專(zhuān)利名稱(chēng)：穩(wěn)定的抗體組合物和用于穩(wěn)定其的方法
穩(wěn)定的抗體組合物和用于穩(wěn)定其的方法與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)要求于2008年11月觀日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/118，528的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容引入本文。
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白細(xì)胞介素-12 (IL-12)和相關(guān)細(xì)胞因子IL-23是共享共同p40亞單位的細(xì)胞因子的 IL-12 超家族成員(Anderson 等人(2006) Springer Semin. Immunopatho 1. 27:425-42)。 IL-12主要刺激Thl細(xì)胞的分化和干擾素-Y的隨后分泌，而IL-23優(yōu)先刺激幼稚T細(xì)胞分化成效應(yīng)T輔助細(xì)胞(Thl7)，其分泌IL-17，促炎介質(zhì)(Rosmarin和Mrober (2005) J. Drugs Dermatol. 4:318-25 ；Harrington ^A (2005) Nature Immunol. 6:1123-32 ；Park 等人(2005) Nature Immunol. 6:1132-41)。人白細(xì)胞介素12 (IL-12)是具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和多效性作用的細(xì)胞因子(Kobayashi 等人(1989) J. Exp. Med. 170 :827-845 Jeder 等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:10188-92 ;Ling 等人(1995) J. Exp. Med. 154:116-127 ;Podlaski 等人(1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237IL-12 是包括；35 kDa 亞單位(p35)和 40 kDa 亞單位 (P40)的異二聚體蛋白質(zhì)，所述亞單位通過(guò)二硫鍵連接在一起(稱(chēng)為“p70亞單位”)。異二聚體蛋白質(zhì)主要通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生。這些細(xì)胞類(lèi)型還分泌相對(duì)于P70亞單位過(guò)量的p40亞單位。p40和p35亞單位在遺傳上無(wú)關(guān)，并且無(wú)一據(jù)報(bào)道具有生物學(xué)活性，盡管P40同二聚體可以充當(dāng)IL-12拮抗劑。IL-12在與涉及免疫和炎癥應(yīng)答的幾種疾病相關(guān)的病理學(xué)中起關(guān)鍵作用。IL-12、其生物學(xué)活性及其在疾病中的作用的綜述可以在 Gately 等人(1998) Ann. Rev. Immunol. 16 :495-521 中找到。功能上，IL-12在調(diào)節(jié)抗原特異性T輔助類(lèi)型(Thl)和2型(Th2)淋巴細(xì)胞之間的平衡中起關(guān)鍵作用，這控制自身免疫病癥的起始和進(jìn)展，并且在Thl淋巴細(xì)胞分化和成熟的調(diào)節(jié)中是關(guān)鍵的。由Thl細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子是炎性的，并且包括干擾素γ (IFN γ, IL-2和淋巴毒素(LT)。Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL_5、IL_6、IL-10和IL-13，以促進(jìn)體液免疫、 變態(tài)反應(yīng)和免疫抑制。人白細(xì)胞介素23(IL_23)是包括19 kDa亞單位(ρ 19)和共同40 kDa亞單位(ρ40) 的異二聚體蛋白質(zhì)，其通過(guò)二硫鍵連接在一起。IL-23類(lèi)似于IL-12主要通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生。IL-23的主要作用涉及刺激⑶4+ T細(xì)胞(也稱(chēng)為IL-17 T細(xì)胞或Thl7)亞群，以產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-17。IL-17本身又是自身免疫炎癥的確立和維持中的關(guān)鍵組分，誘導(dǎo)通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子生產(chǎn)(Kastelein 等人(2007)加Rev. Immunol. 25:221-42)。與Thl應(yīng)答在自身免疫疾病中的優(yōu)勢(shì)以及IFN Y和IL-17的促炎活性一致，IL-12 和IL-23在與許多自身免疫和炎性疾病相關(guān)的病理學(xué)中起主要作用，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)、多發(fā)性硬化(MS)、牛皮癬、胰島素依賴(lài)性糖尿病和Crohn氏病(⑶)。與健康對(duì)照相比較，升高水平的IL-12 p70已在RA患者的滑液中檢測(cè)出(Morita 等人(1998)Arthritis and Rheumatism 41 306-314)。在RA滑液中的細(xì)胞因子信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)概況占優(yōu)勢(shì)地鑒定Thl細(xì)胞因子。(Bucht等人(1996)Clin. Exp. Immunol. 103:；347-367)。使用缺乏IL-23的pl9亞單位或IL-12/23的p40亞單位的基因靶向的小鼠，IL-23顯示對(duì)于膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)展是關(guān)鍵的(Murphy等人(2003)乂 Exp. Med. 198 (12) 1951-1957)。具有MS的人患者已證實(shí)IL-12/IL-23表達(dá)中的增加，如通過(guò)急性MS斑中的p40 mRNA 水平證明的。(參見(jiàn)例如，Windhagen 等人(1995)J. Exp. Med. 182:1985-96)。此外， 與對(duì)照T細(xì)胞相比較，抗原呈遞細(xì)胞用來(lái)自MS患者的⑶40L表達(dá)T細(xì)胞的先體外后體內(nèi)刺激導(dǎo)致增加的IL-12生產(chǎn)，與⑶40/⑶40L相互作用是IL-12的有效誘導(dǎo)物的觀察一致。 使用缺乏IL-23的基因靶向的小鼠，IL-23顯示對(duì)于腦的自身免疫炎癥是關(guān)鍵的(Cua等人 (.2QQ ,)Nature 421:7440748)。增加的IFN Y和IL-12表達(dá)已在具有⑶的患者的腸粘膜中觀察到(Fais等人(1994) J. Interferon Res. 14 235-238 ;Parronchi 等 A (1997) Am. J. Path. 150823-832 ；Monteleone 等人(1997gastroenterology 112:1169-1178，和 Berrebi 等人 (1998)Am. J. Path. 152 667-672)。來(lái)自⑶患者的固有層的T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌概況是占優(yōu)勢(shì)地Thl應(yīng)答的特征，包括極大升高的IFN γ水平(Fuss等人(1996) J. Immunol. 157:1261-1270)。此外，來(lái)自⑶患者的結(jié)腸組織切片顯示IL-12表達(dá)巨噬細(xì)胞和IFN γ 表達(dá) T 細(xì)胞的豐度(Parronchi 等人(1997)Am. J. Path. 150823-832)。增加的 IL-23 表達(dá)也已在具有Crohn氏病的患者和炎性腸病的小鼠模型中觀察到。IL-23對(duì)于T細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎是關(guān)鍵的，且在結(jié)腸炎的小鼠模型中通過(guò)IL-17-和IL-6依賴(lài)性機(jī)制促進(jìn)炎癥(參見(jiàn)例如通過(guò) Zhang 等人(2007)7/ iera. Immunopharmacology 7:409-416 的綜述)。IL-12/IL-23 p40和IL-23 pl9信使RNA在牛皮癬皮膚損傷中的超表達(dá)暗示用針對(duì)IL-12/23 p40亞單位蛋白質(zhì)的中和抗體抑制IL-12和IL-23可以提供用于治療牛皮癬的有效治療方法(Yawalkar 等人(1998) J. Invest. Dermatol. Ill :1053-57 ;Lee 等人(2004) J. Exp. Med. 199 :125-30 ;Shaker 等人(2006) Clin. Biochem. 39:119-25; Piskin 等人(2006) J. Immunol. 176 :1908-15 ；還參見(jiàn)由 iTorti 等人(2007)7； Am. Acad. Dermatol. 57 (6) : 1059-1068 ;Fitch 等人(2007)0/rre/ i TSewBaioA^F Tfeports 9:461-467)的近期綜述。)。2種細(xì)胞因子都促成在牛皮癬中1型T輔助細(xì)胞(Thl)免疫應(yīng)答的發(fā)展，但各自具有獨(dú)特作用(Rosmarin和Strober (2005) J. Drugs Dermatol. 4:318-25 ;Hong等人(1999)J. Immunol. 162:7480 - 91 ;Yawalkar等人(1998)J. Invest. Dermatol. 111:1053-57)。用于牛皮癬治療的此種治療方法是本領(lǐng)域明確需要的。由于人IL-12和IL-23在多種人病癥中的作用，治療策略已設(shè)計(jì)為抑制或抵消 IL-12/IL-23活性。特別地，已尋求結(jié)合且中和IL-12/IL-23的p40亞單位的抗體作為抑制IL-12/IL-23活性的工具。一些最早的抗體是鼠單克隆抗體(mAbs)，通過(guò)由用IL-12 免疫接種的小鼠的淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤分泌(參見(jiàn)例如Strober等人的PCT公開(kāi)號(hào)WO 97/15327 ;Neurath 等人(1995) J. Exp. Med. 182 1281-1290 ;Duchmann 等人(1996) J. Immunol. 26:934-938).這些鼠IL-12抗體對(duì)于其體內(nèi)用途是受限的，這是由于與小鼠抗體施用于人相關(guān)的問(wèn)題，例如短血清半衰期、不能觸發(fā)特定人效應(yīng)子功能和在人中引起針對(duì)小鼠抗體的有害的免疫應(yīng)答(“人抗小鼠抗體”(HAMA)反應(yīng))。一般而言，克服與全鼠抗體在人中的使用相關(guān)的問(wèn)題的嘗試已涉及將抗體基因工程改造為更“人樣”。例如，已制備了其中抗體鏈的可變區(qū)是鼠衍生的并且抗體鏈的恒定區(qū)是人衍生的嵌合抗體(Junghans 等人(1990) Cancer Res. 50 1495-1502 ;Brown 等人 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2663-2667 ;Kettleborough 等人(1991 )Protein Engineering 4:773-783)。然而，因?yàn)檫@些嵌合和人源化抗體仍保留一些鼠序列，所以它們?nèi)钥赡芤鹩泻Φ拿庖叻磻?yīng)，人抗嵌合抗體(HACA)反應(yīng)，尤其當(dāng)施用延長(zhǎng)的時(shí)間段時(shí)。針對(duì)鼠抗體或其衍生物(例如嵌合或人源化抗體)的優(yōu)選IL-12/IL-23抑制試劑是完全人抗IL-12/IL-23抗體，這是因?yàn)榇朔N試劑不應(yīng)引起HAMA反應(yīng)，即使用于延長(zhǎng)的時(shí)間段。已描述了這樣的重組人抗體，其以高親和力和緩慢解離動(dòng)力學(xué)結(jié)合人IL-12/IL-23 的p40亞單位，并且具有中和人IL-12的能力，包括hIL-12誘導(dǎo)的植物凝集素胚細(xì)胞增殖 (blast proliferation)和hIL-12誘導(dǎo)的人IFNy生產(chǎn)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，914，128)。單克隆抗體(Mabs)對(duì)于特異性抗原的選擇性使得其成為極佳的治療候選物。然而，由于抗體分子的結(jié)構(gòu)，它們易受酶促和非酶促降解攻擊。例如，抗體在升高的溫度貯存延長(zhǎng)的時(shí)間段導(dǎo)致抗體的非酶促降解(Connell，G.E.和R. H. Painter (1966) Can. J. Biochem. 44 (3):371-9 ;Cordoba，A. J.等人(2005)J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818 (2) : 115-21 ;Cohen，S. L.等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 129 (22) :6976-7)ο人免疫球蛋白Y (IgG)抗體一般由2條等同輕鏈和重鏈組成。重鏈具有Y類(lèi)型， 而輕鏈可以是κ或λ類(lèi)型，在其羧基末端恒定區(qū)中不同。鏈間二硫鍵使重鏈保持在一起。 二硫鍵數(shù)目在IgG亞類(lèi)中不同。例如，對(duì)于IgGl，存在2個(gè)重鏈間二硫鍵，以及一個(gè)二硫鍵使每條輕和重鏈保持在一起。IgG分子由通過(guò)鉸鏈區(qū)連接的Fc區(qū)和2個(gè)Fab區(qū)組成。鉸鏈區(qū)分成3個(gè)部分-上部、核心和下部區(qū)域(

圖1)。上部區(qū)域使Fab臂與核心連接，而下部區(qū)域使Fc部分與核心連接。核心區(qū)包含鏈間二硫鍵，并且具有高脯氨酸含量。鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度在IgG亞類(lèi)中不同， 并且提供對(duì)于Fab臂的彈性，從而允許在臂之間的角度變化以及圍繞其軸的旋轉(zhuǎn)自由。由于其彈性的結(jié)果，鉸鏈區(qū)暴露，并且因此容易受溫度和延長(zhǎng)時(shí)間段的貯存干擾。例如，鉸鏈區(qū)對(duì)于蛋白酶例如木瓜蛋白酶和Iys-C易接近，這常規(guī)地用于生成抗體的Fc和Fab片段。 在這個(gè)區(qū)域中切割I(lǐng)gG分子的其他酶包括組織蛋白酶L、纖溶酶和金屬蛋白酶。當(dāng)在5°C貯存延長(zhǎng)的時(shí)間段時(shí)，在液體制劑中的單克隆抗體經(jīng)歷非酶促水解， 從而獲得 Fab+Fc 和 Fab 片段(Jiskoot，W.等人(1990) Pharm. Res. 7 (12) :1234-41 ； Alexander，A. J.和 D. Ε· Hughes (1995)Anal. Chem. 67 (20):3626-32 ；Cordoba,A. J.等 Λ(2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818 (2) :115-21 ； Liu，H.等人(2006) J. Chrom. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 837:35-43;和 Cohen，S. L.等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 1 (22) :6976_7)。一般通過(guò)尺寸排阻層析(SEC)監(jiān)控的斷裂在極端pH條件和高溫下增加(Cohen，S. L.等人(2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22):6976-7)。切割跨越重鏈區(qū)序列 kr-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys 在多個(gè)肽鍵上發(fā)生。跨越重鏈序列Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys的切割導(dǎo)致Fab片段(48 kDa) 的相應(yīng)梯，而在％1-078殘基之間的切割經(jīng)由β消除機(jī)制發(fā)生，并且導(dǎo)致重和輕鏈片段(23 kDa)。在包含κ輕鏈的IgG分子的鉸鏈區(qū)中金屬誘導(dǎo)的斷裂在重組單克隆抗體 Campath 中得到證實(shí)(Smith，Μ. Α.等人(1996) Int. J. Pept. Protein Res. 48 (1):48-55)。Smith等人報(bào)道在微堿性pH銅介導(dǎo)的斷裂，并且切割特異性定位在重鏈序列 Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys的鉸鏈區(qū)中的賴(lài)氨酸和蘇氨酸殘基之間。切割機(jī)制未由作者揭示，然而，切割在pH 5-6的酸性條件下減少。仍需要測(cè)定圍繞抗體分子斷裂的參數(shù)，以提供穩(wěn)定組合物(例如制劑)和用于在加工和貯存過(guò)程中阻止其制劑中的抗體切割的方法。例如，仍需要包括抗體或其片段的水性藥物制劑，其適合于治療用途以抑制或抵消有害的IL-12和/或IL-23活性，并且在加工和長(zhǎng)期貯存過(guò)程中具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性，并且對(duì)于λ輕鏈斷裂具有增強(qiáng)的抗性。發(fā)明概述
在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括抗體或其抗原結(jié)合部分的水性制劑，所述抗體包括 λ鏈，例如適合于治療用途以抑制或抵消有害的IL-12和/或IL-23活性，并且與領(lǐng)域公認(rèn)的制劑相比較具有改善性質(zhì)的抗體。例如，本發(fā)明的制劑例如以液態(tài)或固態(tài)具有至少M(fèi)個(gè)月的保存期限。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的制劑在制劑的至少5個(gè)凍/融循環(huán)后維持穩(wěn)定性。在第二個(gè)方面，基于下述觀察在組氨酸的存在下，由于在鉸鏈區(qū)中的特異性切割，鐵導(dǎo)致包含λ輕鏈的抗體斷裂的增加，本發(fā)明提供了用于抑制包括λ輕鏈的免疫球蛋白斷裂的組合物和方法。組氨酸單獨(dú)在制劑中的存在對(duì)斷裂沒(méi)有作用。斷裂水平就鐵和組氨酸水平而言是劑量依賴(lài)性的。由鐵和組氨酸引起的升高水平的斷裂在包含κ輕鏈的抗體中未觀察到。含λ鏈的抗體在這樣的殘基上切割，所述殘基存在于鉸鏈區(qū)中，在連接輕鏈和重鏈的二硫鍵附近。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括包含至少部分λ輕鏈的分子和包括組氨酸的緩沖系統(tǒng)的穩(wěn)定制劑，其中所述制劑基本上不含金屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬是狗2+或!^3+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬是Cu2+或 Cul+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了在具有約5 -約7的pH的包括組氨酸的緩沖溶液中包括治療有效量的包括λ輕鏈的分子的穩(wěn)定制劑，其中金屬以在組氨酸的存在下不導(dǎo)致λ輕鏈切割的濃度存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了穩(wěn)定制劑，其包括包含至少部分λ輕鏈的分子、包括咪唑的緩沖系統(tǒng)和金屬，其中分子在金屬的存在下在鉸鏈區(qū)內(nèi)不被切割。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑在實(shí)施選自下述的至少一種程序后是基本上不含金屬的過(guò)濾、緩沖液更換、層析和樹(shù)脂交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液更換包括用選自下述的緩沖液透析包括組氨酸的緩沖液、包括檸檬酸鹽和磷酸鹽的緩沖液和包括咪唑的緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬以下述濃度存在例如小于約5，060十億分率(parts per billion)(ppb)、小于約 1，060 ppb、小于約 560 ppb、小于約 310 ppb、小于約 160 ppb、 小于約110 ppb和小于約70 ppb。在特定實(shí)施方案中，金屬以小于約160 ppb的濃度存在， 且更優(yōu)選以小于約70 ppb的濃度存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括包含λ輕鏈的分子和選自多元醇和表面活性劑的至少一種另外賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包括穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包括甘露糖醇、聚山梨醇酯80和甲硫氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包括檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，PH是約5或更少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括(a) 1-10%甘露糖醇，(b)0. 001% -0. 聚山梨醇酯80，和(c)具有5 - 7 的pH，包括1-100 mM組氨酸和1-50 mM甲硫氨酸的緩沖系統(tǒng)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括(a)2-6%甘露糖醇，(b)0. 005-0. 05%聚山梨醇酯80，和(c)具有5 - 7的pH，包括 5-50 mM組氨酸和5-20 mM甲硫氨酸的緩沖系統(tǒng)。在特定實(shí)施方案中，制劑包括(a)約4% 甘露糖醇，(b)約0.01%聚山梨醇酯80，和(c)具有約6的pH，包括約10 mM組氨酸和約10 mM甲硫氨酸的緩沖系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了水性藥物制劑，其包括(a) 1-250 mg/ml與 IL-12/IL-23的p40亞單位的表位結(jié)合的人抗體，(b) 1-10 %甘露糖醇，(c) 0. 001% -0. 聚山梨醇酯80，(d) 1-50 mM甲硫氨酸，和(e) 1-100 mM組氨酸，具有5 - 7的pH， 其中制劑基本上不含金屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑不具有小于約2. 5 mS/com的導(dǎo)電性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑不是在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，914，128的實(shí)施例9中使用的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子是單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。在各種實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分的濃度是例如約1 -約250 mg/ml、約40 -約200 mg/ml、或是約100
mg/mlο在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是能夠與IL-12/IL-23的p40亞單位的表位結(jié)合的人抗體或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)P40亞單位與IL-12的p35亞單位結(jié)合時(shí)，人抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與P40亞單位的表位結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)p40亞單位與IL-23的pl9亞單位結(jié)合時(shí)，人抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與p40亞單位的表位結(jié)合。 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)P40亞單位與IL-12的p35亞單位結(jié)合時(shí)，并且當(dāng)p40亞單位還與IL-23的pl9亞單位結(jié)合時(shí)，人抗體或其抗原結(jié)合部分能夠與p40亞單位的表位結(jié)合。在特定實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分結(jié)合選自Y61和J695的抗體與之結(jié)合的IL-12/ IL-23的p40亞單位的表位。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明再進(jìn)一步提供了水性藥物制劑，其包括(a)約100 mg/ ml與IL-12/IL-23的p40亞單位的表位結(jié)合的人抗體，(b)約4%甘露糖醇，(b)約0. 01% 聚山梨醇酯80，(c)約10 mM甲硫氨酸，和(d) 10 mM組氨酸，具有約6的pH。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分以1 χ 10, M或更少的Kd或以1 χ 10_3 S-1或更少的k。ff速率常數(shù)與IL-12/IL-23的p40亞單位解離，如通過(guò)表面等離振子共振測(cè)定的。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分中和IL-12/IL-23的p40亞單位的生物學(xué)活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分中和IL-12的生物學(xué)活性。在特定實(shí)施方案中，IL-12功能的中和通過(guò)人抗體或其片段與IL-12的p40亞單位的相互作用來(lái)達(dá)到。在特定實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分以1 χ 10_9 M或更少的IC5tl在體外PHA測(cè)定中抑制植物凝集素胚細(xì)胞增殖，或以1 χ ΙΟ"10 M或更少的IC5tl抑制人IFNy產(chǎn)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其結(jié)合部分中和IL-23的生物學(xué)活性。在特定實(shí)施方案中，IL-23功能的中和通過(guò)人抗體或其片段與IL-23的p40亞單位的相互作用來(lái)達(dá)到。在一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包括SEQ ID NO=I的氨基酸序
14列的重鏈⑶R3和包括SEQ ID NO :2的氨基酸序列的輕鏈⑶R3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包括SEQ ID NO :3的氨基酸序列的重鏈⑶R2和包括SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的輕鏈CDR2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包括SEQ ID NO 5的氨基酸序列的重鏈⑶Rl和包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的輕鏈⑶R1。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO :8的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在特定實(shí)施方案中，人抗體是抗體J695或其抗原結(jié)合部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑具有至少M(fèi)個(gè)月的保存期限。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑在制劑的至少5個(gè)凍/融循環(huán)后維持穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑進(jìn)一步包括另外試劑，例如另外的治療劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，另外的治療劑選自布地奈德，表皮生長(zhǎng)因子，皮質(zhì)類(lèi)固醇，環(huán)孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水楊酸鹽，6-巰基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制劑，美沙拉秦，奧沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化劑，血栓烷抑制劑，IL-I受體拮抗劑，抗IL-Ιβ單克隆抗體，抗IL-I受體抗體，抗IL-6單克隆抗體，抗IL-6受體抗體，生長(zhǎng)因子，彈性蛋白酶抑制劑，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-U IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 和 PDGF 的抗體或激動(dòng)劑，針對(duì) CD2、CD3、CD4、CD8、CD20、CD25、 ⑶觀、⑶30、⑶40、⑶45、⑶69、⑶90或其配體的抗體，氨甲蝶呤，F(xiàn)K506，雷帕霉素，霉酚酸酯， 來(lái)氟洛米，NSAID，布洛芬，強(qiáng)的松龍，磷酸二酯酶抑制劑，SlPl激動(dòng)劑，bcl-2抑制劑，腺苷激動(dòng)劑，抗凝劑，補(bǔ)體抑制劑，腎上腺素能藥，IRAK, NIK, IKK, p38，MAP激酶抑制劑，IL-1 β 轉(zhuǎn)換酶抑制劑，TNFa轉(zhuǎn)換酶抑制劑，T細(xì)胞發(fā)信號(hào)抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，可溶性細(xì)胞因子受體，可溶性Ρ55 TNF受體，可溶性p75 TNF受體，sIL-lRI， sIL-lRII, sIL-6R，抗炎細(xì)胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13 和 TGFβ。在另一個(gè)實(shí)施方案中，另外的治療劑選自抗TNF抗體及其抗體片段、TNFR-Ig構(gòu)建體、TACE抑制劑、PDE4抑制劑、皮質(zhì)類(lèi)固醇、布地奈德、地塞米松、柳氮磺吡啶、5-氨基水楊酸、奧沙拉嗪、IL-I β轉(zhuǎn)換酶抑制劑、IL-lra、酪氨酸激酶抑制劑、6-巰基嘌呤和IL-11。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，另外的治療劑選自甲基強(qiáng)的松龍、環(huán)磷酰胺、4-氨基吡啶、替扎尼定、干擾素-β la、干擾素-β lb、共聚物1、高壓氧、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、克拉屈濱(clabribine)、TACE抑制劑、激酶抑制劑、sIL_13R、抗P7和ρ-選擇蛋白糖蛋白配體 (PSGL)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包括包含至少部分λ輕鏈的分子、包括組氨酸的緩沖系統(tǒng)和金屬螯合劑的穩(wěn)定制劑，其中分子在鉸鏈區(qū)內(nèi)不被切割，或在鉸鏈區(qū)內(nèi)的切割水平小于在不存在金屬螯合劑的情況下觀察到的切割水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬是狗2+或!^3+。在另一個(gè)實(shí)施方案中，金屬是Cu2+或 Cul+。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬螯合劑選自檸檬酸鹽，鐵載體，杯芳烴(calixerenes)，氨基多羧酸，羥基氨基羧酸，N-取代的甘氨酸，2- (2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙磺酸(BES)， 二齒、三齒或六齒鐵螯合劑，銅螯合劑，及其衍生物、類(lèi)似物和組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬螯合劑是去鐵胺。在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于抑制或阻止在包含組氨酸的制劑中包括至少部分λ輕鏈的分子切割的方法，該方法包括抑制或阻止金屬切割分子的能力的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或阻止包括在制劑中包括至少一種金屬螯合劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或阻止包括對(duì)分子實(shí)施選自下述的至少一種程序過(guò)濾(超濾和滲濾)、緩沖液更換、層析和樹(shù)脂交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液更換包括用選自下述的緩沖液透析包括組氨酸的緩沖液、包括檸檬酸鹽和磷酸鹽的緩沖液和包括咪唑的緩沖液。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或阻止包括通過(guò)改變?chǔ)溯p鏈或重鏈中的至少一個(gè)氨基酸來(lái)抑制或阻止切割。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或阻止包括通過(guò)這樣改變?chǔ)随溨械陌被嵝蛄袕亩沟冒被嵝蛄泄劝彼?半胱氨酸-絲氨酸被改變來(lái)抑制或阻止切割。 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或阻止包括降低制劑的PH朝向更酸性水平，例如至ρΗ 5或更少。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制或阻止包括在制劑中包括另外的緩沖液，例如檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括約1-100 mM組氨酸，例如約10 mM組氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括在25°C或40°C 6個(gè)月后不導(dǎo)致含λ鏈抗體切割的鐵水平，例如鐵以小于約160 ppb存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子以約lmg/ml -約300 mg/ml的濃度范圍存在，例如約 ang/ml、例如約 7mg/ml、例如約 100mg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子是免疫球蛋白，例如單克隆抗體。在特定實(shí)施方案中，分子是抗IL-12/23抗體，例如J695。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是抗⑶_80或和抗IGF1，2抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分子包含選自下述的鉸鏈區(qū)DVD-IgTM、Fab片段、F(ab’)2 片段、嵌合抗體、CDR嫁接的抗體、人源化抗體、人抗體、二硫鍵連接的Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體、多特異性抗體、雙重特異性抗體和雙特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子包括至少部分重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，部分重鏈包括氨基酸序列絲氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-賴(lài)氨酸(SCDK)，或不抑制抗體結(jié)合的至少一種修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，切割在絲氨酸和半胱氨酸殘基之間的鉸鏈區(qū)中發(fā)生。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，切割在半胱氨酸和天冬氨酸殘基之間發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬是!^2+或狗3+。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，金屬是Cu2+或 Cul+。在一個(gè)實(shí)施方案中，λ輕鏈包括氨基酸序列谷氨酸-半胱氨酸-絲氨酸 (ECS)，或不抑制抗體結(jié)合的至少一種修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，切割在λ鏈的鉸鏈區(qū)中發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，切割在谷氨酸和半胱氨酸殘基之間發(fā)生。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，切割在絲氨酸和半胱氨酸殘基之間發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，切割在約2°C -約25°C的溫度發(fā)生，例如約2°C -約8°C。在一個(gè)實(shí)施方案中，切割在PH約4 -約8發(fā)生，例如約ρΗ 5 -約6。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是選自下述的鐵載體產(chǎn)氣菌素、農(nóng)桿菌載鐵素、固氮菌素(azotcAactin)、kicillibactin、N- (5-C3-L (5氨基戊基)羥基氨基甲?；?_丙酰胺基)戊基)-3 (5- (N-羥基乙酰氨基)-戊基)氨基甲?；?-丙異羥肟酸 (去鐵敏、去鐵胺或DFO或DEF)、去鐵硫辛(desferrithiocin)、腸桿菌素、erythrobactin、 鐵色素、鐵草銨B、鐵草銨Ε、fluviabactin、鐮刀霉氨酸C、分枝菌素、副球菌素、假單胞菌
16素、弧菌載鐵素、創(chuàng)傷弧菌載鐵素(vulnikictin)、耶爾森菌素、ornibactin，及其衍生物、類(lèi) 1 以物禾口組合(Roosenberg，J. Μ.等人(2000) Studies and Syntheses of Siderophores, Microbial Iron Chelators,and Analogs as Potential Drug Delivery Agents. Current Medicinal Chem. 7:159-197)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬螯合劑是去鐵胺。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是檸檬酸鹽或磷酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是選自下述的氨基多羧酸乙二胺四乙酸(EDTA)、氮川乙酸(NTA)、反式環(huán)己二胺四乙酸(DCTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、 N-2-乙酰氨基-2-亞氨基二乙酸(ADA)、天冬氨酸、雙(氨乙基)乙二醇醚N，N，N’ N’ -四乙酸(EGTA)、谷氨酸和N，N，-雙(2-羥芐基)乙二胺-N，N，- 二乙酸(HBED)，及其衍生物、類(lèi)似物和組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是選自下述的羥基氨基羧酸N-羥乙基亞氨基二乙酸(HIMDA)、隊(duì)^雙羥乙基甘氨酸(1^(^116)、和^ (三羥甲基甲基)甘氨酸 (tricine),及其衍生物、類(lèi)似物和組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是N-取代的甘氨酸，或其衍生物、類(lèi)似物或組合。例如，N-取代的甘氨酸選自甘氨酰甘氨酸，及其衍生物、類(lèi)似物和組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是2- (2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙磺酸(BES )，或其衍生物、類(lèi)似物和組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是杯芳烴，例如基于酚和醛的羥烷基化產(chǎn)物的大環(huán)或環(huán)狀寡聚物，或其衍生物、類(lèi)似物或組合(Gutsche，C. D. (1989) Calixarenes. Cambridge :Royal Society of Chemistry ;Dharam,P 禾口 Harjit,S. (2006) Syntheses, Structures and Interactions of Heterocalixarenes, Arcivoc.)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑包括DTPA和DEF的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑包括EDTA、EGTA和DEF的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是羥基吡啶-衍生物、腙-衍生物、和羥苯基-衍生物或煙?；?衍生物，例如1，2- 二甲基-3-羥基吡啶-4-酮(去鐵酮(Deferiprone)、DFP 或 Ferriprox) ；2-脫氧-2- (N-氨基甲?；谆?[N，-2'-甲基-3'-羥基吡啶-4'-酮])-D-吡喃葡萄糖(Feralex-G)、吡哆醛異煙酰腙(PIH) ；4, 5- 二氫-2-(2, 4- 二羥苯基)-4-甲基噻唑 4-羧酸(6156-252)、4-[3，5-雙(2-羥苯基)-[1，2，4] 三唑-1-基]苯甲酸(ICL-670) ；N，N，-雙(ο-羥芐基)乙二胺-N，N，- 二乙酸(HBED)、 5-氯-7-碘代-喹啉-8-醇(氯碘羥喹)，或其衍生物、類(lèi)似物或組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑是選自下述的銅螯合劑三亞乙基四胺(曲恩汀)、四亞乙基五胺、D-青霉胺、乙二胺、雙吡啶、菲咯啉(phenantroline)、紅菲繞啉、新亞銅試劑、浴銅靈磺酸鹽、cuprizone、順式，順式-1，3，5，-三氨基環(huán)己烷(TACH)， tachpyr，及其衍生物、類(lèi)似物和組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種金屬螯合劑可以選自本領(lǐng)域所述試劑的螯合劑、 類(lèi)似物和衍生物，例如在下述中描述的那種“Iron Chelators and Therapeutic Uses，，， 通過(guò) Bergeron, R.等人’ in Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 第 6 版，第 3 卷Cardiovascular Agents and Endocrines,由 Abraham, D. J 編輯，John Wiley & Sons，he. 2003。另外，螯合劑可以選自在下述中所述試劑的螯合劑、類(lèi)似物和衍生物美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，083，966、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，521，652、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，525，080、美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，559，315、PCT/US2004/029318, PCT/US2003/022012、TO/2002/043722 和 WO 2004/007520。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括選自下述的至少一種另外賦形劑氨基酸、糖、糖醇、緩沖劑、鹽和表面活性劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制劑包括選自下述的至少一種另外賦形劑約1 -約60 mg/ml甘露糖醇、約1 -約50 mM甲硫氨酸、約0. 001 % -約0. 5 %(w/v)聚山梨醇酯80、 約 0.001% -約 (w/v)泊洛沙姆(polyoxamer) 188、約 1 -約 150 mM 氯化鈉、約 1 -約30 mM乙酸鹽、約1 -約30 mM檸檬酸鹽、約1 -約30 mM磷酸鹽和約1 -約30 mM精氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，斷裂的抑制或阻止包括通過(guò)添加酸、滴定或透析或本領(lǐng)域已知減少PH的各種過(guò)濾過(guò)程改變制劑的pH朝向更酸性水平，所述各種過(guò)濾過(guò)程例如但不限于透析或切向流過(guò)濾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，斷裂的抑制或阻止包括使用特異性緩沖劑例如磷酸鹽或檸
檬酸鹽。在第二個(gè)方面的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)在包含組氨酸的制劑中包括至少部分λ輕鏈的分子切割的方法，該方法包括在制劑中包括至少一種金屬螯合劑和就切割分析至少部分λ輕鏈的步驟。附圖簡(jiǎn)述
當(dāng)連同附圖一起閱讀時(shí)，本發(fā)明的前述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)以及本發(fā)明自身根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案的下述描述將得到更全面地理解，其中 圖1顯示抗體分子的鉸鏈區(qū)。圖2顯示在尺寸排阻層析(SEC)后，J695的不同種類(lèi)的分級(jí)分離(級(jí)分1_4)。圖3顯示通過(guò)SDS-PAGE分析的來(lái)自圖2的SEC的不同級(jí)分的評(píng)價(jià)，顯示在級(jí)分3 中的不可還原的(NR)種類(lèi)，重鏈(HC)，輕鏈(LC)和HC的片段(HC-Fc)，和在級(jí)分4中的LC 和 HC-Fab。圖4顯示在去糖基化后來(lái)自圖2的級(jí)分3通過(guò)LC/ESI-MS的分析，顯示在鉸鏈區(qū)中在HC上的多個(gè)切割位點(diǎn)。峰已從(a)到(e)進(jìn)行標(biāo)記，并且峰和切割位點(diǎn)的鑒定在表1 中提供。圖5顯示來(lái)自圖2的級(jí)分4通過(guò)MS的分析，顯示這個(gè)級(jí)分中的相應(yīng)Fab片段。峰從(f )到(j )進(jìn)行標(biāo)記，并且峰和切割位點(diǎn)的鑒定在表1中提供。圖6顯示來(lái)自圖2的級(jí)分4通過(guò)MS的分析，顯示來(lái)自氨基酸殘基1_215的游離LC 和來(lái)自氨基酸殘基1-217的游離HC。圖7顯示來(lái)自圖2的級(jí)分3通過(guò)CE-SDS的分析，顯示片段2 (Fab+Fc)，而級(jí)分4 包含F(xiàn)ab和LC和HC片段。完整抗體中的片段2與其他峰良好分辨。圖8顯示使用10，000 MWCO膜包含500 ppb鐵的J695 (Mab-批次1)針對(duì)檸檬酸緩沖液的透析。圖9顯示摻料到J695的正常對(duì)照批次內(nèi)的不同水平金屬鹽(2. 5,10和50 ppm), 在40°C溫育1個(gè)月，并且通過(guò)CE-SDS分析。
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圖10顯示在包含500 ppb鐵的J695與1 mM去鐵胺在40°C溫育1個(gè)月后，通過(guò) CE-SDS的分析。圖11顯示在針對(duì)水透析，并且與組氨酸、鐵或鐵和組氨酸兩者溫育后，不含鐵的 J695的正常批次。圖12顯示包含500 ppb鐵的應(yīng)激J695針對(duì)正常應(yīng)激批次的來(lái)自圖2的片段2通過(guò)ESI/LC-MS的比較。圖13顯示相應(yīng)Fab種類(lèi)的分析，揭示當(dāng)包含鐵的應(yīng)激J695與正常應(yīng)激批次相比較時(shí)，切割位點(diǎn)是可比較的。圖14顯示LC和HC片段的分析，揭示更高水平的重(1-217)和輕鏈(1-215)片段。圖15顯示鐵誘導(dǎo)的包含λ或Κ輕鏈的IgG分子斷裂的研究。圖16顯示在λ或Κ輕鏈上的殘基序列和被切割的鍵。發(fā)明詳述 I.定義
術(shù)語(yǔ)“抗體”泛指任何免疫球蛋白(Ig)分子，其包括通過(guò)二硫鍵互連的4條多肽鏈一一 2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈，或其任何功能片段、突變體、變體或衍生物，其保留Ig分子的基本表位結(jié)合特征。此種突變體、變體或衍生抗體形式是本領(lǐng)域已知的，其非限制性實(shí)施方案在本文中討論。在全長(zhǎng)抗體中，每條重鏈包括重鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。 重鏈恒定區(qū)包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域一一 CHI、CH2和CH3。每條輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(本文縮寫(xiě)為 LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域一一 CL。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步再分成稱(chēng)為互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，由稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守區(qū)域點(diǎn)綴。每個(gè)VH和 VL由3個(gè)⑶Rs和4個(gè)FRs組成，從氨基末端到羧基末端以下述次序排列FR1、⑶Rl、FR2、 CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以具有任何類(lèi)型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、類(lèi)別(例如 IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgAl 和 IgA2)或亞類(lèi)。術(shù)語(yǔ)“Fe區(qū)”指免疫球蛋白重鏈的C末端區(qū)域，其可以通過(guò)完整抗體的木瓜蛋白酶消化生成。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包括2個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域一一 CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，且任選包括CH4結(jié)構(gòu)域。替換Fc部分中的氨基酸殘基以改變抗體效應(yīng)子功能是本領(lǐng)域已知的(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，648，260和5，624，821)?？贵w的Fc部分介導(dǎo)幾種重要的效應(yīng)子功能，例如細(xì)胞因子誘導(dǎo)、依賴(lài)抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)、 吞噬作用、依賴(lài)補(bǔ)體的細(xì)胞毒性(CDC)以及抗體和抗原-抗體復(fù)合物的半衰期/清除率。 特定人IgG同種型，特別是IgGl和1863，經(jīng)由分別與？(^1^和補(bǔ)體Clq結(jié)合介導(dǎo)ADCC 和⑶C。免疫球蛋白的2條等同重鏈的二聚化通過(guò)CH3結(jié)構(gòu)域的二聚化介導(dǎo)，并且通過(guò)鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵穩(wěn)定(Huber 等人(1976) Nature 264:415-20 ；Thies 等人(1999) J. Mol. Biol.四3:67-79)。在鉸鏈區(qū)內(nèi)半胱氨酸殘基的突變以阻止重鏈-重鏈二硫鍵使CH3結(jié)構(gòu)域的二聚化去穩(wěn)定。負(fù)責(zé)CH3 二聚化的殘基已得到鑒定(Dair Acqua (1998) Biochem. 37:9266-73).因此，可能生成單價(jià)半_Ig。單價(jià)半Ig分子已在自然界中對(duì)于IgG和IgA亞類(lèi)發(fā)現(xiàn)(SeIigman (1978) Ann. Immunol. 1 855-70 ;Biewenga 等人(1983) Clin. Exp. Immunol. 51:395-400)。半Ig分子可以在組織穿透中具有特定優(yōu)點(diǎn)，這是由于其比常規(guī)抗體的那種更小的尺寸。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸殘基在本發(fā)明的結(jié)合蛋白的恒定區(qū)例如Fc區(qū)中被替換，從而使得重鏈的二聚化被破壞，導(dǎo)致半Ig分子。輕鏈可以是κ 或λ類(lèi)型。術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”或“抗體部分”包括保留與抗原(例如hIL-12和/或 hIL-23)特異性結(jié)合的能力的抗體片段。此種抗體片段還可以是雙特異性、雙重特異性或多特異性的，例如它與2種或更多種不同抗原特異性結(jié)合。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí)行。在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)包括的結(jié)合片段例子包括 (i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii) F(ab’)2片段，包括在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(ν)由VH結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段 (Ward等人，(.19mNature 341 544-546)；和(vi )分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。此外， 盡管Fv片段的2個(gè)結(jié)構(gòu)域VL和VH由分開(kāi)的基因編碼，但它們可以使用重組法通過(guò)合成接頭進(jìn)行連接，所述合成接頭使得它們能夠制備為單條蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)以形成單價(jià)分子(稱(chēng)為單鏈Fv (scFv)；參見(jiàn)例如，Bird等人(1988)242:423-426 ； 和 Huston 等人(1988Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此種單鏈抗體也意欲包含在術(shù)語(yǔ)抗體的“抗原結(jié)合部分”內(nèi)。還包含其他形式的單鏈抗體，例如雙抗體。雙抗體是二價(jià)、雙特異性抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單條多肽鏈上表達(dá)，但使用太短而不允許相同鏈上的2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，從而迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并且產(chǎn)生2個(gè)抗原結(jié)合部位(參見(jiàn)例如，Holliger，P.等人(1993)/￥oc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 ;Poljak，R. J.等人(1994) Sirwciare 2:1121-1123)。此種抗原結(jié)合部分是本領(lǐng)域已知的(Kontermann和Dubel編輯(2001) Antibody EnRineering, Springer-Verlag, New York.第790頁(yè)。此外，單鏈抗體還包括包含一對(duì)串聯(lián)Fv區(qū)段 (VH-CH1-VH-CH1)的“線性抗體”，其連同互補(bǔ)輕鏈多肽構(gòu)成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等人 (1995) Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 ；美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，641，870)。再進(jìn)一步地，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是通過(guò)抗體或抗體部分與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合形成的較大免疫粘附分子的部分。此種免疫粘附分子的例子包括使用鏈霉抗生物素蛋白核心區(qū)，以制備四聚scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等人
Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101 )，以及使用半胱氨酸殘基、標(biāo)記肽和 C末端多組氨酸標(biāo)簽，以制備二價(jià)和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。抗體部分例如Fab和F(ab’)2片段可以使用常規(guī)技術(shù)由完整抗體制備，例如完整抗體分別地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得，如本文描述的。優(yōu)選的抗原結(jié)合部分是完整結(jié)構(gòu)域或完整結(jié)構(gòu)域?qū)?。術(shù)語(yǔ)“多價(jià)結(jié)合蛋白”指包括2個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合部位的結(jié)合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，多價(jià)結(jié)合蛋白工程改造為具有3個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合部位，并且一般不是天然存在的抗體。術(shù)語(yǔ)“多特異性結(jié)合蛋白”還指能夠結(jié)合2種或更多種相關(guān)或無(wú)關(guān)靶的結(jié)合蛋白。雙重可變結(jié)構(gòu)域(DVD-Ig )結(jié)合蛋白包括2個(gè)或更多個(gè)抗原結(jié)合部位，并且是四價(jià)或多價(jià)結(jié)合蛋白。DVD-Ig s可以是單特異性的，即能夠結(jié)合一種抗原，或多特異性的，即能夠結(jié)合2種或更多種抗原。包括2條重鏈DVD-Ig 多肽和2條輕鏈DVD-Ig 多肽的DVD-Ig 結(jié)合蛋白被稱(chēng)為DVD-Ig 。DVD-Ig 的每一半包括重鏈DVD-Ig 多肽和輕鏈DVD-Ig 多肽，和2個(gè)抗原結(jié)合部位。每個(gè)結(jié)合部位包括重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，具有涉及抗原結(jié)合的總共6個(gè)CDRs/抗原結(jié)合部位。術(shù)語(yǔ)“雙特異性抗體”指通過(guò)下述生成的全長(zhǎng)抗體四源雜交瘤(quadroma)技術(shù) (Milstein，C.和 Α. C. Cuello (1983) Nature 305 (5934) 537-40)，2 種不同單克隆抗體的化學(xué)綴合(Staerz，U. D.等人(1985)Nature 314 (6012)628-31 )，或在Fc區(qū)中引入突變的“結(jié)進(jìn)孔(knob-into-hole)” 或類(lèi)似方法(Holliger，P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-8. 18)，從而導(dǎo)致多個(gè)不同的免疫球蛋白種類(lèi)，其中僅一個(gè)是功能性雙特異性抗體。通過(guò)分子功能，雙特異性抗體在其2個(gè)結(jié)合臂之一(一對(duì)HC/LC)上結(jié)合一種抗原(或表位)，并且在其第二個(gè)臂(不同對(duì)的HC/LC)上結(jié)合不同抗原(或表位)。通過(guò)這個(gè)定義，雙特異性抗體具有2個(gè)不同的抗原結(jié)合臂(在特異性和CDR序列中)，并且對(duì)于它與之結(jié)合的每種抗原是單價(jià)的。術(shù)語(yǔ)“雙重特異性抗體”指這樣的全長(zhǎng)抗體，其在其2個(gè)結(jié)合臂的每一個(gè)(一對(duì)HC/ LC)中可以結(jié)合2種不同抗原(或表位)(PCT公開(kāi)號(hào)WO 02/02773)。因此，雙重特異性結(jié)合蛋白具有2個(gè)等同的抗原結(jié)合臂，具有等同特異性和等同CDR序列，并且對(duì)于它與之結(jié)合的每種抗原是二價(jià)的。免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域指重或輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。人IgG重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“mAb”指得自基本上同質(zhì)抗體群體的抗體，即構(gòu)成群體的個(gè)別抗體是等同的，除可能少量存在的可能天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體是高度特異性的， 針對(duì)單一抗原。此外，與一般包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑形成對(duì)比，每種mAb針對(duì)在抗原上的單個(gè)決定簇。修飾語(yǔ)“單克隆的”不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法的抗體產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗體通過(guò)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指這樣的抗體，其包括來(lái)自一個(gè)物種的重和輕鏈可變區(qū)序列和來(lái)自另一個(gè)物種的恒定區(qū)序列，例如具有與人恒定區(qū)連接的鼠重和輕鏈可變區(qū)的抗體。術(shù)語(yǔ)“⑶R嫁接的抗體”指這樣的抗體，其包括來(lái)自一個(gè)物種的重和輕鏈可變區(qū)序列，但其中VH和/或VL的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的序列由另一個(gè)物種的CDR序列替換，例如具有鼠重和輕鏈可變區(qū)的抗體，其中一個(gè)或多個(gè)鼠⑶Rs (例如⑶R3)已由人⑶R序列替換。術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有與人種系免疫球蛋白序列對(duì)應(yīng)的可變和恒定區(qū)的抗體，如由 Kabat 等人描述的(參見(jiàn) Kabat 等人(1991，&卯日/^然 of Proteins of Immunological Interest，第 5 版’ U. S. Department of Health and Human Services, NIH
發(fā)明者肯托爾 A., H. 拉茲杰夫斯基 C., R. 科雷亞 I., W. 瓦納 N., 弗勞恩霍菲 W. 申請(qǐng)人:雅培制藥有限公司