一種抗腫瘤制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗腫瘤制劑及其制備方法。所述抗腫瘤制劑為由分散有有效成分PD-1阻斷抗體和塞來昔布的海藻酸鹽水溶液形成的水凝膠形式的抗腫瘤制劑，所述抗腫瘤制劑為注射制劑。本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和延長的緩釋效果，同時(shí)還具有顯著提高的對腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的抑制作用、以及擴(kuò)大的抗瘤譜。
【專利說明】
一種抗腫瘤制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物制劑及其制備方法，尤其涉及一種抗腫瘤制劑及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是威脅人類健康和生命最大的敵人之一，世界衛(wèi)生組織報(bào)告表明，2012年全 球有1410萬人患癌，死亡人數(shù)達(dá)820萬，超過艾滋病、瘧疾和結(jié)核病死亡人數(shù)總和。我國新 增癌癥病例居世界第一位，癌癥也已成我國居民的第一死因，每年有207萬人因癌癥去世。 目前在臨床上，腫瘤的治療手段主要以手術(shù)切除、化療和放療為主。而治療惡性腫瘤時(shí)，手 術(shù)的方法幾乎不可能將擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞完全切除，從而造成腫瘤反復(fù)發(fā)作；化療和放療雖 然一定程度上可以輔助惡性腫瘤的治療，但強(qiáng)烈的毒副作用對機(jī)體造成額外的巨大傷害， 且治愈率很低。絕大部分化療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)都會對機(jī)體正常組織和器官造成 不可逆的損傷。因此，傳統(tǒng)的治療技術(shù)無法解決腫瘤尤其是惡性腫瘤對人類健康的重大威 脅。
[0003] 腫瘤的免疫治療技術(shù)，是基于腫瘤免疫基本原理而開發(fā)和發(fā)展出來的、以免疫學(xué) 手段達(dá)到對腫瘤細(xì)胞有效殺傷的一類腫瘤治療技術(shù)。免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷具有很強(qiáng) 的針對性和專一性，因此此類疾病的免疫學(xué)治療技術(shù)具有傳統(tǒng)治療技術(shù)無法比擬的天然的 高效性和靶向性。針對某一類型的腫瘤，成功的免疫學(xué)治療方案可以激活機(jī)體產(chǎn)生足夠的 腫瘤細(xì)胞特性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，可選擇性殺死所有腫瘤細(xì)胞，和腫瘤的其他的療法相 比，免疫治療是目前已知的惟一有望完全消滅腫瘤細(xì)胞的手段而對對機(jī)體正常細(xì)胞沒有不 良影響。近些年隨著腫瘤免疫逃逸相關(guān)研究逐漸深入，使用單克隆抗體阻斷共刺激分子通 路已作為一種新的腫瘤免疫治療手段逐漸被重視，也為腫瘤免疫治療翻開了新的篇章。首 個(gè)投入臨床應(yīng)用的針對負(fù)性共刺激信號通路阻斷的藥物是易普利姆瑪（ipilimumab)作為 B7/CTLA-4共刺激通路阻斷劑，ipilimumab被證實(shí)能有效提高晚期惡性黑素瘤患者的生存 率，并在2011年被FDA批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤，但易普利姆瑪能導(dǎo)致嚴(yán)重和致死 性自身免疫相關(guān)疾病。緊隨其后，程序性死亡分子-I (PD-i)通路阻斷劑抗ro-i和ro-Li 單克隆抗體也有了突破性的進(jìn)展，可以阻斷ro-1對τ細(xì)胞的抑制作用，從而激活腫瘤患者 體內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞殺瘤效應(yīng)，減少抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞效應(yīng)，以增強(qiáng)CTL殺傷癌細(xì)胞的功能 已成為近年免疫治療的熱點(diǎn)。多項(xiàng)荷瘤動物實(shí)驗(yàn)表明，阻斷ro-Li/ro-ι通路可以增強(qiáng)抗腫 瘤效應(yīng)、延長生存期、改善預(yù)后。目前，多種針對ro-Li/ro-i通路阻斷的單克隆抗體用于進(jìn) 展期惡性腫瘤的三期臨床試驗(yàn)都在進(jìn)行，ro-i抗體由于其廣譜抗癌作用，對腎癌、胃癌、乳 腺癌、膀胱癌、白血病、頭頸癌、腸癌和腦瘤等癌癥的臨床療效也正在二期或三期臨床試驗(yàn) 之中。然而由于體內(nèi)穩(wěn)定性差以及作用的多效性，要求連續(xù)灌輸或頻繁給藥才能獲得理想 的治療效果，動物實(shí)驗(yàn)中每次I 3D-I抗體的給藥量通常為250ug/只小鼠，并需要每隔兩天給 藥一次以維持藥效，如此高劑量致使全身治療時(shí)副作用較大，如引起免疫性小腸炎及嚴(yán)重 的自身免疫疾病等副作用，限制了其的應(yīng)用。
[0004] 因此，如何提供一種抗藥物制劑，利用ro-i抗體，但具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性，具有 提高的藥效發(fā)揮并且副作用小，成為有待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種抗腫瘤制劑，為由分散有有效成分ro-i阻斷抗體和塞來昔布的 海藻酸鹽水溶液形成的水凝膠形式的抗腫瘤制劑。該制劑具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性、顯著提 高的抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的作用、擴(kuò)大的抗瘤譜，以及降低的對機(jī)體的毒副作用。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤制劑的制備方法，通過將有效成分ro-i阻斷抗體及 塞來昔布分散在海藻酸鹽溶液中，并形成水凝膠形式的可注射的抗腫瘤制劑。對個(gè)體施用 該方法制成的抗腫瘤制劑，PD-I阻斷抗體及塞來昔布表現(xiàn)出良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和延長的緩 釋效果，更加利于所述有效成分藥效的發(fā)揮，以及降低其使用劑量。
[0007] 非留體類抗炎藥，例如塞來昔布等已被證明可通過抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn) 細(xì)胞凋亡，抑制治腫瘤新生血管形成從而預(yù)防腫瘤發(fā)生及發(fā)展，在預(yù)防腫瘤的發(fā)生、抑制腫 瘤的生長、轉(zhuǎn)移及在動物實(shí)驗(yàn)中取得了較好的肯定效果。但至今其臨床應(yīng)用仍然受限，主要 是由于許多問題尚待解決，如用藥時(shí)間較長，用藥劑量偏大，小鼠實(shí)驗(yàn)顯示通常需要每天口 飼25mg/kg體重的劑量的塞來昔布才能具有抗腫瘤效果，致使胃腸道及心血管方面的副作 用大，并且抗瘤譜較窄（主要用于結(jié)直腸癌的預(yù)防和早期治療）。目前還沒有報(bào)道顯示將非 甾體類抗炎藥，例如塞來昔布與ro-ι阻斷抗體聯(lián)合使用可以降低其用藥量，擴(kuò)大抗瘤譜， 以及降低機(jī)體毒副作用的報(bào)道。
[0008] 本發(fā)明提供的一種抗腫瘤制劑，為由分散有有效成分ro-i阻斷抗體和塞來昔布 的海藻酸鹽水溶液形成的水凝膠形式的抗腫瘤制劑，所述抗腫瘤制劑為注射制劑。
[0009] 在本發(fā)明的方案中，所述海藻酸鹽的分子量為75, 000 - 300, 000g。
[0010] 進(jìn)一步的，進(jìn)一步的，所述海藻酸鹽溶液混合物在交聯(lián)劑存在下發(fā)生交聯(lián)。所述交 聯(lián)劑為二價(jià)金屬陽離子。更進(jìn)一步的，所述二價(jià)金屬陽離子由二價(jià)金屬的硫酸鹽或鹽酸鹽 提供，所述二價(jià)金屬為f丐或鎂。更進(jìn)一步的，所述二價(jià)金屬陽離子由CaSO 4, MgCl2S CaCl 2提 供。
[0011] 更進(jìn)一步的，所述抗腫瘤制劑為用于黑素瘤、乳腺癌、腎癌、胃癌、膀胱癌、白血病、 頭頸癌、腸癌或腦瘤的抗腫瘤制劑。
[0012] 本發(fā)明提供的一種抗腫瘤制劑的制備方法，包括：
[0013] 將海藻酸鹽溶解在生理鹽水中制成海藻酸鹽溶液；
[0014] 在該海藻酸鹽溶液中添加有效成分ro-ι阻斷抗體和塞來昔布，并使之分散在所 述海藻酸鹽溶液中，得到海藻酸鹽溶液混合物；
[0015] 使所述海藻酸鹽溶液混合物發(fā)生交聯(lián)，形成水凝膠形式的抗腫瘤制劑，所述抗腫 瘤制劑為注射制劑。
[0016] 進(jìn)一步的，所述海藻酸鹽的分子量為75, 000 - 300, 000g。對于本申請方案中使用 的海藻酸鹽，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在上述分子量范圍內(nèi)根據(jù)需要進(jìn)行選擇。本領(lǐng)域技術(shù)人 員也可以直接使用商購的在上述分子量范圍的一種或多種海藻酸鹽。
[0017] 進(jìn)一步的，所述海藻酸鹽溶液混合物在交聯(lián)劑存在下發(fā)生交聯(lián)。所述交聯(lián)劑為二 價(jià)金屬陽離子。更進(jìn)一步的，所述二價(jià)金屬陽離子由二價(jià)金屬的硫酸鹽或鹽酸鹽提供，所述 二價(jià)金屬為f丐或鎂。更進(jìn)一步的，所述二價(jià)金屬陽離子由CaSO4, MgCl2S CaCl 2提供。
[0018] 更進(jìn)一步的，所述抗腫瘤制劑為用于黑素瘤、乳腺癌、腎癌、胃癌、膀胱癌、白血病、 頭頸癌、腸癌或腦瘤的抗腫瘤制劑。
[0019] 進(jìn)一步的，在本申請的方案中，由于塞來昔布為粉末狀不易溶于水，在將其分散在 海藻酸鹽溶液的過程中可采用超聲法進(jìn)行。
[0020] 更進(jìn)一步的，制備本發(fā)明的抗腫瘤制劑的過程應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。
[0021] 本發(fā)明提供的一種抗腫瘤制劑可以通過皮下注射進(jìn)行給藥，來抑制腫瘤發(fā)生或殺 傷腫瘤細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明的所述抗腫瘤制劑可以為單位制劑。所述單位制劑為滿足一次給藥所需有 效成分的制劑，如一單位（針）針劑等。患者一次施用所需的藥物的量可以方便地通過計(jì) 算患者的體重和該患者一次用藥所需單位體重劑量的乘積得到。例如，在制備藥物的過程 中，一般認(rèn)為成人體重為50_70kg，可以最初可以通過實(shí)驗(yàn)動物與人的單位體重劑量之間的 等效劑量換算關(guān)系來確定用藥量。例如，可以根據(jù)FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)提出的指導(dǎo)意 見，也可參考（黃繼漢等，"藥理試驗(yàn)中動物間和動物與人體間的等效劑量換算"，《中國臨床 藥理學(xué)與治療學(xué)》，2004S??；9(9) :1069-1072)來確定。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可以使用 按照人和小鼠的體表面積折算系數(shù)0. 0026來換算人和小鼠的劑量。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，對體重為25g的小鼠皮下注射0. 2ml的本發(fā)明抗腫 瘤制劑，其中I3D-I阻斷抗體的含量為lOOug，塞來昔布的含量625ug，即：4mg/kg小鼠體重 的Η)-1阻斷抗體，25mg/kg小鼠體重的塞來昔布，兩周施用一次即可維持藥效。
[0024] 制藥商可以根據(jù)上述換算方法得到滿足成年人一次給藥的單位制劑中的有效成 分含量，用以應(yīng)用于其制藥過程中。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，根據(jù)等效劑量換算關(guān)系以及 人的常規(guī)體重，并且綜合用藥安全、成本和藥效，優(yōu)選的，所述單位制劑中含有20-30mg的 ro-Ι阻斷抗體和130-200mg的塞來昔布。
[0025] 在本申請的抗腫瘤制劑的制備方法中，海藻酸鹽溶液的溶液濃度可以在10_40mg/ mL范圍，所述ro-1阻斷抗體可以500~1000 μ g/mL的量分散在上述海藻酸鹽溶液中，所述 塞來昔布可以3. 75~7. 5mg/mL的量分散在上述海藻酸鹽溶液中。
【申請人】可以根據(jù)所要制 備的抗腫瘤制劑的規(guī)格，例如單位制劑中需要含有的ro-i阻斷抗體和塞來昔布的量適當(dāng) 選擇海藻酸鹽溶液的溶液濃度，PD-I阻斷抗體、塞來昔布分散在海藻酸鹽中的量，這對本領(lǐng) 域技術(shù)人員來說是可以實(shí)現(xiàn)的。
[0026] 本發(fā)明提供的方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] ⑴采用本發(fā)明方法制成的抗腫瘤制劑，能使ro-i阻斷抗體及塞來昔布具有良好 的體內(nèi)穩(wěn)定性，具有延長的緩釋效果，從而能更有利于藥效的發(fā)揮，降低用藥劑量。
[0028] (2)
【申請人】研究發(fā)現(xiàn)，通過注射方式對個(gè)體施用本發(fā)明的抗腫瘤制劑，即同時(shí)將 ro-Ι阻斷抗體和塞來昔布包裹進(jìn)海藻酸鹽水凝膠提供給個(gè)體，相比于施用僅含ro-i阻斷 抗體的海藻酸鹽水凝膠和/或僅含塞來昔布的海藻酸鹽水凝膠，在增加荷瘤小鼠存活百分 比、促進(jìn)有活性的CD8T細(xì)胞的產(chǎn)生方面具有出乎意料的協(xié)同作用。
[0029] (3)本發(fā)明所提供的抗腫瘤制劑是通過增強(qiáng)機(jī)體針對腫瘤細(xì)胞的獲得性免疫反 應(yīng)，阻斷免疫抑制通路，激活效應(yīng)細(xì)胞特異性地殺死腫瘤細(xì)胞，對機(jī)體正常組織和細(xì)胞幾乎 沒有傷害，與手術(shù)、化療、放療對身體帶來的傷害相比，優(yōu)勢明顯。
[0030] (4)本發(fā)明方案使用的材料海藻酸鹽來源廣泛，可從海藻中可大量提取，使用顯著 降低的ro-ι阻斷抗體和塞來昔布的劑量即可獲得良好的抑制腫瘤效果，顯著降低了病人 的用藥成本。
[0031] (5)本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑既可以用于治療實(shí)體腫瘤，抑制腫瘤的生長；可以 用于治療發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)移的腫瘤；以及用于惡性腫瘤手術(shù)后放、化療的輔助治療；尤其適 合于無法進(jìn)行手術(shù)切除的腫瘤的治療，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0032] 圖1為本發(fā)明的抗腫瘤制劑的制備流程圖。
[0033] 圖2A顯示了各組小鼠血清中的塞來昔布濃度，圖2B顯示了各組小鼠腫瘤組織中 塞來昔布含量。圖2C顯示了各組小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（⑶8和IFN-γ雙陽性）和 調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（CD4和FoxP3雙陽性）的比值。圖2D顯示了各組小鼠的存活百分比。
[0034] 圖3A-圖3B顯示了腫瘤微環(huán)境中對能有效殺傷腫瘤細(xì)胞的CD8T細(xì)胞的檢測結(jié) 果。
[0035] 圖4A顯示了 C0X-2基因的相對信使RNA的表達(dá)水平。圖4B顯示了 IL-I β基因 的相對信使RNA的表達(dá)水平。圖4C顯示了 IL-6基因的相對信使RNA的表達(dá)水平。其中* 表示P值〈〇. 05, **表示ρ值〈0. 01。
[0036] 圖5Α顯示了第0,10, 13, 17, 20, 22天各組小鼠的腫瘤外觀的圖片。圖5Β顯示了 第0,10, 13, 17, 20, 22天各組小鼠的腫瘤尺寸變化。其中*表示ρ值〈0. 05。
[0037] 圖6Α顯示了各組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移瘤的圖片。圖6Β顯示了各組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移瘤 數(shù)量。其中$表示該組與a組對比；#表示該組與b組對比。*，$，#表示ρ值〈0. 05 ;$$， ##表示ρ值〈0.01。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 實(shí)施例1.制備本發(fā)明的抗腫瘤制劑。
[0039] 可以按照如圖1所示的流程制備本發(fā)明的抗腫瘤制劑。
[0040] 步驟（1)，用生理鹽水分別配制10_40mg/mL的高分子量（SLG100，Mw = 200, 000 -300, 000g/mol)和低分子量（SLG20，Mw = 75, 000 - 220, 000g/mol，F(xiàn)MC Biopolymer 公司，美 國費(fèi)城）的海藻酸鹽溶液，磁力攪拌器4°C攪拌過夜，用孔徑為0. 22微米的濾器過濾除菌。 取高、低分子量的海藻酸鹽溶液按1 :3的比例混合并充分混勻；
[0041 ] 步驟（2) -a，按每毫升的海藻酸鹽溶液稱取3. 75~7. 5mg塞來昔布粉末（LC實(shí)驗(yàn) 室，LC Laboratories,美國馬薩諸塞州），混合；
[0042] 步驟（2)-b，采用探頭式超聲儀（QS0NICA公司，美國）以60W功率超聲60秒，使塞 來昔布粉末均勻分散于海藻酸鹽溶液中，獲得混合體系；
[0043] 步驟（3)，按每毫升海藻酸鹽溶液量取500~1000 μ g ro-Ι阻斷抗體（BioXCell 公司，美國）加入步驟（2)-b所得混合體系中，震蕩器振蕩充分混勻；
[0044] 步驟⑷_a，稱取硫酸鈣固體粉末（CaSO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），按質(zhì)量 體積比為0. 21g/ml與純凈水混合，高壓滅菌，得到硫酸鈣懸濁液（使用時(shí)若發(fā)生聚集，產(chǎn)生 粗大顆粒，可用超聲儀超聲，使其形成均一的懸濁液）；
[0045] 步驟⑷_b，用帶螺口的注射器吸取步驟（3)所得的混合物；
[0046] 步驟（4) -c，另一帶螺口的注射器中加入CaSO4懸濁液，按每mL海藻酸鹽鹽溶液加 入40 μ L的0&304懸濁液；
[0047] 步驟（5)，通過接頭和螺口使兩注射器完成緊密連接，盡量排除多余的空氣；
[0048] 步驟（6)，迅速互推注射器20次；
[0049] 步驟（7)，靜置1分鐘，水凝膠形式的本發(fā)明的抗腫瘤制劑即制作完成。旋開裝有 水凝膠的注射器，接上注射針頭，即可進(jìn)行注射?；蛘呖梢詫⒅瞥傻目鼓[瘤制劑在4°C保存。
[0050] 實(shí)施例2 :本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑的在體內(nèi)的緩釋效果和藥效延長效果
[0051] 1.按照實(shí)施例1相同方法制備出所述抗腫瘤制劑，使得每毫升所述抗腫瘤制劑中 含有ro-Ι阻斷抗體500ug，塞來昔布3125ug。
[0052] C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，每只體重約25克左右。 B16-F10黑素瘤細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。
[0053] 2.構(gòu)建小鼠 B16黑素瘤模型。
[0054] B16-F10黑素瘤細(xì)胞是公認(rèn)的具有最強(qiáng)侵襲能力的腫瘤細(xì)胞，每只C57BL/6小鼠 皮下注射2. 5 X IO4個(gè)B16-F10黑素瘤細(xì)胞后，1周后可產(chǎn)生成形的原位黑色素瘤，之后迅速 生長并導(dǎo)致小鼠死亡。C57BL/6小鼠黑素瘤模型是評估藥物抗腫瘤效果廣泛采用的成熟的 動物模型。發(fā)明人將從ATCC(美國模式培養(yǎng)物保藏所）購買到的B16-F10黑素瘤細(xì)胞，皮 下注射6-8周齡體重約25克的C57BL/6雄性小鼠（購自北京華阜康生物科技股份有限公 司），約7-10天后在注射細(xì)胞的部位可見黑色素瘤成形。
[0055] 3.本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑在體內(nèi)的緩釋效果和藥效延長效果實(shí)驗(yàn)。
[0056] 3. 1在C57BL/6小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞一周后，設(shè)置以下3組小鼠：
[0059] 除口飼塞來昔布組是在給藥后24小時(shí)取小鼠血清和腫瘤組織，其他兩組小鼠分 別在給藥后第1天，第3天，第7天和第14天取小鼠血清和腫瘤組織，然用液相色譜-質(zhì)譜 聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS)檢測小鼠血清和腫瘤組織的勻漿液中的塞來昔布的濃度，每組每個(gè)時(shí) 間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量為3只。
[0060] 圖2A顯示了各組小鼠血清中的塞來昔布濃度。圖2B顯示了各組小鼠腫瘤組織中 塞來昔布含量?？梢钥闯?，注射本發(fā)明的抗腫瘤制劑的實(shí)驗(yàn)組小鼠的塞來昔布血清濃度水 平至少在一周內(nèi)顯著高于對照組；腫瘤組織中的塞來昔布含量至少在兩周內(nèi)顯著高于對照 組。
[0061] 3. 2在C57BL/6小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞一周后，設(shè)置以下4組小鼠：
[0063] 在如上表處理各組小鼠后，分別在處理后第1天，第3天，第7天和第14天對各組 小鼠進(jìn)行腹股溝淋巴結(jié)取樣，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CD8和IFN-γ 雙陽性）和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（CD4和FoxP3雙陽性）的數(shù)量并計(jì)算比值，每組每個(gè)時(shí)間 點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量為3只。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL)的激活和調(diào)節(jié)性T細(xì) 胞（Treg)的抑制的動態(tài)變化，來反映 Η)-1阻斷抗體的緩釋效果。
[0064] 圖2C顯示了各組小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CD8和IFN- γ雙陽性）和調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞（⑶4和FoxP3雙陽性）的比值。結(jié)果顯示，注射本發(fā)明的抗腫瘤制劑組的實(shí)驗(yàn) 組至少在兩周內(nèi)，藥效延長效果顯著性地高于各對照組。
[0065] 通過本實(shí)施例數(shù)據(jù)說明本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑，在降低了用藥劑量的基礎(chǔ)上， 仍然維持了長時(shí)間的有效藥物濃度和效果。
[0066] 3. 3在C57BL/6小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞一周后，設(shè)置以下4組小鼠：
[0067]
[0068] 圖2D顯示了各組小鼠的存活百分比。表明施用本發(fā)明抗腫瘤制劑組（通過將ro-1 抗體以及塞來昔布同時(shí)包裹進(jìn)海藻酸鹽水凝膠形成），獲得了比分步施用包裹進(jìn)海藻酸鹽 水凝膠的有效成分組（即施用僅含ro-ι抗體的海藻酸鹽水凝膠，以及同時(shí)施用僅含塞來昔 布的海藻酸鹽水凝膠），獲得了顯著提高的小鼠存活百分比。這說明本發(fā)明的抗腫瘤制劑， 并非簡單的組合使用塞來昔布、ro-ι抗體以及海藻酸鹽水凝膠三種成分，塞來昔布和ro-1 抗體必須同時(shí)包埋進(jìn)海藻酸鹽水凝膠中（即本發(fā)明抗腫瘤制劑），才能產(chǎn)生優(yōu)越的抗腫瘤 效果。
[0069] 實(shí)施例3本發(fā)明的抗腫瘤制劑能促進(jìn)有活性的CD8T細(xì)胞的產(chǎn)生
[0070] 1.按照實(shí)施例1相同方法制備出所述抗腫瘤制劑，使得每毫升所述抗腫瘤制劑中 含有ro-Ι阻斷抗體500ug，塞來昔布3125ug。
[0071] 2.構(gòu)建與實(shí)施例2相同的小鼠黑素瘤模型。
[0072] 在C57BL/6小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞一周后，設(shè)置以下4組小鼠：
[0073]
[0074] 在如上表處理各組小鼠后，分別在一周后檢測用流式細(xì)胞術(shù)術(shù)檢測腫瘤微環(huán)境中 有活性的⑶8細(xì)胞百分比。
[0075] 圖3A和圖3B顯示了腫瘤微環(huán)境中對能有效殺傷腫瘤細(xì)胞的CD8T細(xì)胞的檢測結(jié) 果。表明施用本發(fā)明的抗腫瘤制劑組（通過將ro-i抗體以及塞來昔布同時(shí)包裹進(jìn)海藻酸 鹽水凝膠形成）才能極大的促進(jìn)有活性的CD8T細(xì)胞的產(chǎn)生。這說明本發(fā)明的抗腫瘤制劑 在治療腫瘤時(shí)，不僅作為藥物緩釋載體，而且其在體內(nèi)占據(jù)的體積和空間是促進(jìn)抗腫瘤免 疫細(xì)胞產(chǎn)生的場所。塞來昔布和ro-ι抗體兩種成分同時(shí)存在于該"場所"中，它們激活免 疫細(xì)胞的協(xié)同作用才能產(chǎn)生。
[0076] 實(shí)施例4本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑具有降低的機(jī)體毒副作用。
[0077] 1.按照實(shí)施例1相同方法制備出所述抗腫瘤制劑，使得每毫升所述抗腫瘤制劑中 含有ro-Ι阻斷抗體500ug，塞來昔布3125ug。
[0078] 2.構(gòu)建與實(shí)施例2相同的小鼠黑素瘤模型。
[0079] 3.檢測本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑對機(jī)體的毒副作用。
[0080] 在C57BL/6小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞一周后，設(shè)置以下各組小鼠：
[0081]
[0083] 在如上表處理各組小鼠后，繼續(xù)培養(yǎng)小鼠一周，處死小鼠，剝?nèi)∑は履[瘤，按照RNA 提取試劑說明提取總RNA，熒光定量PCR分析C0X-2、IL-Ιβ和IL-6四個(gè)基因的相對信使 RNA的表達(dá)水平。結(jié)果如圖4A-圖4C所示，圖4A為C0X-2基因的相對信使RNA的表達(dá)水 平。圖4B為IL-I β基因的相對信使RNA的表達(dá)水平。圖4C為IL-6基因的相對信使RNA 的表達(dá)水平?？梢钥闯觯⑸浔景l(fā)明的抗腫瘤制劑組的實(shí)驗(yàn)組，相比于注射ro-i抗體的海 藻酸鹽水凝膠組，具有顯著降低的炎癥因子的表達(dá)。表明本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑具有顯 著降低的對機(jī)體的毒副作用。
[0084] 實(shí)施例5 :本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑用于抑制B16黑素瘤腫瘤生長
[0085] 1.按照實(shí)施例1相同方法制備出所述抗腫瘤制劑，使得每毫升所述抗腫瘤制劑中 含有I 3D-I阻斷抗體500ug，塞來昔布3125ug。
[0086] 2.構(gòu)建與實(shí)施例2相同的小鼠黑素瘤模型。
[0087] 3.本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑用于抗B16黑素瘤腫瘤生長效果。
[0088] 在C57BL/6小鼠接種黑色素瘤細(xì)胞一周后，設(shè)置以下各組小鼠：
[0091] 分別在在如上表處理各組小鼠后的第0,10, 13, 17, 20, 22天，用游標(biāo)卡尺測量黑 色素瘤的長徑（長）和短徑（寬），對腫瘤外觀進(jìn)行拍照。
[0092] 圖5A顯示了第0,10, 13, 17, 20, 22天各組小鼠的腫瘤外觀的圖片。圖5B顯示了 第0,10, 13, 17, 20, 22天各組小鼠的腫瘤的尺寸變化。
[0093] 由圖5A-圖5B可以看出，與對照組相比，皮下注射本發(fā)明抗腫瘤制劑的實(shí)驗(yàn)組能 很好的抑制惡性黑素瘤原位瘤的生長。本發(fā)明抗腫瘤制劑的抗腫瘤效果優(yōu)于海藻酸鹽水凝 膠單獨(dú)包埋塞來昔布或ro-i阻斷抗體的療效，也優(yōu)于生理鹽水混合塞來昔布和ro-i阻斷 抗體組，即說明本發(fā)明抗腫瘤制劑中的所有組分對于獲得本申請的抗腫瘤效果是必須的， 并且獲得了單獨(dú)施用ro-i阻斷抗體、塞來昔布所實(shí)現(xiàn)不了的效果。
[0094] 實(shí)施例6 :本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑用于控制4T1惡性乳腺癌的轉(zhuǎn)移
[0095] 1.按照實(shí)施例1相同方法制備出所述抗腫瘤制劑，使得每毫升所述抗腫瘤制劑中 含有ro-i阻斷抗體500ug，塞來昔布3125ug。
[0096] Balb/c小鼠購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，每只體重約25克左右。小鼠乳腺癌 細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。
[0097] 2.構(gòu)建4T1惡性乳腺癌轉(zhuǎn)移模型。
[0098] 4T1乳腺癌轉(zhuǎn)移模型是最常用的用于研究惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀０l(fā)明人將體 外培養(yǎng)的4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞（購自美國模式培養(yǎng)物保藏所）注射進(jìn)6-8周齡雌性體重為 25克左右的Balb/c小鼠右側(cè)第二個(gè)乳腺部位，每只小鼠注射的細(xì)胞量為IX IO6個(gè)。一周 后可見被注射的乳腺部位產(chǎn)生了明顯的乳腺腫瘤，4-5周后解剖可觀察到明顯的肺部轉(zhuǎn)移 瘤。通過觀察小鼠肺部被癌細(xì)胞侵襲后的外觀，和統(tǒng)計(jì)肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量，可以對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn) 移情況進(jìn)行定性和定量分析。
[0099] 3.本發(fā)明提供的抗腫瘤制劑抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果。
[0100] 在以上Balb/c小鼠接種4T1乳腺癌細(xì)胞一周后，設(shè)置以下各組小鼠：
[0102] 分別在在如上表處理各組小鼠后的25天后（接種癌細(xì)胞后的第32天），頸椎脫臼 處死各組小鼠，取小鼠全肺，統(tǒng)計(jì)肺表面轉(zhuǎn)移腫瘤灶的數(shù)目，從肺組織中手術(shù)剝離轉(zhuǎn)移瘤， 同時(shí)對小鼠全肺和剝離的轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行拍照。
[0103] 圖6A顯示了各組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移瘤的圖片。圖6B顯示了各組小鼠的肺部轉(zhuǎn)移瘤 數(shù)量。
[0104] 由圖6A-圖6B可以看出，注射本發(fā)明抗腫瘤制劑組與對照組相比，表現(xiàn)了極好的 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果，肺部轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量被抑制了 70%。與注射本發(fā)明制劑組相比，缺少任 何一種成分的對照組，轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量都顯著性地大大增加，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的效果遠(yuǎn)不如本 發(fā)明，說明本發(fā)明抗腫瘤制劑中的所有組分對于獲得本申請希望的抗腫瘤效果是必須的。
[0105] 實(shí)施例7本發(fā)明的抗腫瘤制劑對黑素瘤、乳腺癌外的其它腫瘤類型同樣有效
[0106] 1、實(shí)驗(yàn)材料和試劑
[0107] 不同荷瘤小鼠包括：腎癌小鼠、胃癌細(xì)小鼠、膀胱癌小鼠、白血病小鼠、頭頸癌小 鼠、腸癌小鼠、腦瘤小鼠，分別購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重約25克左右。
[0108] 2、實(shí)驗(yàn)步驟
[0109] 2. 1.按照實(shí)施例1相同方法制備出所述抗腫瘤制劑，使得每毫升所述抗腫瘤制劑 中含有I3D-I阻斷抗體500ug，塞來昔布3125ug。
[0110] 構(gòu)建荷瘤小鼠：本實(shí)施例中的構(gòu)建荷瘤小鼠模型的方法為本領(lǐng)域常規(guī)方法，這些 荷瘤小鼠模型是評估藥物抗腫瘤效果廣泛采用的成熟的動物模型。
[0111] 2.2.按以下方式針對各種荷瘤小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

[0114] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，施用本發(fā)明抗腫瘤制劑的腎癌小鼠、胃癌細(xì)小鼠、膀胱癌小鼠、白 血病小鼠、頭頸癌小鼠、腸癌小鼠、腦瘤小鼠，相比于各對照組小鼠，表現(xiàn)了極好的抑制腫瘤 生長的效果，以及降低的毒副作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗腫瘤制劑，其特征在于，為由分散有有效成分ro-i阻斷抗體和塞來昔布的海 藻酸鹽水溶液形成的水凝膠形式的抗腫瘤制劑，所述抗腫瘤制劑為注射制劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤制劑，其特征在于，所述抗腫瘤制劑還包括用于使所 述海藻酸鹽水溶液發(fā)生交聯(lián)的交聯(lián)劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗腫瘤制劑，其特征在于，所述海藻酸鹽的分子量為 75, 000 - 300, OOOg，所述交聯(lián)劑為二價(jià)金屬陽離子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤制劑，其特征在于，所述抗腫瘤制劑為單位制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗腫瘤制劑，其特征在于，所述單位制劑含有治療有效量為 20-30mg的ro-Ι阻斷抗體和130-200mg的塞來昔布。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的抗腫瘤制劑，其特征在于，所述抗腫瘤制劑為用于 黑素瘤、乳腺癌、腎癌、胃癌、膀胱癌、白血病、頭頸癌、腸癌或腦瘤的抗腫瘤制劑。7. -種抗腫瘤制劑的制備方法，其特征在于，包括： 將海藻酸鹽溶解在生理鹽水中制成海藻酸鹽溶液； 在該海藻酸鹽溶液中添加有效成分ro-i阻斷抗體及塞來昔布，并使之分散在所述海 藻酸鹽溶液中，得到海藻酸鹽溶液混合物； 使所述海藻酸鹽溶液混合物發(fā)生交聯(lián)，形成水凝膠形式的抗腫瘤制劑，所述抗腫瘤制 劑為注射制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述海藻酸鹽溶液混合物在交聯(lián)劑存在 下發(fā)生交聯(lián)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述海藻酸鹽的分子量為75, 000 -300, 000g，所述交聯(lián)劑為二價(jià)金屬陽離子。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗腫瘤制劑為用于黑素 瘤、乳腺癌、腎癌、胃癌、膀胱癌、白血病、頭頸癌、腸癌或腦瘤的抗腫瘤制劑。
【文檔編號】A61P35/00GK105983097SQ201510043930
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月28日
【發(fā)明人】王琳, 李永奎, 方敏, 王征, 張劍, 宋煜, 石潔, 徐妞妞, 王健
【申請人】華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院