專利名稱：：菌核凈的多克隆抗體及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種菌核凈的多克隆抗體及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：菌核凈(Dimethachlon)是一種二甲酰亞胺類殺菌劑，又名紋枯利，商品名為奧力(Ohric)，它的有效成分是(N-3，5-二氯苯基)丁二酰亞胺(NDPS)。具有直接殺菌、內(nèi)滲治療、抗雄激素作用，殘效期長(zhǎng)，對(duì)于油菜菌核病、煙葉赤腥病、水稻紋枯病、麥類赤霉病、白粉病以及工業(yè)防腐具有良好的防效作用。但是，到了80年代初，人們開始逐漸認(rèn)識(shí)到NDPS對(duì)人體健康可能具有潛在的危害(主要是腎臟毒性)，這樣致使菌核凈在農(nóng)業(yè)上的廣泛使用受到限制。目前對(duì)菌核凈殘留檢測(cè)的研究只有氣相色譜法(參見LiyHC，LiQW，TangLB.Capillarygaschromatographicdeterminationofdimethachlonresidyesinfreshtobaccoleavesandcyt-tobacco[J].JZhejiangMnivSciB.2007Apr;8(4):272-6;施介華.氣相色譜法測(cè)定菌核凈原粉[J].農(nóng)藥，1996，35(6):23-24)，劉蓉蓉等在2007年報(bào)道了菌核凈半抗原設(shè)計(jì)、合成與鑒定(參見劉蓉蓉，劉賢進(jìn)，劉媛，方敦煌，胡秋輝.菌核凈殘留免疫分析半抗原的制備和鑒定[J].食品科學(xué)，2007，28(2):223-226)，但是菌核凈的抗體制備以及免疫分析法和及其在煙葉中殘留的檢測(cè)中的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外均沒有文獻(xiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前菌核凈農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法單一的問題，檢測(cè)效率低的實(shí)際問題，提供一種菌核凈的多克隆抗體及其制備方法，并通過該多克隆抗體快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種菌核凈的多克隆抗體，由半抗原與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得，其特征在于半抗原為菌核凈-2-戊二酸半酯。上述菌核凈的多克隆抗體的制備，其特征在于將菌核凈-2-戊二酸半酯用活性酯法與牛血清白蛋白偶聯(lián)，合成免疫抗原，再將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得菌核凈的多克隆抗體。在菌核凈的多克隆抗體的制備中活性酯法合成免疫抗原的步驟是稱取21mg菌核凈-2-戊二酸半酯溶于0.4mL二甲基甲酰胺中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺7.17mg和環(huán)二己基碳酰亞胺13.76mg，充分混勻，室溫避光靜置過夜；次日10000g離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg牛血清白蛋白BSA的硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液的pH為8.7，反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)磁力攪拌4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4t:透析3天，每8小時(shí)換水一次，透析結(jié)束后獲得免疫抗原，分裝并保存于-2(TC冰箱中備用。上述菌核凈的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于將所述多克隆抗體采用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法對(duì)標(biāo)本中菌核凈農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)中使用的包被抗原為半抗原通過活性酯法與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)物。在菌核凈的多克隆抗體的應(yīng)用中活性酯法合成包被抗原的步驟是稱取21mg菌核凈-2-戊二酸半酯溶于0.4mL二甲基甲酰胺中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺7.17mg和環(huán)二己基碳酰亞胺13.76mg，充分混勻，室溫避光靜置過夜；次日lOOOOg離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg卵清蛋白OVA的硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液的pH為8.7，反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)磁力攪拌4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4t:透析3天，每8小時(shí)換水一次，透析結(jié)束后獲得包被抗原，分裝并保存于-2(TC冰箱中備用。在菌核凈的多克隆抗體的應(yīng)用中多克隆抗體采用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法對(duì)樣品中菌核凈農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)是指將被測(cè)植物樣品提取、凈化后制備得到ELISA待測(cè)液，然后利用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的菌核凈含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于菌核凈的多克隆抗體的制備方法簡(jiǎn)單，可以用于對(duì)樣本中的菌核凈農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，與現(xiàn)有的儀器分析方法相比，檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)成本低、適合大量樣品快速篩查檢測(cè)。圖1是菌核凈半抗原(hapten)、BSA及偶聯(lián)物(hap-bsa)的紫外掃描圖譜；圖2是菌核凈半抗原(hapten)、OVA及偶聯(lián)物(hap-ova)的紫外掃描圖譜；圖3是間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定的菌核凈抗體(抗血清)效價(jià)曲線；圖4是間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立的菌核凈檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1.免疫抗原與包被抗原的合成用活性酯法合成免疫抗原稱取21mg(0.0583mmo1)半抗原溶于0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)7.17mg(0.0623mmo1)和環(huán)二己基碳酰亞胺(DCC)13.76mg(0.0667mmo1)，充分混勻，室溫避光靜置過夜。次日10000g離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg(0.00037mmo1)牛血清白蛋白BSA的硼酸緩沖液中(pH8.7)，反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)磁力攪拌4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4t:透析3天，每8小時(shí)換水一次，透析結(jié)束后獲得免疫抗原Hapten-BSA，分裝并保存于-20°0冰箱中備用。用活性酯法合成包被抗原Hapten-OVA的合成方法與免疫抗原Hapten-BSA的步驟相同，區(qū)別僅在于將載體蛋白牛血清白蛋白BSA更換為卵清蛋白OVA，在此不再。如圖1圖2所示的紫外掃描圖譜可見，半抗原(hapten)、載體蛋白(BSA或OVA)的最大吸收峰分別為249nm和278nm，而偶聯(lián)物(hap-bsa或hap-ova)的最大吸收峰分別介于兩者之間，這可能是由于載體蛋白結(jié)合上半抗原后吸收峰發(fā)生變化，出現(xiàn)疊加現(xiàn)象。這些現(xiàn)象說明載體分子上已成功偶聯(lián)上一定數(shù)量的半抗原。實(shí)施例2.菌核凈多克隆抗體的制備用合成的偶聯(lián)物作為免疫抗原Hapten-BSA，選取2只1.5-2.0kg的純種新西蘭大白兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)前一周采集陰性血清。具體免疫程序見表1:首次免疫每只兔子采用lmg免疫原與等體積弗氏完全佐劑混和，乳化成油包水乳濁液后進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射(20點(diǎn)左右)。三周后用同樣劑量免疫原與等體積不完全弗氏佐劑進(jìn)行加強(qiáng)，每?jī)芍芗訌?qiáng)1次，共加強(qiáng)4次。當(dāng)血清效價(jià)基本不再升高時(shí)，進(jìn)行沖擊免疫，采用2mg免疫原與等體積的生理鹽水混合，直接耳緣靜脈注射。一周后心臟采血，備用。表1菌核凈免疫采血程序免疫日期周次捆量(一只兔子)部位DateWeekDose(onerabbit)SiteTime首次免疫第l周0.5mL免疫原"K).5mL完全福氏佐劑背部皮下(01月i6號(hào))(0.5mL免疫原含L25mg蛋白)一次加強(qiáng)第4周0.5mL免疫原+0.5mL不完全福氏佐劑背部皮下采愈鼸效輸(2月3號(hào))(2月10號(hào)》二次加強(qiáng)第6周0.5mL兔瘦攝+0,5mL不完全福氏佐劑背部皮下采血鼸效輸(2月16號(hào))(2月23號(hào))三次加強(qiáng)籮8周0.5mL兔疫攝，.5威不完全權(quán)氏俊割背部皮下繁血鱺效價(jià)(3月ig)(3月8號(hào))四次加強(qiáng)第IO周錢胸,SmL不完全檷氏絲』臂德虔下采齟灘效輸(3月15號(hào))(3月22號(hào):)沖擊免疫第12廁耳緣靜驗(yàn)(3月29號(hào).)心臟采血第14周---(4月5號(hào))實(shí)施例3.間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體的工作濃度及效價(jià)(1)工作濃度的確定用方陣滴定法確定抗體及包被抗原的工作濃度。選擇OD值為l.O時(shí)的抗原抗體稀釋濃度作為包被抗原抗原、抗體工作濃度，最終選擇的包被抗原稀釋倍數(shù)為IAOOO(以蛋白計(jì)，包被抗原實(shí)際濃度為2iig/mL)，抗體的工作濃度為1/128000。具體操作步驟如下①包被CBS包被緩沖液將包被抗原倍比稀釋100X5n(n=0.5，1，2，4)的四組，分別加于96孔酶標(biāo)微孔板的A和B、C禾PD、E和F、G和H的四組八行中，100yL/孔，4t:過夜。②封閉每孔加1%OVA封閉液200iiL，37"孵育lh。③加樣將倍比稀釋1000X2n(n=8，16，32，64，128，256)的六組抗體分別加于酶標(biāo)板的1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12的六組十二列孔中，100iiL/孔，以陰性血清作對(duì)照，PBS溶液為空白，37t:孵育2h。④加酶標(biāo)二抗用含1%OVA的PBS溶液稀釋酶標(biāo)二抗到工作濃度，100iiL/孔加入酶標(biāo)板，37t:孵育lh。(以上每一步結(jié)束都用PBST洗滌液洗3次)⑤顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100iiL/孔，37t:顯色15min。⑥終止反應(yīng)將2MH2S04快速加到96孔中，50yL/孑L450nm讀取光吸收值。(2)效價(jià)的測(cè)定用方陣滴定法確定的包被原工作濃度包被96孔酶標(biāo)微孔板，將抗血清(陽性血清)和陰性血清進(jìn)行倍比稀釋，以PBS溶液作為空白對(duì)照，用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)，具體步驟按照以下步驟進(jìn)行。以A陽/A陰>2.1的最大稀釋倍數(shù)作為抗體的最終效價(jià)?？贵w計(jì)算獲得的最終效價(jià)為1/512,000。效價(jià)測(cè)定曲線如圖3所示。具體操作步驟如下①包被CBS包被緩沖液將2iig/ml包被原倍加入96孔酶標(biāo)微孔板中，100iiL/孔，4t:過夜。②封閉每孔加1%OVA封閉液200iiL，37°C孵育lh。③加樣將倍比稀釋1000X2n(n=8，16，32，64，128，256)的六組抗體分別加于酶標(biāo)板的1和2、3和4、5和6、7和8、9和10、11和12的六組十二列孔中，100iiL/孔，以陰性血清作對(duì)照，PBS溶液為空白，37t:孵育2h。④加酶標(biāo)二抗用含1%OVA的PBS溶液稀釋酶標(biāo)二抗到工作濃度，100iiL/孔加入酶標(biāo)板，37t:孵育lh。(以上每一步結(jié)束都用PBST洗滌液洗3次)⑤顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100iiL/孔，37t:顯色15min。⑥終止反應(yīng)將2MH2S04快速加到96孔中，50yL/孑L450nm讀取光吸收值。當(dāng)光吸收值低于0.2時(shí)為陰性血清；當(dāng)光吸收值高于0.2時(shí)為陽性血清。[OO51]實(shí)施例4.間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(IC-ELISA)的建立具體步驟如下(1)抗體與標(biāo)樣(待測(cè)樣)預(yù)混用含有10%(v/v)甲醇的PBS緩沖液配置不同濃度的菌核凈標(biāo)樣，濃度分別為0.02iig/ml，0.2iig/ml，2yg/ml，10yg/ml，20yg/ml，50iig/ml，70iig/ml。用PBS將抗體稀釋64000倍(兩倍工作濃度)，再與等體積的標(biāo)樣(待測(cè)樣品)室溫預(yù)混進(jìn)行前抑制，對(duì)照用PBS與抗體等體積預(yù)混，過夜。(2)包被CBS緩沖液將2ug/ml包被抗原，100iiL/孔分別加入酶標(biāo)板，4。C過夜。(3)封閉每孔加封閉液200iiL，37"溫浴lh。(4)加樣品將預(yù)混液加入酶標(biāo)板，100iiL/孔，以PBS為空白對(duì)照，37。C溫浴2h。(5)加酶標(biāo)二抗用含1%OVA的PBS將酶標(biāo)二抗稀釋到工作濃度加入酶標(biāo)板，100iiL/孔，37。C溫浴lh。(以上每一步結(jié)束都用洗滌液PBST洗3次)(6)顯色將底物溶液加到酶標(biāo)板上，100iiL/孔，37t:顯色15min。(T)終止反應(yīng)50iiL/孔2MH2SCV決速加到96孔酶標(biāo)板中，于450nm讀取光吸收值。將不同濃度菌核凈標(biāo)樣對(duì)應(yīng)的吸光值(OD)結(jié)果，按照公式抑制率(I)=IOO[(OD對(duì)照-OD標(biāo)樣yOD對(duì)照]，計(jì)算抑制率(I)。以抑制率為縱坐標(biāo)，標(biāo)樣濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。建立菌核凈的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(如圖4所示)，并對(duì)線性范圍進(jìn)行回歸分析。最后計(jì)算得到，菌核凈線性回歸方程為I=16.616LogC+42.49(R2=0.9417)，菌核凈對(duì)抗體的抑制中濃度(15。)為2.83iig/mL，菌核凈最低檢測(cè)限I1Q為0.011iig/mL，線性檢測(cè)范圍在0.04425.00iig/mL。實(shí)施例5.本發(fā)明對(duì)煙葉中菌核凈農(nóng)藥殘留的檢測(cè)具體操作如下(l)樣品提取稱取無污染的2g干煙葉粉末置于100mL具塞三角瓶中，5瓶為一組，共六組，前五組分別添加lmL濃度分別為10iig/ml、20、30iig/ml、40iig/ml、50iig/ml的菌核凈標(biāo)樣(用含有10%甲醇(v/v)的PBS溶液配置)，使得樣品中菌核凈的含量分別為5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg五個(gè)水平，第六組添加lmL純甲醇作為空白對(duì)照，室溫下放置2小時(shí)。加入30mL乙腈，振蕩提取30min，勻漿2min過濾，濾渣用10mL乙腈洗滌。合并濾液于100mL具塞三角瓶中，加入0.5-lg氯化鈉，蓋上塞子，劇烈振蕩lmin，室溫下靜置10min，待乙腈相和水相分層后，準(zhǔn)確吸取20mL乙腈相溶液，加入到刻度試管中，4(TC條件下氮?dú)獯蹈?，殘留物用lmL正己烷溶解，待凈化。(2)樣品凈化用氟羅里硅土柱進(jìn)行凈化，先用3mL丙酮正己烷(l:10，v:v)和3mL正己烷預(yù)淋洗氟羅里硅土柱。將用lmL正己烷溶解的殘留物無損轉(zhuǎn)移到氟羅里硅土柱，用iOmL丙酮正己烷(i:io，v:v)淋洗液洗脫，收集洗脫液，40°c條件下氮?dú)獯蹈桑眉状级ㄈ葜羖mL，在旋渦混合器上充分混勻，制備得到ELISA待測(cè)液，用于ELISA檢測(cè)。(3)ELISA檢測(cè)方法將凈化后溶于lmL甲醇的空白添加樣品用PBST稀釋10倍、20倍、50倍、100倍，用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法測(cè)定，找出OD值在1.0附近的稀釋倍數(shù)。按此稀釋倍數(shù)將添加樣品的甲醇提取液稀釋后與等體積抗體預(yù)混兩小時(shí)，根據(jù)實(shí)施例4的步驟進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定，計(jì)算煙葉中菌核凈的殘留量及添加回收率及變異系數(shù)。如表2所示，當(dāng)煙葉中菌核凈濃度在5mg/kg-25mg/kg的范圍內(nèi)，添加回收率和變異系數(shù)均在殘留檢測(cè)許可范圍內(nèi)，該方法可以應(yīng)用與煙葉中菌核凈殘留的快速檢測(cè)。表2ELISA法測(cè)定煙葉中菌核凈殘留量的添加回收率及變異系數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上各實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的具體限定。權(quán)利要求一種菌核凈的多克隆抗體，由半抗原與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔后獲得，其特征在于半抗原為菌核凈-2-戊二酸半酯。2.如權(quán)利要求1所述菌核凈的多克隆抗體的制備，其特征在于將菌核凈-2-戊二酸半酯用活性酯法與牛血清白蛋白偶聯(lián)，合成免疫抗原，再將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得菌核凈的多克隆抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述菌核凈的多克隆抗體的制備，其特征在于活性酯法合成免疫抗原的步驟是稱取21mg菌核凈-2-戊二酸半酯溶于0.4mL二甲基甲酰胺中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺7.17mg和環(huán)二己基碳酰亞胺13.76mg，充分混勻，室溫避光靜置過夜；次日lOOOOg離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg牛血清白蛋白BSA的硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液的pH為8.7，反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)磁力攪拌4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4t:透析3天，每8小時(shí)換水一次，透析結(jié)束后獲得免疫抗原，分裝并保存于-2(TC冰箱中備用。4.如權(quán)利要求1所述菌核凈的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于將多克隆抗體采用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法對(duì)樣品中菌核凈農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)中使用的包被抗原為半抗原通過活性酯法與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)物。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述菌核凈的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于活性酯法合成包被抗原的步驟是稱取21mg菌核凈-2-戊二酸半酯溶于0.4mL二甲基甲酰胺中，再加入N-羥基琥珀酰亞胺7.17mg和環(huán)二己基碳酰亞胺13.76mg，充分混勻，室溫避光靜置過夜；次日10000g離心10min，棄去沉淀，將上清液緩慢加入到3mL含有25mg卵清蛋白OVA的硼酸緩沖液中，硼酸緩沖液的pH為8.7，反應(yīng)液在室溫下繼續(xù)磁力攪拌4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液裝入透析袋中，在去離子水中4t:透析3天，每8小時(shí)換水一次，透析結(jié)束后獲得包被抗原，分裝并保存于-2(TC冰箱中備用。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述菌核凈的多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于多克隆抗體采用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法對(duì)樣品中菌核凈農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)是指將被測(cè)植物樣品提取、凈化后制備得到ELISA待測(cè)液，然后利用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中的菌核凈含量。全文摘要本發(fā)明涉及一種菌核凈的多克隆抗體及其制備和應(yīng)用，多克隆抗體由半抗原與牛血清蛋白BSA偶聯(lián)獲得免疫抗原，免疫新西蘭大白兔獲得，其特征在于半抗原為菌核凈-2-戊二酸半酯。將菌核凈-2-戊二酸半酯用活性酯法與牛血清白蛋白偶聯(lián)，合成免疫抗原，再將免疫抗原用于免疫新西蘭大白兔，獲得多克隆抗體。多克隆抗體采用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法對(duì)標(biāo)本中菌核凈農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)中使用的包被抗原為半抗原通過活性酯法與卵清蛋白OVA的偶聯(lián)物。其優(yōu)點(diǎn)是菌核凈的多克隆抗體的制備方法簡(jiǎn)單，可以用于對(duì)樣本中的菌核凈農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速檢測(cè)，與現(xiàn)有的儀器分析法相比，檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)成本低、適合大量樣品快速篩查等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C07K1/113GK101691404SQ20091023282公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年10月20日優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日發(fā)明者劉媛,劉蓉蓉,劉賢金,張存政申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院