專利名稱：可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定p53表達的細胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡心骨腫瘤，發(fā)病年齡主要集中在10-20歲之間， 在臨床住院治療的惡性骨腫瘤病人中占35%-44%，因其惡性程度高、轉(zhuǎn)移早，療效差，一直是臨床骨科醫(yī)生研究的難點、焦點和熱點。隨著新輔助化療的積極開展配合積極的手術(shù)治療如保肢手術(shù)的開展，使骨肉瘤的生存質(zhì)量和預(yù)后明顯改善，國外五年生存率已達到了 80% 以上，國內(nèi)較好的骨腫瘤治療中心五年生存率達到了 60%左右，與國外還存在不小的差距， 究其原因1.治療的巨額花費患者難以承受而放棄治療和中途停止治療，2.部分病人因為肺部和遠處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)和化療、放療的嚴重毒副作用和并發(fā)癥，及產(chǎn)生耐藥問題而影響了這些方法的臨床推廣和應(yīng)用。尋求一種經(jīng)濟、安全、有效、毒副作用小或者可以減少或降低現(xiàn)有藥物劑量的方法用于骨肉瘤的治療成為患者、臨床醫(yī)生、生物學家和藥物學家共同的愿望。P53是重要的腫瘤抑制基因，自從該基因在1979年被首次報道以來，有關(guān)研究論文在Medline上可查到20000余篇。人們最初認為P53基因是一種癌基因，但隨著近十年研究的深入，P53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示出來。在人類50%以上的腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了 P53基因的突變，這是腫瘤中最常見的遺傳學改變，骨肉瘤中P53突變率為75%，主要集中在5 9外顯子，說明該基因的改變很可能是人類腫瘤產(chǎn)生的主要發(fā)病因素。該基因轉(zhuǎn)錄的P53蛋白可以修復(fù)細胞DNA損傷，在損傷不能修復(fù)的情況下阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞的凋亡。P53與細胞內(nèi)其它信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的聯(lián)系十分復(fù)雜，其中P53參與調(diào)控的基因已超過160種，許多化療藥物都直接或間接的通過調(diào)節(jié)P53來達到使腫瘤細胞凋亡的目的。 而HPV 16型E6蛋白具有泛素化降解P53蛋白的作用，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)的E6基因的表達，來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)P53蛋白含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株，本發(fā)明的第二個目的是提供上述的細胞株的構(gòu)建方法，本發(fā)明的第三個目的是提供上述的細胞株在篩選預(yù)防或治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株，該細胞株訪)于2010年8月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO :C201075。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案 可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株的構(gòu)建方法，該方法包括以下的步驟
(1)將HPV 16型E6基因編碼基因插入真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體；
(2)將步驟(1)得到的重組表達載體和表達調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入宿主細胞中，篩選得到可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株。作為進一步的改進，所述的表達調(diào)控系統(tǒng)為Clontech公司的1Tet-Off advanced 系統(tǒng)。作為進一步的改進，所述的真核表達載體具體為Tet-OfT advanced系統(tǒng)中的 pTRE-tight 質(zhì)粒。作為進一步的改進，所述的宿主細胞為U-20S細胞。為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
上述的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株用于篩選預(yù)防或治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。一種篩選預(yù)防或治療骨肉瘤的藥物的細胞模型，該細胞模型采用上述的可誘導(dǎo)、 雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株。實驗證明，本發(fā)明的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株U_20SE6tet6可通過多西環(huán)素調(diào)節(jié)E6基因的表達，間接改變U-20SE6tet6細胞內(nèi)P53含量，為篩選治療骨肉瘤的藥物的P53相關(guān)作用機制的研究提供實驗平臺。


圖 1 為 Clontech 公司 p^Tet-Off Advanced 系統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)象。圖2為Clontech公司pTRE_Tight質(zhì)粒，E6基因插入于多克隆位點(MCS)。圖3為U_20SE6tet6細胞顯微鏡下200 X圖像。圖 4 為 western blot 結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1、重組表達載體pTRE-HA-E6的構(gòu)建
構(gòu)建帶HA標簽的含E6基因的質(zhì)粒pHA-E6。首先用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I 將pCl neo質(zhì)粒進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳純化收集，得到含巨細胞病毒早期即刻增強子/啟動子的cDNA。同時將不包含啟動子的pEGFP-1質(zhì)粒也用限制性內(nèi)切酶Bgl II和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物同樣進行瓊脂糖凝膠電泳純化收集，用 DNA連接酶連接上述得到的產(chǎn)物，即得到插入了巨細胞病毒早期即刻增強子/啟動子的 pEGFP-Ι質(zhì)粒。HPV 16型E6基因從宮頸癌Siha細胞基因組中PCR擴增獲得(正向引物 5，-GAAACCGGTTAGTATAAAAGC-3，；反向引物，5，-CCATGGTAGATTATGGTTTCT-3，)。將獲得的 E6基因的cDNA克隆到含HA標簽的Bluescript KS質(zhì)粒中，以Β ο I和Not I限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化收集獲得含HA標簽的HA-E6酶切產(chǎn)物，同時以Bio I 和Not I限制性內(nèi)切酶對插入巨細胞病毒早期即刻增強子/啟動子后的pEGFP-1后質(zhì)粒進行雙酶切，將純化收集的酶切產(chǎn)物與HA-E6酶切產(chǎn)物以DNA連接酶進行連接，即獲得pHA_E6 質(zhì)粒。將PHA-E6質(zhì)粒和pTRE-Tight質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I進行雙酶切，分別純化分離酶切產(chǎn)物，通過DNA連接酶，將HA-E6基因片段插入到pTRE-Tight質(zhì)粒EcoR I鈍尾和BamH I之間，從而獲得重組目的質(zhì)粒pTRE-HA_E6。實施例2可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株U_20SE6tet6的構(gòu)建
將骨肉瘤U-20S細胞接種于6孔板上，密度約30萬個/孔。以Lipofectamine 2000 將Clontech公司的pTet-Off質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入U-20S細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后收獲細胞，接種于多塊IOcm細胞培養(yǎng)皿中，從低到高遞增濃度(0，50，100，200，400，800 μ g/ml) G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pTet-Off基因的細胞克隆，發(fā)現(xiàn)200 μ g/ml以上濃度G418篩選5天后細胞基本死亡，遂以200 μ g/ml篩選培養(yǎng)2周，獲得有G418抗性的細胞克隆。再以Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染含熒光素酶報告基因的四環(huán)素響應(yīng)元件pTRE-luc表達質(zhì)粒到上述細胞，通過熒光素酶報告基因活性強弱，篩選活性最高的受四環(huán)素嚴格調(diào)控的細胞克隆做下一步轉(zhuǎn)染母細胞。挑選30個細胞克隆接接種于6孔板，1天后以Lipofectamine 2000將轉(zhuǎn)染了 HPV 16 E6蛋白基因pTRE-HA-E6質(zhì)粒和攜帶潮霉素抗性基因的pTk-Hyg質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染上述細胞，以G418 200 yg /ml和潮霉素IOOyg /ml培養(yǎng)篩選，最終篩選到一個穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆，命名為U-20SE6tet6細胞，圖3所示為U-20SE6tet6細胞顯微鏡下200X圖像。該細胞株于2010年8月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學保藏中心)，保藏編號為CCTCC NO :C201075。實施例3可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達U_20SE6tet6細胞對多西環(huán)素反應(yīng)性分析將實施例2中獲得的U-20SE6tet6細胞培養(yǎng)于MCCOy’S 5A +10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，
培養(yǎng)基中以G418 IOOyg /ml和潮霉素50 μ g /ml維持，將處于生長對數(shù)期的細胞經(jīng)胰酶消化后計數(shù)，以20萬個/孔接種于6孔板中，加入上述培養(yǎng)基定容至2ml體積，置于37°C 含5% CO2培養(yǎng)箱中。M小時后，更換培養(yǎng)基，取細胞生長良好的板內(nèi)5孔加入多西環(huán)素，使多西環(huán)素濃度分別為0，0. 1，1，5，20ng/ml，培養(yǎng)基定容至^iil，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培樣48小時。48小時后提取細胞核蛋白，通過western blot分析細胞P53蛋白含量變化，如圖4所
7J\ ο結(jié)果表明隨著加入多西環(huán)素的濃度增加，P53蛋白濃度增加，當多西環(huán)素達到 5ng/ml和20ng/ml時，P53濃度達到最大?？烧T導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的骨肉瘤細胞株 U-20SE6tet24構(gòu)建成功，可通過四環(huán)素調(diào)節(jié)E6的表達來間接調(diào)節(jié)P53蛋白含量。
權(quán)利要求
1.可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株，其特征在于該細胞株(U-20SE6tet6)于2010 年8月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:C201075。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括以下的步驟(1)將HPV16型E6基因編碼基因插入真核表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體；(2)將步驟(1)得到的重組表達載體和表達調(diào)控系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入宿主細胞中，篩選得到可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于表達調(diào)控系統(tǒng)為Clontech公司的Tet-Off advanced系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于真核表達載體具體為Tet-Off advanced系統(tǒng)中的pTRE-tight質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株的構(gòu)建方法，其特征在于宿主細胞為U-20S細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株用于篩選預(yù)防或治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。
7.一種篩選預(yù)防或治療骨肉瘤的藥物的細胞模型，該細胞模型采用權(quán)利要求1所述的細胞株。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用?？烧T導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株，該細胞株(U-2OSE6tet6)于2010年8月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOC201075。實驗證明，本發(fā)明的可誘導(dǎo)、雙重穩(wěn)定P53表達的細胞株U-2OSE6tet6可通過多西環(huán)素調(diào)節(jié)E6基因的表達，間接改變U-2OSE6tet6細胞內(nèi)P53含量，為篩選治療骨肉瘤的藥物的P53相關(guān)作用機制的研究提供實驗平臺。
文檔編號A61P35/02GK102168069SQ201010580028
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月9日
發(fā)明者楊迪生, 苗旭東, 陶惠民 申請人:浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院