序列4所示的DNA序列中缺失一個 或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/ 或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0014] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與OsAPXS相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物抗病 性中的應(yīng)用;所述生物材料為下述Bl)至B16)中的任一種：
[0015] BI)編碼0sAPX8的核酸分子；
[0016] B2)含有BI)所述核酸分子的表達盒；
[0017] B3)含有BI)所述核酸分子的重組載體；
[0018] B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；
[0019] B5)含有BI)所述核酸分子的重組微生物；
[0020] B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；
[0021 ] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0022] B8)含有M)所述重組載體的重組微生物；
[0023] B9)含有BI)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0024] B10)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；
[0025] B11)含有BI)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0026] Bl 2)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；
[0027] Bl 3)含有Bl)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0028] B14)含有B2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；
[0029] B15)降低0sAPX8表達的核酸分子；
[0030] B16)含有B15)所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因植物細胞 系。
[0031] 上述應(yīng)用中，BI)所述核酸分子可為如下bl)_b5)中任一種：
[0032] bl)編碼序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
[0033] b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
[0034] b3)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子；
[0035] b4)與bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼 0sAPX8的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0036] b5)在嚴(yán)格條件下與bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼0sAPX8的cDNA 分子或基因組DNA分子；
[0037] Bl 5)所述核酸分子為與序列4所不的DNA分子中任一片段反向互補的DNA分子。
[0038] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0039]其中，序列1所示的DNA分子編碼序列2所示的蛋白質(zhì)。序列3來源于水稻，為OsAPXS 基因的基因組序列，序列4為0sAPX8基因的cDNA序列。
[0040] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方 法，對本發(fā)明的編碼OsAPXS的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分 離得到的OsAPXS的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼OsAPXS且具有 OsAPXS功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0041] 這里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件 進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％)表示，其可以 用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0042] 上述應(yīng)用中，所述嚴(yán)格條件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜 2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次15min; 或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0043] 上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0044] 上述應(yīng)用中，B2)所述的含有編碼0sAPX8的核酸分子的表達盒(0sAPX8基因表達 盒），是指能夠在宿主細胞中表達0sAPX8的DNA，該DNA不但可包括啟動0sAPX8基因轉(zhuǎn)錄的啟 動子，還可包括終止OsAPXS基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。 可用于本發(fā)明的啟動子包括但不限于:組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和 誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S:來自西 紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶（〃1^^〃，〇1 &〇等人（1999)?1&的？1^以〇1120: 979-992);來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)I(PRl)(由水楊酸和BTH(苯并噻二 唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo)）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用 茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo)）；熱休克啟動子(美國專利5，187,267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(美國專利 5,057,422);種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子?？128(0附010631398(中國專利 200710099169.7))，種子IC存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大 豆beta conglycin的啟動子(Beachy等人（1985)EMB0 J.4:3047-3053))。它們可單獨使用 或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止 子包括但不限于:農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子）、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止 子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如:Ode 11 等人（I985)Nature 313:810; Rosenberg等人（1987)Gene，56:125;Guerineau等人（1991) Mol .Gen.Genet，262:141;Proudfoot(1991)Cell ,64:671;Sanfacon等人Genes Dev·，5: 141 ;Mogen等人（1990)Plant Cell，2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene ,91:151 ;Ballad等人 (1989)Nucleic Acids Res.l7:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。 [0045]可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有0sAPX8基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體 包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司）等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷 酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷 酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；颍ㄈ珉僦瑝A合成酶基因 Nos)、 植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因 構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可 以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整 個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細 胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編 碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等）、抗生素的標(biāo)記基 因（如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar 基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對草 甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能 力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基 因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0046]上述應(yīng)用中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述質(zhì)粒具體可為 PCAMBIA1300或 pANDA，也可為將 pCAMBIA1300 改造后得到的載體，如 pCAMBIA1300-35S。 [0047] B3)所述重組載體可含有序列1、序列3或序列4所示的用于編碼OsAPXS的DNA序列； 進一步 B3)所述重組載體具體可為 pCAMBIA1300-35S-0sAPX8。所述 pCAMBIA1300-35S-0sAPX8為將pCAMBIA1300-35S的EcoRI和XbaI識別位點間的DNA序列替換為序列4所示的DNA 序列得到的表達序列2所示的OsAPXS的重組載體。
[0048] B16)所述重組載體可含有降低OsAPXS表達的核酸分子。在本發(fā)明的一個實施例 中，所述重組載體為pANDA-〇sAPX8i，pANDA-〇sAPX8i的LB與RB間的結(jié)構(gòu)如下：
[0049] Ubiquitin啟動子-反向 APX492-gus I inker-正向APX492-N0S終止子，pANDA-0sAPX8i的其他序列與pANDA相同。
[0050] 上述應(yīng)用中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌。所述細菌具體可為農(nóng)桿菌，如 農(nóng)桿菌EHA105。
[0051] 上述應(yīng)用中，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0052]上述應(yīng)用中，B15)所述核酸分子具體可為與序列表中序列4的第1108-1599位核苷 酸所示的DNA片段反向互補的DNA分子。
[0053]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了 OsAPXS或所述生物材料的下述任一應(yīng)用：
[0054] Hl、在培育抗病性增加或降低植物中的應(yīng)用；
[0055] H2、在制備提高或降低植物抗病性產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0056] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述Gl或G2:
[0057] Gl、0sAPX8或所述生物材料；
[0058] G2、調(diào)控植物抗病性產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有0sAPX8或所述生物材料。
[0059]上述產(chǎn)品中，所述調(diào)控植物抗病性產(chǎn)品可以以O(shè)sAPXS或所述生物材料作為活性成 分，還可以將OsAPXS或所述生物材料與其它抗病性物質(zhì)進行組合得到的組合物作為活性成 分。
[0060]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述Ml)或M2):
[0061 ] Ml)培育抗病性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入下述1)或2)得到轉(zhuǎn)基 因植物；
[0062] I )0sAPX8的編碼基因；
[0063] 2)含有0sAPX8的編碼基因的表達盒；
[0064]所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗病性增加；
[0065] M2)培育抗病性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括降低目的植物中0sAPX8的編碼基 因的表達，得到抗病性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
[0066]上述方法中，降低目的植物中OsAPXS的編碼基因的表達可通過將B15)所述核酸分 子導(dǎo)入所述目的植物實現(xiàn)。
[0067] 上述方法中，OsAPXS的編碼基因可為BI)所述核酸分子;所述表達盒為B2)所述表 達盒。
[0068]在本發(fā)明的實施例中，所述OsAPXS的編碼基因（即序列1所示的DNA分子)通過含有 0sAPX8基因表達盒的0sAPX8基因重組表達載體導(dǎo)入目的植物中。所述0sAPX8基因表達盒 中，啟動0sAPX8基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S。
[0069]上述方法中，其中所述OsAPXS基因可先進行如下修飾，再導(dǎo)入受體種子植物中，以 達到更好的表達效果：
[0070] 1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達;例如，可根據(jù)受體植物所偏 愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述OsAPXS基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合植物 偏愛性;優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物 中導(dǎo)入基因的高水平表達，其中GC含量可為35%、多于45%、多于50%或多于約60% ;
[0071] 2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始;例如，利用在植物中已 知的有效的序列進行修飾；
[0072] 3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達;所述啟動子可包括 組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的 選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性 表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定;盡管證明了來源于雙子葉植物的許多 啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于 雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；
[0073] 4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于 CaMV的tml，來源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明 基因進行連接；
[0074] 5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列（例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列 (例如來源于TMV，MCMV和AMV)。
[0075] 所述0sAPX8基因表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn) 化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化 的植物組織培育成植株。
[0076] 所述方法還包括從導(dǎo)入序列1、序列3或序列4所示的OsAPXS的編碼基因的植株中 篩選表達所述編碼基因的植株，得到轉(zhuǎn)基因植物。
[0077]在本發(fā)明的一個實施例中，與序列表中序列4的第1108-1599位核苷酸所示的DNA 片段反向互補的DNA分子通過pANDA載體導(dǎo)入所述目的植物中。
[0078]本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述OsAPXS基因轉(zhuǎn)化目的植物得到 的第一代轉(zhuǎn)基因植物和降低〇sAPX8表達的轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可 以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種， 特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。
[0079] 本發(fā)明中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物;所述目的植物和所述受體植 物均可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物可為禾本科植物。所述禾本科植物可 為水稻。
[0080] 本發(fā)明中，所述抗病性可為抗白葉枯病。所述白葉枯病由白葉枯病菌引起，如白葉 枯病菌菲律賓小種PX099引起的白葉枯病。
[0081 ]實驗證明，本發(fā)明的0SAPX8及其編碼基因可以調(diào)控植物的抗病性，提高0SAPX8的 表達可以提高植物的抗病性，降低0sAPX8的表達可以降低植物的抗病性:利用白葉枯病侵 染0sAPX8表達升高的植物(轉(zhuǎn)基因植株甲）與0sAPX8表達降低的植物(轉(zhuǎn)基因植株乙）后發(fā) 現(xiàn)，接種病菌5天后轉(zhuǎn)基因植株甲的病斑長度為0.5±0.3cm，顯著短于野生型植株的病斑長 度（1.5±0.3cm)，轉(zhuǎn)基因植株乙的病斑長度為2.3±0.2cm，顯著長于野生型植株的病斑長 度（1.5 ± 0.3cm)。說明，可以利用0sAPX8及其編碼基因調(diào)控植物的抗病性。
【附圖說明】
[0082]圖1為轉(zhuǎn)基因植株的半定量RT-PCR結(jié)果。其中，泳道1-4分別為轉(zhuǎn)基因植株甲的四 個株系，泳道5-8分別為轉(zhuǎn)基因植株丁的四個株系，Marker表不DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0083]圖2為各轉(zhuǎn)基因水稻的抗病性檢測結(jié)果。其中，tAPX80X表示轉(zhuǎn)基因水稻甲， tAPX8Ri表示轉(zhuǎn)基因水稻乙，TP309-CK表示水稻品種"TP309"。
【具體實施方式】
[0084]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0085] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0086] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0087]下述實施例中的白葉枯病菌菲律賓小種PX099，為文獻(水稻白葉枯病數(shù)量抗性座 位定位及其小種專化性.作物學(xué)報，2006,32(11) :1611-1617))中的菲律賓小種P6,經(jīng)中國 農(nóng)科院作物科學(xué)研究所周永力同意后，公眾可從
【申請人】處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā) 明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。
[0088] 實施例1、0sAPX8可以調(diào)控水稻的抗病性
[0089]本發(fā)明提供了來源于水稻品種"TP309"的抗病相關(guān)蛋白，其名稱為0sAPX8。0sAPX8 的氨基酸序列如序列表中序列2所示，OsAPXS編碼基因的基因組序列如序列3所示，OsAPXS 的編碼序列如序列1所，0sAPX8基因 cDNA序列如序列表中序列4所示，序列4的第31-1467位 與序列1相同。
[0090] 一、轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建
[0091] 1、重組載體的構(gòu)建
[0092] 將pCAMBIA1300-35S的EcoRI和XbaI識別序列間的DNA片段替換為序列4所示的DNA 分子，保持載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重組載體命名為PCAMBIA1300-35S-0sAPX8 dCAMBIAl 300-35S-0sAPX8能表達序列2所示的抗病相關(guān)蛋白0sAPX8。
[0093] 其中，pCAMBIA1300-35S按照如下方法制備：利用BstXI和KpnI內(nèi)切酶將雙元載體 pEZR_LN(由英國Glasgow 大學(xué) John Christie 教授贈送）（The Plant Cell，2003，Vol.l5, 1781-1794)上的含355啟動子的1692&口片段替換掉口041?141300的88丨乂1和恥111之間的 268bp 片段，構(gòu)建成含 EcoRI-KpnI-SmaI-BamHI-XbaI 多克隆位點的 pCAMBIA1300-35S 載體。 其中，PCAMBIA1300 為 cambia 產(chǎn)品。
[0094] 提取水稻品種"TP309"的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，用F2和R2組成的 引 物對進行 PCR 擴增（FSW-CCAGCCGTCGAAGAGAAGGATCC-SSl^W-CACATGCCCATCCTTTTACCTC-S' ) ， 將得到的 492bp 的 PCR 擴增產(chǎn)物 APX492 ， 克隆到 pENTR?/SD/ D-TOPO?載體(賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific)產(chǎn)品），將序列正確的重 組載體命名為pENTR-〇sAPX8i;用LR Clonase II Plus Enzyme Mix，將pENTR-〇sAPX8i質(zhì)粒 與pANDA載體(Proc Natl Acad Sci U S A 103,10503-10508(2006))重組，將序列正確的 重組載體命名為pANDA-〇sAPX8i。pANDA-〇sAPX8 i的LB與RB間的結(jié)構(gòu)如下：Ubi qui tiη啟動 子-反向 APX492_gus I inker-正向 APX492-N0S終止子，pANDA-〇sAPX8 i 的其他序列與pANDA相 同。
[0095] 將pCAMBIA1300-35S-0sAPX8導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105(Plant Molecular Biology, 2003,52:957-966)中，將得到的重組菌命名為E-pCAMBIA1300-35S-0sAPX8，將 PCAMBIA1300-35S導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，將得到的重組菌命名為E-pCAMBIA1300-35S; 將pANDA-〇sAPX8i導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，將得到的重組菌命名為E-pANDA-〇sAPX8i，將 pANDA導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，將得到的重組菌命名為E-pANDA。
[0096] 2、轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建
[0097] 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法（Kumar e t a 1 .，200 5 )利用步驟1的E-pCAMBIA1300-35S-0sAPX8轉(zhuǎn)化水稻品種"TP309"的成熟胚愈傷組織，采用50mg/L潮霉素篩 選抗性愈傷組織，然后經(jīng)過預(yù)分化、分化、生根后得到To代轉(zhuǎn)OsAPXS基因植株，將其命名為T0 代轉(zhuǎn)基因水稻甲。利用E-pCAMBIA1300-35S轉(zhuǎn)化水稻品種"TP309"，得到To代轉(zhuǎn)空載體水稻， 將其命名為To代轉(zhuǎn)基因水稻丙，作為對照。
[0098] 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法（Kumar et al. ,2005)利用步驟1的E-pANDA-0sAPX8i轉(zhuǎn)化水稻品種"TP309"的成熟胚愈傷組織，采用50mg/L潮霉素篩選抗性愈傷組織， 然后經(jīng)過預(yù)分化、分化、生根后得到To代0sAPX8基因 RNAi植株，將其命名為To代轉(zhuǎn)基因水稻 乙。利用pANDA轉(zhuǎn)化水稻品種"TP309"，得到To代轉(zhuǎn)空載體水稻，將其命名為To代轉(zhuǎn)基因水稻 丁，作為對照。
[0099] 利用潮霉素抗性基因上的引物對（Hyg.Fd'-GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-S'與 Hyg+Rj' -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3')對To代轉(zhuǎn)基因水稻甲、To代轉(zhuǎn)基因水稻乙、To代 轉(zhuǎn)基因水稻丙與To代轉(zhuǎn)基因水稻丁進行基因組水平上的鑒定，將水稻品種"TP309"作為陰 性對照，結(jié)果顯示，To代轉(zhuǎn)基因水稻甲、To代轉(zhuǎn)基因水稻乙、To代轉(zhuǎn)基因水稻丙與To代轉(zhuǎn)基因 水稻丁中均含有潮霉素抗性基因，水稻品種"TP309"無含目的DNA的載體片段。
[0100] 提取To代轉(zhuǎn)基因植株甲、To代轉(zhuǎn)基因植株乙、To代轉(zhuǎn)基因植株丙、To代轉(zhuǎn)基因植株 丁和水稻品種"TP309"的葉片總RNA進行半定量RT-PCR分析，引物為F : 5 ' -gctgcgaaatactcctacg-3 ' 和R: 5 ' -AGAGGAGGTCATCAGACCATCG-3 '，采用Act in作為內(nèi)參。結(jié)果 顯示，轉(zhuǎn)基因植株丙、轉(zhuǎn)基因植株丁和水稻品種"TP309"中的OsAPXS基因的表達水平無顯著 差異，0sAPX8基因在轉(zhuǎn)基因植株甲中的表達顯著高于水稻品種"TP309"（圖1)，轉(zhuǎn)基因植株 乙中幾乎檢測不到0sAPX8基因的表達(圖1)，轉(zhuǎn)基因植株乙中0sAPX8基因的表達受到抑制。
[0101] 二、轉(zhuǎn)基因水稻抗病性檢測
[0102] 用白葉枯病菌菲律賓小種PX099侵染正常培養(yǎng)至分蘗期的To代轉(zhuǎn)基因植株甲、T0代 轉(zhuǎn)基因植株乙、To代轉(zhuǎn)基因植株丙、To代轉(zhuǎn)基因植株丁和水稻品種"TP309"，檢測各水稻的抗 病性，實驗重復(fù)三次，具體方法如下：
[0103] 將保存-70°C的白葉枯菌菲律賓小種PX099菌種于PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯300g/L，Ca (NO3) 2 · 4H20 0.5g/L，Na2HP〇4 · 12H20 2.0g/L，蔗糖 15g/L，瓊脂粉 15g/L)上復(fù)壯，保存于4 °C冰箱內(nèi)備用。在接種前2天在PSA平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，在28 °C培養(yǎng)72h，待細菌長的濃 密而均勻，用純凈水洗脫菌體，調(diào)節(jié)濃度至IO9個細胞/ml進行接種。具體接種方法參考 Kauf fman等（1973年）的接菌方法人工剪葉接種，每種水稻接種3-5個葉片，每個葉片減去頂 端3-5cm，接種兩周后當(dāng)病斑長度明顯且穩(wěn)定時進行調(diào)查，每一植株測量3-5個葉片。
[0104] 結(jié)果（圖2)顯示，To代轉(zhuǎn)基因植株丙、To代轉(zhuǎn)基因植株丁和水稻品種"TP309"的病斑 長度無顯著差異，水稻品種"TP309"的病斑長度為1.5 ± 0.3cm; To代轉(zhuǎn)基因植株甲的病斑長 度為0.5 ± 0.3cm，顯著短于水稻品種"TP309"的病斑長度;To代轉(zhuǎn)基因植株乙的病斑長度為 2.3±0.2cm，顯著長于水稻品種"TP309"的病斑長度。說明，提高0sAPX8基因的表達水平可 以提高水稻對白葉枯病菌引起的白葉枯病的抗性，降低0sAPX8基因的表達水平可以降低水 稻對白葉枯病菌引起的白葉枯病的抗性，表明，0sAPX8基因可以調(diào)控水稻對白葉枯病的抗 性。
【主權(quán)項】
1. 抗病相關(guān)蛋白在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；所述抗病相關(guān)蛋白是如下A1)、A2)或 A3)： A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質(zhì)； A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與植物抗病相關(guān)的蛋白質(zhì)； A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。2. 與權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白相關(guān)的生物材料在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用；所 述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種： B1)編碼權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； Β10)含有Β2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； Β11)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織； Β12)含有Β2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織； Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官； Β14)含有Β2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官； Β15)降低權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白表達的核酸分子； Β16)含有Β15)所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉(zhuǎn)基因植物細胞系。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于:Β1)所述核酸分子為如下bl )-b5)中任一種： bl)編碼序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子； b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子； b3)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子； b4)與bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求 1中所述抗病相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子； b5)在嚴(yán)格條件下與bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1中所述 抗病相關(guān)蛋白的cDNA分子或基因組DNA分子； B15)所述核酸分子為與序列4所不的DNA分子中任一片段反向互補的DNA分子。4. 權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白或權(quán)利要求2或3中所述生物材料的下述任一應(yīng)用： H1、在培育抗病性增加或降低植物中的應(yīng)用； H2、在制備提高或降低植物抗病性產(chǎn)品中的應(yīng)用。5. 下述G1或G2: G1、權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白或權(quán)利要求2或3中所述生物材料； G2、調(diào)控植物抗病性產(chǎn)品，含有權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白或權(quán)利要求2或3中所述 生物材料。6. 下述Ml)或M2): Ml)培育抗病性轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入下述1)或2)得到轉(zhuǎn)基因植 物； 1) 權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白的編碼基因； 2) 含有權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白的編碼基因的表達盒； 所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比抗病性增加； M2)培育抗病性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括降低目的植物中權(quán)利要求1中所述抗病 相關(guān)蛋白的編碼基因的表達，得到抗病性低于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：降低目的植物中權(quán)利要求1中所述抗病相 關(guān)蛋白的編碼基因的表達是通過將權(quán)利要求2或3中B15)所述核酸分子導(dǎo)入所述目的植物 實現(xiàn)的； 權(quán)利要求1中所述抗病相關(guān)蛋白的編碼基因為權(quán)利要求2或3中B1)所述核酸分子;所述 表達盒為權(quán)利要求2或3中B2)所述表達盒。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述應(yīng)用、權(quán)利要求5所述產(chǎn)品或權(quán)利要求6或7所述方法， 其特征在于:權(quán)利要求1-5中任一所述植物為單子葉植物或雙子葉植物;權(quán)利要求6或7中所 述目的植物和所述受體植物均為單子葉植物或雙子葉植物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用、所述產(chǎn)品或所述方法，其特征在于:所述單子葉植物為禾 本科植物。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述應(yīng)用，權(quán)利要求5所述產(chǎn)品，權(quán)利要求6或7所述方法， 或權(quán)利要求8或9所述應(yīng)用、所述產(chǎn)品或所述方法，其特征在于： 所述抗病性為抗白葉枯病，和/或，所述白葉枯病由白葉枯病菌引起。
【文檔編號】C12N15/29GK105859860SQ201610329917
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】江光懷, 翟文學(xué), 朱立煌
【申請人】中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所