植物倒伏和花器官發(fā)育調(diào)控蛋白ZmLA1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物倒伏和花器官發(fā)育調(diào)控蛋白ZmLA1及其編碼基因與應(yīng)用。所述蛋白ZmLA1來源于玉米（Zea?mays?L.），由序列表序列1所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)或所述基因可用于調(diào)控目的植物如下四種性狀中至少一種的應(yīng)用：生長素向基極性運輸效率、生長素側(cè)向運輸效率、莖稈抗倒伏能力和花器官發(fā)育；所述花器官發(fā)育性狀包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝數(shù)、雌穗穗柄長度、雌穗花絲數(shù)目、雌穗鮮重、果穗長度和結(jié)實率中的至少一種。本發(fā)明所提供的基因和蛋白在植物莖稈抗倒伏性、理想株型、花器官形態(tài)等一系列與產(chǎn)量直接相關(guān)性狀的改良中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】植物倒伏和花器官發(fā)育調(diào)控蛋白ZmLAI及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物倒伏和花器官發(fā)育調(diào)控蛋白ZmLAl及其編碼基因與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]作為最早為人類認(rèn)識的植物激素，生長素廣泛參與植物生長發(fā)育過程的各個階段。生長素的合成主要以兩種方式進行:色氨酸依賴途徑和非色氨酸依賴途徑。其合成部位主要包括植物頂端分生組織、葉原基、萌發(fā)的種子及花粉等新形成的組織。相較于生長素局部區(qū)域合成這一特性，生長素極性運輸( PAT)是引起植物生長素不均一分布的更主要原因。生長素運輸不同于其它植物激素，是以一種極性運輸?shù)姆绞竭M行，即體內(nèi)運輸方向是單向的，只能從植物體形態(tài)學(xué)上端向形態(tài)學(xué)下端運輸。通過這種極性運輸建立起的生長素濃度梯度特異介導(dǎo)了植物一系列生物學(xué)反應(yīng)，如:細(xì)胞伸長、細(xì)胞分化、根的伸長、向光性、重力性、頂端優(yōu)勢、花分化和果實形成等。這個過程需要兩類生長素運輸載體:輸入載體和輸出載體。擬南芥中已鑒定的生長素輸入載體主要有四類:AUX1，LAX1，LAX2和LAX3(類AUXl蛋白)。而輸出載體主要包括PIN蛋白家族，在擬南芥中現(xiàn)已鑒定出8個PIN基因，它們可分為兩類:長PIN蛋白(PIN1，2，3，4和7)主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，介導(dǎo)生長素細(xì)胞間極性運輸；短PIN蛋白(PIN5, 6和8)則定位于內(nèi)膜系統(tǒng)上,介導(dǎo)生長素的胞內(nèi)運輸。
[0003]擬南芥輸出載體除了 PIN蛋白家族外，最近研究發(fā)現(xiàn)多重抗藥性/磷酸糖蛋白家族(multidrug-resistant/P-glycoprotein,MDR/PGP,ABCB)也參與了生長素極性運輸。它是ATP結(jié)合盒(ATP—binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超級家族中的一個亞家族。其中，PGPl (ABCBl)是最早被發(fā)現(xiàn)與生長素極性運輸相關(guān)的PGP家族成員。另外，PGP4 (MDR4)和PGP19 (MDR1/ABCB19)也分別被證明作用于植物生長素的極性運輸。
[0004]植物重力性反應(yīng)體現(xiàn)為地上部正向重力性反應(yīng)和根負(fù)向重力性兩部分，正常的重力性反應(yīng)對根和地上部各器官的形態(tài)發(fā)育和生物學(xué)功能是必需的。早在近一個世紀(jì)之前，人們就提出Cholodny-Went假說，認(rèn)為生長素的不對稱分布是導(dǎo)致植物向重性和向光性等向性運動的原因。Li等也證明煙草向性運動相應(yīng)部位發(fā)生了生長素的不對稱分布。生長素還參與調(diào)節(jié)擬南芥根的重力性反應(yīng)，這些結(jié)果都正面支持了 Cholodny-Went假說的正確性。
[0005]近年來對于生長素介導(dǎo)植物根重力性生長的研究報道不斷涌現(xiàn)。根中生長素的極性分布依賴于AUXl蛋白，auxl突變體表現(xiàn)為根重力性完全喪失。PGP4也參與擬南芥根中生長素運輸，pgp4突變體根中生長素向基運輸速度明顯降低，根向重性反應(yīng)也隨之鈍化。最近root growth factors (RGFs)分泌妝家方矣成員和phosphatidylinositol monophosphate5-kinase 2 (PIP5K)分別被證明通過調(diào)控生長素輸出載體的胞內(nèi)循環(huán)來調(diào)節(jié)植物地上和地下多器官的重力性反應(yīng)。水稻LAZYl負(fù)向調(diào)控生長素極性運輸，相應(yīng)的水稻和擬南芥Iazyl突變體都表現(xiàn)為地上部重力性反應(yīng)減弱并伴隨分枝角度增大。最近研究者提出一個“tipping point”機制，證明在重力性彎曲生長過程中，一定傾斜角度可作為觸發(fā)點，引起生長素極性運輸流向發(fā)生反轉(zhuǎn)，充分證明了生長素極性運輸與重力性反應(yīng)的直接相關(guān)性。
[0006]生長素極性運輸參與的另外一個重要生物學(xué)過程是調(diào)控分生組織發(fā)育和花器官形態(tài)建成。以玉米為例，花器官包含雄穗，發(fā)育自頂端分生組織；雌穗，發(fā)育自雄穗數(shù)個節(jié)下的腋生分生組織。除著生位置不同外，雌雄穗表現(xiàn)出不完全相同的發(fā)育模式，其中雄穗發(fā)育包含四種類型的分生組織:特異的分枝分生原基(branch meristem, BM),小穗對分生原基(spikelet pair meristems, SPMs),小穗分生原基(spikelet meristems, SMs)和小花分生原基(floral meristems, FMs),然而雌穗發(fā)育僅包含SPMs, SMs和FMs。通過對一系列玉米雌雄穗生長素運輸相關(guān)基因的研究，發(fā)現(xiàn)特異的生長素濃度梯度對各級分生原基的生長分化都是必不可少的。玉米生長素輸出載體ZmPINla和ZmPINlb特異定位于頂端分生組織和腋生組織的表皮細(xì)胞層中，預(yù)示著生長素極性運輸在花器官起始發(fā)育中的重要作用。玉米Barren inflorescence2 (Bif2)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PINOID (PID)同源蛋白，通過調(diào)控PIN蛋白亞細(xì)胞極性定位控制生長素極性運輸，且此作用過程在玉米和擬南芥中是保守的。bif2突變則引起雌穗籽粒數(shù)減少且雄穗分枝數(shù)和小花數(shù)明顯減少。另外一個半顯性bifl突變體中，腋生分生組織的生長素運輸速率降低，造成與bif2相似的表型。basichelix - loop - helix (bHLH)轉(zhuǎn)錄因子Barren stalkl (Bal)參與了玉米腋生分生組織的起始過程，且bal突變體表現(xiàn)為雌穗、雄穗分枝、小花完全缺失。BAl特異表達于花器官分生組織的邊界處，并介導(dǎo)形成了局部的生長素濃度梯度，但BAl在生長素極性運輸調(diào)控途徑中的上下游位置尚存爭議。
[0007]除了生長素極性運輸，通過生長素的局部合成建立的生長素濃度梯度也在玉米花器官發(fā)育中起重要作用。玉米sparse inflorescencel (spil)編碼黃素單氧酶,其介導(dǎo)催化Trp依賴性生長素合成途徑中的限速步驟，與擬南芥YUCCA基因同源，參與腋生分生組織和側(cè)生器官的生長分化，最終完成花器官的形態(tài)建成。另一個生長素合成基因vanishingtassel2(vt2)同樣為花器官的腋生分生組織發(fā)育所必需。遺傳學(xué)分析表明生長素極性運輸與局部組織中的生物合成能協(xié)同作用于調(diào)控玉米花器官發(fā)育過程。
[0008]盡管大量研究已明確表明生長素在重力性反應(yīng)和花器官發(fā)育中的重要作用，但還沒有同時參與這兩個過程調(diào)控基因的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種植物倒伏和花器官發(fā)育調(diào)控蛋白ZmLAl及其編碼基因與應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明所述蛋白質(zhì)ZmLAl,來源于玉米(Zea mays L.),是如下a)或b)的蛋白質(zhì):
[0011]a)由序列表序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0012]b)將序列表序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物倒伏和/或花器官發(fā)育相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
[0013]序列表序列I所示的氨基酸序列由413個氨基酸殘基組成，其中，第70-90位氨基酸肽段為跨膜結(jié)構(gòu)域，第275-298位、第338-345位兩段肽段為羅賓遜(Robinson)核定位信號。
[0014]為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0015]表1標(biāo)簽的序列
[0016]

【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì): a)由序列表序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將序列表序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物倒伏和/或花器官發(fā)育相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因； 所述基因具體可為如下I)-4)基因中的任意一種: 1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒； 所述重組載體具體可為在pCAMBIA3301-UbiN的BamH I和Kpn I酶切位點之間插入權(quán)利要求2所述基因得到的重組載體。
4.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的基因在調(diào)控目的植物如下四種性狀中至少一種的應(yīng)用:生長素向基極性運輸效率、生長素側(cè)向運輸效率、莖桿抗倒伏能力和花器官發(fā)育； 所述花器官發(fā)育性狀包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝數(shù)、雌穗穗柄長度、雌穗花絲數(shù)目、雌穗鮮重、果穗長度和結(jié)實率中的至少一種。
5.一種獲得具有如下至少一種表型植物的方法，包括降低所述植物中權(quán)利要求1所述蛋白表達、和/或抑制權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)錄的步驟:生長素向基極性運輸效率提高，生長素側(cè)向運輸效率降低，莖桿抗倒伏能力降低，雌穗花期延遲、雄穗花期延遲、雄穗分枝數(shù)減少、雌穗穗柄長度降低、花絲鮮重降低、果穗長度降低、結(jié)實率降低。
6.一種獲得具有如下至少一種表型植物的方法，包括提高所述植物中權(quán)利要求1所述蛋白表達、和/或促進權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)錄的步驟:生長素向基極性運輸效率降低，生長素側(cè)向運輸效率提高，莖桿抗倒伏能力增強，莖桿受外力傾斜后恢復(fù)直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝數(shù)增加、雌穗穗柄長度增加、花絲鮮重增加、果穗長度增加、結(jié)實率提高。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2所述基因?qū)肽康闹参镏校玫脚c所述目的植物相比具有如下至少一種表型的轉(zhuǎn)基因植物: 生長素向基極性運輸效率降低，生長素側(cè)向運輸效率提高，莖桿抗倒伏能力增強，莖桿受外力傾斜后恢復(fù)直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝數(shù)增加、雌穗穗柄長度增加、花絲鮮重增加、果穗長度增加、結(jié)實率提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述導(dǎo)入是通過權(quán)利要求4所述重組載體實現(xiàn)的。
9.根據(jù)權(quán)利要求5—8中任一所述的方法或應(yīng)用，其特征在于:所述植物和所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體可為玉米。
10.如下A) — C)中任一種引物對或引物對組合物及其在玉米育種中的應(yīng)用:A)引物對M4和引物對M5；B)引物對M4；C)引物對M5；所述引物對M4由序列表序列4所示的單鏈DNA和序列表序列5所示的單鏈DNA組成；所述引物對M5由序列表序列6所 示的單鏈DNA和序列表序列7所示的單鏈DNA組成。
【文檔編號】C12N5/10GK104177481SQ201310189177
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月21日
【發(fā)明者】金危危, 董朝斌, 陳曉陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)