本發(fā)明涉及免疫學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種胰高血糖素多克隆抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
：胰高血糖素(升糖素)是一種由胰臟胰島α-細(xì)胞分泌的激素，是由29個(gè)氨基酸組成直鏈多肽，分子量為3485道爾頓。胰高血糖素是一種促進(jìn)分解代謝的激素，它具有很強(qiáng)的促進(jìn)糖原分解和糖異生作用，使血糖明顯升高，1mol/l的激素可使3×106mol/l的葡萄糖迅速?gòu)奶窃纸獬鰜?lái)。胰高血糖素還可激活脂肪酶，促進(jìn)脂肪分解，同時(shí)又能加強(qiáng)脂肪酸氧化，使酮體生成增多。胰高血糖素分泌過多會(huì)使血糖濃度增大，所以2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中不僅是胰島素功能和分泌異常所致，胰高血糖素也在發(fā)揮重要作用，而且也可能是糖尿病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立因素。胰高血糖素異常升高是導(dǎo)致2型糖尿病患者血糖偏高的重要因素，檢測(cè)胰高血糖素水平有助于臨床準(zhǔn)確判斷糖尿病患者病情。目前已知檢測(cè)胰高血糖素的方法主要是放射性免疫法(ria)，也有報(bào)道采用胰高血糖素單抗依據(jù)免疫學(xué)原理進(jìn)行檢測(cè)的方法，如專利cn105116140a。單克隆抗體雖然在特異性上要好于多克隆抗體，但是如果所識(shí)別的抗原表位被破壞，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將會(huì)受到很大的影響，這是單抗的缺點(diǎn)之一；而多抗可以識(shí)別多個(gè)抗原表位，即使是有少數(shù)幾個(gè)抗原表位被破壞或者抗原構(gòu)象改變，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也不會(huì)受到影響。在相同條件下，使用多抗可以提高檢測(cè)的靈敏度，對(duì)于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。一般的多抗的制備方法是將抗原注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，一系列抗體生成細(xì)胞會(huì)不同程度的與抗原結(jié)合，受抗原刺激后在血液中產(chǎn)生不同類型的抗體，這種由一種抗原刺激產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體，一般有兔多抗，鼠多抗等。然而這種一般的制備方法用來(lái)制備胰高血糖素多抗，其抗體量較少。目前，尚沒有關(guān)于制備胰高血糖素多抗的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種胰高血糖素多克隆抗體的制備方法，使得所述制備方法能夠提高多克隆抗體的抗體量，并且具備較高的效價(jià)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種胰高血糖素多克隆抗體的制備方法，包括：步驟1、利用碳二亞胺法將胰高血糖素與牛血清蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫抗原；步驟2、將免疫抗原免疫兔子，取血離心，所得抗血清為胰高血糖素多克隆抗體。針對(duì)現(xiàn)有工藝中缺少胰高血糖素多克隆抗體的制備方法的問題，本發(fā)明通過胰高血糖素與牛血清蛋白偶聯(lián)形成免疫抗原，同時(shí)優(yōu)化免疫抗原免疫、提取抗體等工藝步驟，獲得效價(jià)較高、抗體量較多的胰高血糖素多克隆抗體。作為優(yōu)選，步驟1為：稱取胰高血糖素和n-羥基琥珀酰亞胺完全溶于dmf中，再加入dcc反應(yīng)，反應(yīng)液離心后收取上清液，將上清液滴加到溶有bsa的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，然后將所得反應(yīng)液透析，得到免疫抗原。在本發(fā)明具體實(shí)施過程中，步驟1為：取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺完全溶于1ml的dmf中，再加入0.12mmol的dcc，置于4℃下反應(yīng)攪拌12小時(shí)或攪拌過夜；反應(yīng)后將反應(yīng)液10000r/min離心10min，離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有2mmolbsa的pbs(0.01mol/l、ph7.4)中，4℃下反應(yīng)攪拌12小時(shí)或攪拌過夜；反應(yīng)后將反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用pbs(0.01mol/l、ph7.4)透析三天，每天換三次透析液，得到免疫抗原。作為優(yōu)選，步驟2為：用磷酸緩沖鹽溶液將步驟(1)所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液免疫兔子，第一次免疫時(shí)取1ml的免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進(jìn)行乳化，使其完全混為一相，采用皮下多點(diǎn)注射的方式對(duì)每只兔子免疫注射2ml；首次免疫兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)用等體積的弗氏不完全佐劑與1ml免疫抗原溶液混合用乳化器進(jìn)行乳化使其完全混為一相，采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)每只兔子注射2ml，之后每隔兩周進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次；對(duì)兔子進(jìn)行加強(qiáng)免疫4次后，于最后一次免疫一周后對(duì)兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置于4℃冰箱過夜，第二天離心分離取上清液，得到胰高血糖素多克隆抗體。采用常規(guī)的多克隆抗體制備方法與本發(fā)明所述方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述制備方法能夠獲得較多的胰高血糖素多克隆抗體，并具備較高的效價(jià)。同時(shí)，和其他蛋白偶聯(lián)形成的免疫抗原相比，本發(fā)明胰高血糖素和牛血清蛋白偶聯(lián)形成免疫抗原更適合制備高效價(jià)、高抗體量的多克隆抗體。由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過胰高血糖素與牛血清蛋白偶聯(lián)形成免疫抗原，同時(shí)優(yōu)化免疫抗原免疫、提取抗體等工藝步驟，獲得效價(jià)較高、抗體量較多的胰高血糖素多克隆抗體。附圖說明圖1所示為本發(fā)明所述的免疫抗原與bsa電泳檢測(cè)圖；其中，1為免疫抗原，2為bsa；圖2所示為本發(fā)明制備的胰高血糖素多克隆抗體效價(jià)圖；其中，縱坐標(biāo)abs表示吸光度，橫坐標(biāo)thedulitionofantibody表示稀釋比例；圖3所示為本發(fā)明制備的胰高血糖素多克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線圖；其中，縱坐標(biāo)mp/mp表示抑制率，橫坐標(biāo)concentration表示抗體濃度。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種胰高血糖素多克隆抗體的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述制備方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。以下就本發(fā)明所提供的一種胰高血糖素多克隆抗體的制備方法做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1：本發(fā)明制備胰高血糖素多克隆抗體的方法1、免疫抗原合成稱取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺(nhs)完全溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(dcc),置于4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。第二天把反應(yīng)液10000r/min,10min離心,離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有bsa(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。將所得反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用pbs透析(0.01mol/lph7.4)三天，每天換三次透析液，得到免疫抗原。免疫抗原電泳檢測(cè)(圖1)，結(jié)果顯示，免疫抗原的電泳圖與bsa相比發(fā)生了明顯變化，說明半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、多克隆抗體的提取選取兩只3個(gè)月左右的雌性新西蘭大白兔，體重約1.5公斤左右；用新配制的磷酸緩沖鹽溶液(pbs,0.01mol/l,ph7.4)將步驟(1)所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，第一次免疫時(shí)取1ml的免疫抗原溶液與等體積的弗氏完全佐劑，用乳化器進(jìn)行乳化，使其完全混為一相，采用皮下多點(diǎn)注射的方式對(duì)每只兔子免疫注射2ml；首次免疫兩周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)用等體積的弗氏不完全佐劑與1ml免疫抗原溶液混合用乳化器進(jìn)行乳化使其完全混為一相，采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)每只兔子注射2ml，之后每隔兩周進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次；對(duì)兔子進(jìn)行加強(qiáng)免疫4次后，于最后一次免疫一周后對(duì)兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置于4℃冰箱過夜，第二天以10000r/min，10min離心分離取上清液，得到胰高血糖素多克隆抗體，20ml/只兔子，于-20℃保存?zhèn)溆?。?shí)施例2：本發(fā)明胰高血糖素多克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)采用間接elisa法檢測(cè)兔血清中抗體的效價(jià)1、包被抗原的制備稱取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺(nhs)完全溶于1ml的nn-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(dcc),置于4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。第二天把反應(yīng)液10000r/min,10min離心,離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有ova(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。將所得反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用磷酸緩沖鹽溶液透析(pbs，0.01mol/lph7.4)三天，每天換三次透析液，得到包被抗原；2、包被：將包被抗原用碳酸鹽緩沖液(cbs)稀釋至最佳包被濃度4ug/ml并充分混勻，使用移液槍以100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴鍋溫浴1小時(shí)后，再放置于4℃冰箱中包被過夜；3、清洗：將孔中的液體甩干，用pbst洗滌液清洗3次，再將孔中剩余的液體在吸水紙上拍干；5、封閉：用含濃度為30mg/ml的脫脂奶粉磷酸緩沖鹽溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；6、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：將實(shí)施例1最后所得的胰高血糖素卵黃抗體用磷酸緩沖鹽溶液，按體積倍比稀釋成1：1000、1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000的溶液，以100μl/孔加入到微孔板中，同時(shí)增加空白對(duì)照，37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；7、加酶標(biāo)二抗：加入用磷酸緩沖鹽溶液稀釋5000倍數(shù)的酶標(biāo)二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；8、顯色：在已配制的10ml底物緩沖液中，加入10μl30％過氧化氫并充分混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光溫育15分鐘。9、終止和讀數(shù)：向酶標(biāo)版的微孔中加入50μl/孔的2m硫酸終止反應(yīng)。設(shè)定酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)參數(shù)為450nm，并測(cè)定其光密度(od)值。陽(yáng)性的判定原則：樣品孔o(hù)d值大于空白處讀數(shù)的2.1倍即可判定為陽(yáng)性。10、結(jié)果見圖2，圖2表示隨著抗體稀釋濃度的變化抗體的吸光度值，由圖可知抗體效價(jià)可達(dá)1:32000。實(shí)施例3：本發(fā)明胰高血糖素多克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)采用間接elisa法檢測(cè)兔血清中抗體的效價(jià)1、包被抗原的制備稱取0.1mmol胰高血糖素，0.15mmoln-羥基琥珀酰亞胺(nhs)完全溶于1ml的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，再加入0.12mmol的二環(huán)己基碳二亞胺(dcc),置于4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。第二天把反應(yīng)液10000r/min,10min離心,離心后收取上清液，將上清液緩慢滴加到溶有ova(2mmol)的pbs(8ml,10mmol,ph7.4)中，4℃下反應(yīng)攪拌過夜(或12小時(shí))。將所得反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃條件下用磷酸緩沖鹽溶液透析(pbs，0.01mol/lph7.4)三天，每天換三次透析液，得到包被抗原；2、包被：將包被抗原用碳酸鹽緩沖液(cbs)稀釋至最佳包被濃度4ug/ml并充分混勻，使用移液槍以100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴鍋溫浴1小時(shí)后，再放置于4℃冰箱中包被過夜；3、清洗：將孔中的液體甩干，用pbst洗滌液清洗3次，再將孔中剩余的液體在吸水紙上拍干；5、封閉：用含濃度為30mg/ml的脫脂奶粉磷酸緩沖鹽溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；6、將胰高血糖素標(biāo)準(zhǔn)品用磷酸緩沖液稀釋成1ng/ml、10ng/ml100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml、100000ng/ml、1000000ng/ml的溶液，將實(shí)施例1最后所得的抗血清(即胰高血糖素多克隆抗體)用磷酸緩沖鹽溶液，按體積倍比稀釋成1：1000，將標(biāo)準(zhǔn)品的每個(gè)濃度各取50ul，再分別加入50ul1：1000的抗血清，混勻，37度溫育30min，分別以100μl/孔加入到微孔板中，同時(shí)增加空白對(duì)照，37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；7、加酶標(biāo)二抗：加入用磷酸緩沖鹽溶液稀釋5000倍數(shù)的酶標(biāo)二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃溫浴1小時(shí)，重復(fù)步驟3；8、顯色：在已配制的10ml底物緩沖液中，加入10μl30％過氧化氫并充分混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用)，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光溫育15分鐘。9、終止和讀數(shù)：向酶標(biāo)版的微孔中加入50μl/孔的2m硫酸終止反應(yīng)。設(shè)定酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)參數(shù)為450nm，并測(cè)定其光密度值。做出競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。10、結(jié)果見圖3，橫坐標(biāo)表示胰高血糖素濃度，縱坐標(biāo)表示抑制率，由圖3可知，抗體抑制濃度可達(dá)100ng/ml。實(shí)施例4：不同抗體制備方法的對(duì)比方法1：實(shí)施例1方法制備的多抗；方法2：以klh偶聯(lián)胰高血糖素作為免疫抗原按照實(shí)施例1方法制備；方法3：按照實(shí)施例1方法制備鼠多抗；表1抗體量效價(jià)方法125mg/只兔1:32000方法221mg/只兔1:30000方法30.5mg/只鼠1:32000依據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)的報(bào)道，在制備多抗時(shí)klh作為載體蛋白偶聯(lián)半抗原的免疫原性要好于bsa偶聯(lián)半抗原，但是從上表可以看出，在制備胰高血糖素多抗時(shí)，與現(xiàn)有的常識(shí)并不一致，本發(fā)明方法所產(chǎn)生的抗體量是多于方法2，效價(jià)也略高。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12