一種eola1多克隆抗體的制備及免疫定位方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種E OLA I多克隆抗體的制備及免疫定位方法，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]人內(nèi)皮高表達(dá)脂多糖相關(guān)因子l(endothel ial-overexpressedlipopolysaccharide-associatedfact
or I，E0LA I)基因是本研究室前期克隆到的一個(gè)人類新基因，因其受到脂多糖(LP S )刺激后在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，故命名為內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)脂多糖相關(guān)因子I (EOLA I )，前期對(duì)E OLAl基因的定位進(jìn)行了研究，因其所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)存在蛋白激酶C和酪氨酸激酶一磷酸化位點(diǎn)及一個(gè)螺旋一轉(zhuǎn)角一螺旋(H T H)基序，考慮其可能為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究基因功能的一個(gè)重要前提就是需要用合適的抗體去檢測基因的表達(dá)，然現(xiàn)有技術(shù)中還未有該抗體去檢測基因表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種E OLAl多克隆抗體的制備及免疫定位方法，該方法能成功制備E O LA I多克隆抗體，證實(shí)E O LA I蛋白在乳腺癌組織癌細(xì)胞胞漿中有表達(dá)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種E O L A I多克隆抗體的制備及免疫定位方法，該方法采用構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌及誘導(dǎo)表達(dá)，抽提目的蛋白免疫家兔制備多克隆抗體，免疫組織化學(xué)法檢測E OLA I在部分人體惡性腫瘤組織中的表達(dá)。
[0005]由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用原核表達(dá)的方法制備了EOLAl蛋白全長序列抗原，以此免疫家兔后獲得了高效價(jià)的兔抗人E OLAl多克隆抗體，用免疫組織化學(xué)法檢測了腫瘤組織中E O L A I的表達(dá)情況，結(jié)果顯示E OLAl蛋白在檢測的食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤和乳腺癌間質(zhì)細(xì)胞胞漿中都有表達(dá)，而在實(shí)質(zhì)癌細(xì)胞中僅有乳腺癌細(xì)胞胞漿可見表達(dá)，腫瘤間質(zhì)由纖維結(jié)締組織及血管組成，各種腫瘤的間質(zhì)基本相同，不具特異性，對(duì)腫瘤實(shí)質(zhì)起營養(yǎng)和支持保護(hù)作用，EOLAI蛋白大量表達(dá)于腫瘤間質(zhì)細(xì)胞，提示E O L A I蛋白在腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用，血管生成除在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要地位外，也參與了糖尿病眼底視網(wǎng)膜病變、缺血再灌注損傷等病理生理改變，血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化在血管生成中起主要作用，其他細(xì)胞起輔助和支持作用，研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化后，胞內(nèi)M T蛋白表達(dá)增加，激活NF -K B和A P -1信號(hào)通路，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (MM P - 9)的表達(dá)，后者能分解細(xì)胞周圍的基質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成，從而導(dǎo)致血管生成的加速，EOLAl可能通過在內(nèi)皮細(xì)胞中與M T 2 A的相互作用影響著這條通路的活化，中飲用水有機(jī)污染物經(jīng)過ADME過程作用于大鼠肝組織蛋白質(zhì)，主要攻擊蛋白質(zhì)氨基酸的側(cè)鏈而生成羰基；飲用水有機(jī)污染物代謝物(羥基自由基)直接作用于肽鍵，使肽鍵斷裂并產(chǎn)生羰基；與非蛋白羰基化合物結(jié)合，如丙二醛是含氧的羰基化合物，它能夠插入到蛋白質(zhì)內(nèi)部引起蛋白質(zhì)羰基上升，說明飲用水有機(jī)物對(duì)大鼠肝臟的氧化損傷指標(biāo)中，肝組織PCO比肝組織MDA更加敏感。
【具體實(shí)施方式】
[0006]下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0007]本發(fā)明的實(shí)施例:
I材料與方法
1.1 材料
家兔購自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，PET-46EK/LI C質(zhì)粒購自美國N οvagen公司，人ECV304細(xì)胞株為西南醫(yī)院燒傷實(shí)驗(yàn)室保存，Trizol提取試劑購自北京鼎國生物公司，RT P C R試劑盒購自大連T a k a r a公司，完全弗氏佐齊[J (comp I e t e F reund’ s a d j uvaant,CF A)和不完全弗氏佐齊 Li(i n c o m p I eteFreund’sadj uvaant,IFA)購自 G i b c ο BR L公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自VECTORLAB公司，蛋白提取試劑RIPABBuf f e r購自S i g m a公司，生物素標(biāo)記二抗購自中衫金橋公司，E C L發(fā)光試劑盒購自P i e r c e公司，BL21(DE3)plys感受態(tài)細(xì)胞購自上海索萊寶生物科技有限公司。
[0008]1.2 制備目的蛋白
1.2.1 人ECV304細(xì)胞總RNA的提取-收集培養(yǎng)的人E C V 3 O 4細(xì)胞約5 X I O 7個(gè)，經(jīng)P B S漂洗2次，按照T r i z ο I提取試劑說明操作，獲得細(xì)胞總RN A樣品后測A 2 6 O / A 2 8 O比值分析純度，I %瓊脂糖凝膠電泳分析。
[0009]1.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)E O L A I基因開放閱讀框(ORF)序列設(shè)計(jì)上游引物5 ' — GACGACGACAAGATGAAGTTTGGCTGCC-3',下游引物5'-GAGGAGAAGCCCGGTTCACACTTCATG - Z'，交由上海生工生物工程有限公司合成。
[0010]1.2.3 細(xì)胞總 RN A的R T - P C R 按RT -PCR試齊[J
盒說明書配制2 O μ I反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反轉(zhuǎn)錄條件:5 O °C, 3 O m i η ；99°C，5min;4°C，5min。將所得結(jié)果加入8 O μ IPC R反應(yīng)體系；P C R條件:9 4 °C 預(yù)變性 2 m i η，9 4 °C 變性 3 O s，5 9 °C 退火 3 O s，7 2 °C 延伸 I 5 m in，共3 O個(gè)循環(huán)；7 2°C延伸I Omi η，I %瓊脂糖凝膠電泳分析后目的片段凝膠回收純化。
[0011]1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化細(xì)菌
目的片段經(jīng)T 4 DNA連接酶和d AT P處理成黏性末端，且與PET-46EK/LI C空質(zhì)粒黏端互補(bǔ)，兩者退火連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒；將后者用熱休克方法轉(zhuǎn)化到非宿主表達(dá)菌(N ovaBlueSingles T M感受態(tài)細(xì)菌)，涂布于L B培養(yǎng)板(Am P 5 O m g / L )上過夜生長，應(yīng)用菌落P C R的方法篩選出陽性單菌落，菌液標(biāo)本送上海生工生物工程有限公司測序鑒定。
[0012]1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主表達(dá)菌
將測序正確的菌株接種至L B培養(yǎng)板生長I 2 h，挑取單菌落，3 7 °C恒溫?fù)u菌過夜，按質(zhì)粒提取試劑盒說明操作提取重組質(zhì)粒；將后者用熱休克方法轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)菌BL21(DE3)plysS，PCR篩選陽性菌落，一7 O °C保存。
[0013]1.2.6 EOLAl在大腸桿菌中的表達(dá)及目的蛋白分析
挑取單菌落接種至L B培養(yǎng)液，3 7 1:搖菌培養(yǎng)I 2 h，將菌液以1:10 0接種于新鮮L B培養(yǎng)基(含Am P 5 O mg / L)，振蕩搖菌2 5 h后至D 6 0 0 ^0.6 ;分成兩組，一組加入異丙基β - D硫代半乳糖苷(I P T G)至終濃度為Immo I / L，誘導(dǎo)搖菌培養(yǎng)3 h，另一組不加I P T G搖菌培養(yǎng)3 h，分別取菌液1ml，離心收集菌體，PBS重懸后加2倍S D S上樣緩沖液，超聲波處理后8 5 °C加熱3 m i η變性獲I O倍濃縮體積的細(xì)菌總蛋白；分別另取菌液1ml，離心收集菌體，BugBus ter液Iml裂解后離心，取上清加2倍S D S上樣緩沖液混合，8 5 °C加熱3 m i η
變性獲得細(xì)菌胞質(zhì)可溶性組分；將沉淀用2Qmmol/LTrisHCl(pH7.