專利名稱：：用于adamts蛋白表達的細胞培養(yǎng)基的制作方法用于ADAMTS蛋白表達的細胞培養(yǎng)基交叉參考相關(guān)申請本申請要求2009年7月31日提交的第61/230，477號美國臨時申請的利益，為了所有目的將該申請通過引用整體并入本文。關(guān)于對在聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)下進行的發(fā)明的權(quán)利的聲明不適用參考于光盤上提交的“序列表”、表或計算機程序列表附錄不適用
背景技術(shù)：
：ADAMTS(具有血小板反應(yīng)蛋白I型(thrombospondintypeI)模體的去整合素(disintegrin)和金屬蛋白酶)蛋白是包含許多保守結(jié)構(gòu)域(包括鋅依賴性催化結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域、去整合素樣結(jié)構(gòu)域(disintegrin-likedomain)和至少一個(在大多數(shù)情況下多個)血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)的金屬蛋白酶家族(關(guān)于綜述，參見Nicholson等人，BMCEvolBiol.2005Feb4；5(1):11)。在進化上與金屬蛋白酶的ADAM和MMP家族相關(guān)的此類蛋白(JonesGC,CurrPharmBiotechnol.2006Feb；7(1):25-31)是與許多疾病和病況，包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)(MoakeJL,SeminHematol.2004Jan；41(1)4-14)、結(jié)締組織障礙、癌癥、炎癥(Nicholson等人)和嚴重惡性瘧原蟲型瘧疾(Plasmodiumfalciparummalaria)(Larkin等人，PLoSPathog.2009Mar；5(3):el000349)關(guān)聯(lián)的分泌性酶。由于這些關(guān)聯(lián)性，因此ADAMTS酶已被公認為許多疾病的潛在治療性靶(JonesGC，CurrPharmBiotechnol.2006Feb；7(1):25-31)。因此，需要產(chǎn)生大量具有高度特異性活性的ADAMTS蛋白的方法，所述蛋白不含污染物例如病毒、BSE和病原體如支原體(Mycoplasma)細菌。對于細胞，特別是真核細胞，更具體地哺乳動物細胞的培養(yǎng)，一直需要使用提供營養(yǎng)物質(zhì)的特殊培養(yǎng)基，所述營養(yǎng)物質(zhì)是細胞的高效生長和生物制品，特別是生物藥劑，例如重組蛋白質(zhì)、抗體、病毒、病毒抗原、和病毒樣顆粒的生產(chǎn)必需的。對于所述生物制品的有效生產(chǎn)，重要的是獲得最佳細胞密度以及其本身蛋白質(zhì)表達的增加以獲得最大成品收率。細胞培養(yǎng)基制劑補充有一系列添加劑，包括未確定的成分如胎牛血清(FCS)、若干種動物源性蛋白質(zhì)和/或牛來源的蛋白水解產(chǎn)物以及衍生自植物或酵母的蛋白水解產(chǎn)物。一般而言，血清或血清衍生物質(zhì)例如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素可包含不想要的試劑，所述試劑可包含細胞培養(yǎng)物和其獲得的生物制品。此外，必須針對所有已知病毒(包括可通過血清傳播的肝炎病毒和HIV)測試人血清源性添加劑。此外，牛血清和從其衍生的制品具有BSE污染的風險。此外，所有血清源性制品可被未知物質(zhì)污染。當使用血清或從細胞培養(yǎng)中的人或動物來源衍生的蛋白質(zhì)添加劑時，存在許多問題(例如，不同批次的組合物的不同質(zhì)量以及以及被支原體屬、病毒或BSE污染的風險)，特別是如果細胞被用于制造用于人施用的藥物或疫苗時。因此，已作出許多努力以提供不需要血清或其它動物蛋白質(zhì)化合物的有效宿主系統(tǒng)和培養(yǎng)條件。已基于衍生自植物或酵母的蛋白質(zhì)提取物開發(fā)了無血清培養(yǎng)基。例如，已知大豆水解物對于發(fā)酵方法是有用的并且可增強許多營養(yǎng)要求高的生物、酵母和真菌的生長。WO96/26266描述了大豆粉的木瓜蛋白酶消化物是碳水化合物和氮的來源并且許多成分可用于組織培養(yǎng)。Franek等人(BiotechnologyProgress(2000)16,688-692)描述了確定的大豆和小麥水解物肽級分的生長和生產(chǎn)力促進效應(yīng)。WO96/15231公開了由合成最小必需培養(yǎng)基和酵母提取物組成的用于脊椎動物細胞的繁殖和病毒產(chǎn)生過程的無血清培養(yǎng)基。由包含水稻的肽和酵母的提取物及其酶消化物的基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基和/或用于動物細胞生長的植物脂質(zhì)的培養(yǎng)基制劑公開于WO98/15614中。用于培養(yǎng)重組細胞的包含純化的大豆水解物的培養(yǎng)基公開于WO01/23527中。WO00/03000公開了包含大豆水解物和酵母提取物，但也需要動物蛋白質(zhì)例如生長因子的重組形式的存在的培養(yǎng)基。EP-A-O481791描述了用于培養(yǎng)工程CHO細胞的生物化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，其不含從動物來源分離的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物，其還包含重組胰島素或胰島素類似物、至0.025%w/v的木瓜蛋白酶消化的大豆蛋白胨和腐胺。WO98/08934描述了包含水解的大豆肽(l-1000mg/L)、0.01至lmg/L腐胺和多種動物源性成分(包括白蛋白、腐胺、胎球蛋白、不同激素和其它蛋白質(zhì))的無血清真核細胞培養(yǎng)物。在本說明書中，應(yīng)當指出，還已知腐胺以0.08mg/L的濃度包含在標準培養(yǎng)基如DMEM/Ham'sF12中。然而，植物和/或酵母水解物是寡肽和其它未知成分和污染物的成分不明確的混合物。此外，水解物的商購可得批次的質(zhì)量變化極大。因此，在作為所使用的水解物的批次的函數(shù)的重組蛋白質(zhì)或病毒產(chǎn)物的產(chǎn)量上存在較大的偏差(達到3倍的偏差)(“批間偏差(lot-to-lotvariation)")ο該缺點影響了細胞的增殖以及各細胞的蛋白質(zhì)表達。US2007/0212770描述了不同的不含動物蛋白質(zhì)和不含寡肽的化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基對于重組蛋白生物藥劑的大規(guī)模生產(chǎn)是有用的。一個ADAMTS家族成員ADAMTS13在殘基Tyr1605與Met1606之間切害IjvonffiIlebrand因子(vWF)，負責體內(nèi)降解大vWF多聚體的功能。ADAMTS13活性的喪失與許多病況例如TTP(MoakeJL,SeminHematol.2004Jan；41(1):4_14)、急性和慢性炎癥(Chauhan等人，JExpMed.2008Sep1；205(9)=2065-74)以及最近若干種惡性瘧原蟲致瘧疾(Larkin等人，PLoSPathog.2009Mar；5(3):el000349)關(guān)聯(lián)。血栓性血小板減少性紫癜(TTP)是特征在于血栓性微血管病、血小板減少癥和可引起不同程度的組織缺血和梗塞的微血管血栓形成。在臨床上，TTP患者通過癥狀例如血小板減少癥、裂紅細胞(紅細胞的碎片)和升高的乳酸脫氫酶水平(MoakeJL.Thromboticmicroangiopathies.NEnglJMed.2002；347:589-600；MoakeJL.vonWillebrandfactor,ADAMTS13,andthromboticthrombocytopenicpurpura.SeminHematol.2004；414-14；SadlerJΕ,MoakeJL,MiyataΤ,GeorgeJN.Recentadvancesinthromboticthrombocytopenicpurpura.Hematology(AmSocHematolEducProgram)·2004:407-423;SadlerJE.NewconceptsinvonWillebranddisease.AnnuRevMed.2005；56173-191)來診斷。在1982年，Moake等人在慢性復(fù)發(fā)性TTP患者的血漿中發(fā)現(xiàn)非常大的vonWillebrand因子(UL-vffF)多聚體(MoakeJL,RudyCK,TrollJH,WeinsteinMJ,ColanninoNM，AzocarJ，SederRH，HongSL，DeykinD.UnusuallylargeplasmafactorVIII:vonWillebrandfactormultimersinchronicrelapsingthromboticthrombocytopenicpurpura.NEnglJMed.1982；307:1432-1435)。UL-vWF與TTP之間的關(guān)聯(lián)性獲得Furlm等人以及iTsai和Lim的獨立發(fā)現(xiàn)支持，所述發(fā)現(xiàn)是大多數(shù)罹患TTP的患者缺乏血漿金屬蛋白酶(現(xiàn)稱為為ADAMTS13)，所述酶切割vWF(FurlmM，RoblesR，SolenthalerMiWassmerΜ,SandozP,LaemmleB.DeficientactivityofvonWillebrandfactor-cleavingproteaseinchronicrelapsingthromboticthrombocytopenicpurpura.Blood.1997；89:3097-3103；TsaiHM，Sussman，II，GinsburgD，LankhofH，SixmaJJiNagelRL.Proteolyticcleavageofrecombinanttype2AvonWillebrandfactormutantsR834WandR834Q:inhibitionbydoxycyclineandbymonoclonalantibodyVP-1.Blood.1997；89:1954-1962；TsaiHΜ,LianEC.AntibodiestovonWillebrandfactor-cleavingproteaseinacutethromboticthrombocytopenicpurpura.NEnglJMed.1998；339:1585-1594)0ADAMTS13蛋白酶是主要由肝產(chǎn)生的190kDa糖基化蛋白(LevyGG，NicholsWC，LianEC，F(xiàn)oroudT，McClintickJN，McGeeBM，YangAY，SiemieniakDR，StarkKR，GruppoR，SarodeR，ShurinSB，ChandrasekaranV，StablerSP，SabioH，BouhassiraEE，UpshawJD，Jr.，GinsburgD，TsaiHM.MutationsinamemberoftheADAMTSgenefamilycausethromboticthrombocytopenicpurpura.Nature.2001；413:488-494；FujikawaK，SuzukiH，McMullenB，ChungD.PurificationofhumanvonWillebrandfactor-cleavingproteaseanditsidentificationasanewmemberofthemetalloproteinasefamily.Blood.2001；981662-1666；ZhengX，ChungD，TakayamaTK，MajerusEM，SadlerJE，F(xiàn)ujikawaK.StructureofvonWillebrandfactor-cleavingprotease(ADAMTS13)，ametalloproteaseinvolvedinthromboticthrombocytopenicpurpura.JBiolChem.2001；276:41059-41063；SoejimaK，MimuraN，HirashimaM，MaedaH，HamamotoT，NakagakiT，NozakiC.Anovelhumanmetalloproteasesynthesizedintheliverandsecretedintotheblood:possibly，thevonWi1lebrandfactor-cleavingprotease；JBiochem(Tokyo).2001；130475-480；GerritsenHE，RoblesR，LammleB，F(xiàn)urlanM.PartialaminoacidsequenceofpurifiedvonWillebrandfactor-cleavingprotease.Blood.2001；98:1654一1661)。已顯示ADAMTS13基因中的突變引起TTP(LevyGG，NicholsWC，LianEC，F(xiàn)oroudT，McClintickJN，McGeeBΜ,YangAY，SiemieniakDR，StarkKR，GruppoR，SarodeR，ShurinSB，ChandrasekaranV，StablerSP，SabioH，BouhassiraEE，UpshawJD，Jr.，GinsburgD，TsaiHM.MutationsinamemberoftheADAMTSgenefamilycausethromboticthrombocytopenicpurpura.Nature.2001；413:488-494)。通常由抑制ADAMTS-13活性的自身抗體引起的特發(fā)性TTP是在成人和年長孩子中發(fā)生的更常見的障礙，并且可在11%至36%的患者(TsaiHM，LianEC.AntibodiestovonWillebrandfactor-cleavingproteaseinacutethromboticthrombocytopenicpurpura.NEnglJMed.1998；339:1585-1594；FurlanΜ,LammleB.DeficiencyofvonWillebrandfactor-cleavingproteaseinfamilialandacquiredthromboticthrombocytopenic7purpura.BaillieresClinHaematol.1998；11:509-514)中定期間隔發(fā)生。非中和抗體也可通過誘導(dǎo)從循環(huán)的清除來抑制ADAMTS13活性(ScheiflingerF，KnoblP，TrattnerB，PlaimauerB，MohrG，DockalM，DornerF，RiegerM.NonneutralizingIgMandIgGantibodiestovonWillebrandfactor-cleavingprotease(ADAMTS-13)inapatientwiththromboticthrombocytopenicpurpura.Blood.2003；102:3241-3243)。健康成人的血漿ADAMTS13活性在50%至178%的范圍內(nèi)變化(MoakeJLThromboticthrombocytopenicpurpuraandthehemolyticuremicsyndrome.ArchPatholLabMed.2002;口6:1430-1433)。在大多數(shù)家族性TTP或獲得性TTP患者中，血漿ADAMTS13活性不存在或低于5%的正常活性。在不治療的情況下，TTP的死亡率超過90%，但血漿療法使死亡率降低至約20%(MoakeJL.Thromboticthrombocytopenicpurpuraandthehemolyticuremicsyndrome.ArchPatholLabMed.2002；126:1430-1433)。巨核細胞和內(nèi)皮細胞中合成的vWF分別貯存在血小板α-顆粒和Weibel-Palade小體如超大vWF(UL-vWF)中(MoakeJL，RudyCK，TrollJH，WeinsteinMJ，ColanninoNM，AzocarJ，SederRH，HongSL，DeykinD.UnusuallylargeplasmafactorVIII:vonWillebrandfactormultimersinchronicrelapsingthromboticthrombocytopenicpurpura.NEnglJMed.1982；307:1432-1435；WagnerDD，OlmstedJB，MarderVJ.ImmunolocalizationofvonWillebrandproteininWeibel-Paladebodiesofhumanendothelialcells.JCellBiol.1982；95:355-360；WagnerDD，BonfantiR.vonWillebrandfactorandtheendothelium.MayoClinProc.1991；66:621-627；SpornLA，MarderVJ，WagnerDD.vonWillebrandfactorreleasedfromWeibel-Paladebodiesbindsmoreavidlytoextracellularmatrixthanthatsecretedconstitutively.Blood.1987；69:1531-1534；TsaiHM，NagelRL，HatcherVB，Sussman，II.Endothelialcell-derivedhighmolecularweightvonWillebrandfactorisconvertedintotheplasmamultimerpatternbygranulocyteproteases.BiochemBiophysResCommun.1989；158:980-985；TsaiHM，NagelRL,HatcherVB，Sussman,II.Multimericcompositionofendothelialcell-derivedvonWillebrandfactor.Blood.1989；73:2074-2076)。一旦從內(nèi)皮細胞分泌，此類UL_vWF多聚體被循環(huán)中的ADAMTS13在vWF分子中的特定切割位點上切割成一系列更小的多聚體(TsaiHMiNagelRL，HatcherVB,Sussman,II.Endothelialcell-derivedhighmolecularweightvonWillebrandfactorisconvertedintotheplasmamultimerpatternbygranulocyteproteases.BiochemBiophysResCommun.1989；158:980-985；DentJA，GalbuseraM，RuggeriZM.HeterogeneityofplasmavonWillebrandfactormultimersresultingfromproteolysisoftheconstituentsubunit.JClinInvest.1991；88:774-782；FurlanM，RoblesR，AffolterD，MeyerD，BaillodP，LammleB.TripletstructureofvonWillebrandfactorreflectsproteolyticdegradationofhighmolecularweightmultimers.ProcNatlAcadSciUSA.1993;90:7503-7507)。ADAMTS13在成熟vWF亞基的中心A2結(jié)構(gòu)域中的Tyr842_M討843鍵上切割并且需要鋅或鈣來獲得活性(DentJA，BerkowitzSD，WareJ，KasperCK，RuggeriZΜ.IdentificationofacleavagesitedirectingtheimmunochemicaldetectionofmolecularabnormalitiesintypeIIAvonWillebrandfactor.ProcNatlAcadSciUSA.1990;87:6306-6310)。vWF存在于〃紗線球(ball-of-yarn)“和絲狀體(filamentousform)(如通過電子顯微鏡術(shù)看到的)中(SlayterH，LoscalzoJ，BockenstedtP，HandinRI.NativeconformationofhumanvonWillebrandprotein.Analysisbyelectronmicroscopyandquasi-elasticlightscattering.JBiol.Chem.1985；260:8559-8563)。此外，原子力顯微鏡確認了vWF在靜止條件下以球形構(gòu)造存在并且在暴露于剪切應(yīng)力后以展幵的絲狀態(tài)存在(SiedleckiCA,LestiniBJ，Kottke-MarchantKKiEppellSJiWilsonDLiMarchantRE.Shear-dependentchangesinthethree-dimensionalstructureofhumanvonWillebrandfactor.Blood.1996；88:2939-2950)。當vWF纖絲的一個末端被錨定于表面時，這也可在體內(nèi)發(fā)生。TTP患者的血栓由少量纖維蛋白和主要地vWF和血小板組成，這表明vWF-介導(dǎo)的血小板聚集為血栓形成的原因(AsadaY，SumiyoshiA，HayashiT,SuzumiyaJ，KaketaniK.Immunohistochemistryofvascularlesioninthromboticthrombocytopenicpurpura,withspecialreferencetofactorVIIIrelatedantigen.ThrombRes.1985；38:469-479)。具有復(fù)發(fā)性TTP的患者在血漿中具有超大多聚體。UL_vWF多聚體隨時間過去積累，因為抑制劑(抗-ADAMTS13Ab)的持續(xù)存在降低了ADAMTS13的活性。UL_vWF多聚體極度活躍并且因剪切應(yīng)力而展開，從而引起血小板聚集，這導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成(TsaiHM.VonWillebrandfactor,ADAMTS13,andthromboticthrombocytopenicpurpura.JMolMed.2002；80:639-647；TsaiHΜ.DeficiencyofADAMTS-13inthromboticandthrombocytopenicpurpura.JThrombHaemost.2003；1:2038-2040；discussion2040-2035)。據(jù)認為因ADAMTS13缺乏而導(dǎo)致的反應(yīng)過度UL-vWF多聚體在血漿中的存在可以與增加的患與冠狀動脈心臟病相關(guān)的動脈血栓形成的風險相關(guān)。由于ADAMTS蛋白牽涉許多疾病和病況，因此本領(lǐng)域存在對用于大規(guī)模生產(chǎn)具有高度特異性活性的重組ADAMTS蛋白的方法的需要，所述重組ADAMTS適合用于藥物配制和施用。本發(fā)明提供了滿足本領(lǐng)域內(nèi)的這些和其它需要的用于ADAMTS蛋白的產(chǎn)生和純化的方法。發(fā)明_既述在一個方面，本發(fā)明提供了表達具有血小板反應(yīng)蛋白模體(ADAMTS)蛋白的去融合素和金屬蛋白酶的方法。在某些實施方案中，本文中提供的方法有利地導(dǎo)致增加的表達水平和具有顯著提高的活性的ADAMTS蛋白的產(chǎn)生。這些改善的性質(zhì)在一個實例中可通過補充用于ADAMTS蛋白表達的具有升高的水平的不同成分例如鈣、鋅或煙酰胺(維生素B3)的培養(yǎng)基來實現(xiàn)。在優(yōu)選實施方案中，ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。在另一個方面，本發(fā)明涉及通過在分批、分批補料或連續(xù)細胞培養(yǎng)條件下于無動物蛋白質(zhì)并且化學(xué)成分確知的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有編碼ADAMTS蛋白的核酸的重組細胞來增加ADAMTS蛋白的表達和/或活性水平的方法。在某些實施方案中，此類方法包括使用可以以細胞懸浮液或細胞附著方式進行的分批細胞培養(yǎng)、分批補料細胞培養(yǎng)、灌注細胞培養(yǎng)或恒化細胞培養(yǎng)(chemostatcell-cultivation)。在優(yōu)選實施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。在另一個方面，本發(fā)明提供了在ADAMTS蛋白的純化過程中減少活性損失的量的方法。在某些實施方案中，所述方法包括用額外水平的鈣和/或鋅補充純化緩沖液。在具體的實施方案中，所述方法涉及在于純化過程中所使用的超濾和/或滲濾步驟中穩(wěn)定ADAMTS蛋白的活性。在優(yōu)選實施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。在另一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生用于藥物組合物的制備的具有增加的活性的ADAMTS蛋白的方法。在某些實施方案中，此類方法包括在適合于增加的具有增加的活性的ADAMTS蛋白的表達的條件下使用無動物蛋白質(zhì)和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在優(yōu)選實施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了對于具有高特異性活性的ADAMTS蛋白的表達是有用的無動物蛋白質(zhì)、無寡肽及化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在優(yōu)選實施方案中，所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13蛋白。附圖簡述圖1.在不同溫度和pH條件下于無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的CHO細胞中表達的重組人ADAMTS13的容積FRETS-VWF73生產(chǎn)率。不同細胞培養(yǎng)實驗的結(jié)果顯示為作為培養(yǎng)溫度和PH的函數(shù)的標準化容積ADAMTS13FRETS-VWF73生產(chǎn)率的(A)等值線圖(contourplot)禾口(B)等值面圖(surfaceplot!^presentation)。圖2.在不同溫度和pH條件下于無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的表達重組人ADAMTS13的CHO細胞的比活性水平(FRETS-VWF73/通過ELISA測定的抗原)。不同細胞培養(yǎng)實驗的結(jié)果顯示為作為培養(yǎng)溫度和PH的函數(shù)的比活性的㈧等值線圖和⑶面圖表示。發(fā)明詳述I.引言ADAMTS蛋白(S卩，ADAMTS-I至ADAMTS-20)是共有共同模塊結(jié)構(gòu)域組織的分泌性鋅金屬蛋白酶的家族(關(guān)于綜述，參見，F(xiàn)lanneryC.R.，F(xiàn)rontBiosci.2006Jan1；11544-69)0所有ADAMTS蛋白共有共同的核心結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其由如下部分組成信號肽、緊接其后的前結(jié)構(gòu)域、鋅依賴性金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域、去整合素樣結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和間隔區(qū)結(jié)構(gòu)域(ApteS.S.,JBiolChem.2009Nov13;284(46):31493-7)。此外，除ADAMTS-4外，它們都包含至少一個或更多個血小板反應(yīng)蛋白I型重復(fù)結(jié)構(gòu)域，并且許多ADAMTS蛋白包含一個或多個額外的輔助結(jié)構(gòu)域。值得注意地，已報導(dǎo)所有ADAMTS蛋白似乎包含至少一個鈣結(jié)合位點和至少一個位于金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的鋅結(jié)合位點(Andreini等人，J.ProteomeRes.,2005,4(3)，pp881-888)。已報導(dǎo)ADAMTS蛋白對于不同疾病和狀況的生物作用，所述疾病和狀況包括血管生成抑制、腎間質(zhì)纖維化、骨重建、卵巢濾泡生成、動脈粥樣硬化、泌尿生殖器發(fā)育和腫瘤生長/重塑(ADAMTS-I)；Ehler-Danlos綜合征7C型和Bovinedermatopraxis(ADAMTS-2)；關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化和肌腱病變(ADAMTS-4)；關(guān)節(jié)炎和膠質(zhì)母細胞瘤(ADAMTS-5)；關(guān)節(jié)炎(ADAMTS-7)；血管生成抑制、腦惡性腫瘤、關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化(ADAMTS-8)；關(guān)節(jié)炎(ADAMTS-9，-12)；血栓性血小板減少性紫癜(ADAMTS-13)；和抗血栓形成(Antithrombosis)/中風(ADAMTS18)(關(guān)于綜述，參見，Lin禾ΠLiu,OpenAccessRheumatologyResearchandReviews2009:1121-131)。重組ADAMTS13(Ai;3)先前已在哺乳動物細胞中表達，然而比活性視細胞培養(yǎng)條件而變化很大。已發(fā)現(xiàn)許多商購可得的培養(yǎng)基不足以用于表達具有高比活性(表示為通過FRETS-VWF73測定法測量的活性對通過ELISA測定的抗原含量的比率)的A13。在一個方面，本文中提供的方法基于幾個允許具有升高的總活性和比活性水平的A13的細胞培養(yǎng)表達的有利發(fā)現(xiàn)。本文中公開的研究顯示培養(yǎng)基中鈣的某些最小濃度，約0.5mM至約1.5mM,是活性A13表達所必需的。此外，發(fā)現(xiàn)通過用升高的水平的鋅補充培養(yǎng)基，所得的表達的A13蛋白具有更高的總活性和比活性。例如，在以2至3倍正常水平補充有額外鋅的培養(yǎng)物中，與在標準化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基例如基于DMEM/F12的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的濃度相比較，A13的比活性顯著增加。此外，可通過將煙酰胺(維生素B3)濃度從約aiig/L(如在基于標準DMEM/F12的培養(yǎng)基中)增加至約7mg/L來實現(xiàn)A13的比活性的額外增加。通過在補充有額外鈣、鋅和/或煙酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組CHO或HEK293細胞，可在重組人A13的大規(guī)模表達培養(yǎng)中獲得至少約500mU/ygUOOOmU/μg、達到約2000mU/μg的比活性。先前未曾報導(dǎo)重組產(chǎn)生的A13蛋白的這類比活性水平。有利地，在不含動物源性成分的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中獲得這類升高的A13活性水平，從而允許以適合用于生產(chǎn)藥物配制的蛋白質(zhì)的大規(guī)模一致且可重現(xiàn)地表達ADAMTS蛋白。此外，此類培養(yǎng)基甚至不含重組蛋白質(zhì)例如胰島素，從而導(dǎo)致可更安全用于藥物施用的制劑的制品。本公開內(nèi)容還提供了在標準超濾/滲濾和其它純化步驟過程中防止活性和比活性損失的方法。有利地，發(fā)現(xiàn)通過用額外的鈣和鋅補充用于滲濾的緩沖液，可獲得A13活性損失的顯著減少，如通過FRETS-VWF73測定測量的。因此，歸因于分泌的金屬蛋白酶的ADAMTS家族之間共有的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，由本發(fā)明提供的方法允許所有ADAMTS蛋白在細胞培養(yǎng)物中表達和從細胞培養(yǎng)基回收。II.定義如本文中所使用的，術(shù)語“維生素B3”、“煙酰胺”、“尼克酰胺(niacinamide)”、“尼克酸”和“煙酸(nicotinicacid)”可互換使用，意指維生素B3家族的任何成員。因此，該家族的任何成員可用于補充用于本發(fā)明的方法的培養(yǎng)基。如本文中所使用的，“ADAMTS蛋白”是指具有金屬蛋白酶的血小板反應(yīng)蛋白I型模體家族的去整合素和金屬蛋白酶的多肽。該家族的成員包括人蛋白ADAMTS1(NM_006988)、ADAMTS2(NM_014244；NM_021599)、ADAMTS3(NM_014243)、ADAMTS4(NM_005099)、ADAMTS5(NM_007038)、ADAMTS6(NM_014273)、ADAMTS7(NM_0142727)、ADAMTS8(NM_007037)、ADAMTS9(NM_182920；NM_182921；NM_020249)、ADAMTS10(NM_030957)、ADAMTS12(NM_030955)、ADAMTS13(NM_139025；NM_139026；NM_139027；NM_139028)、ADAMTS14(NM_139155；NM_080722)、ADAMTS15(NM_139055)、ADAMTS16(NM_139056)、ADAMTS17(NM_139057)、ADAMTS18(NM_199355；NM_139054)、ADAMTS19(NM_133638)禾口ADAMTS20(NM_025003、NM_175851)。ADAMTS蛋白包括全長蛋白質(zhì)和展示至少部分生物活性，例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的由全長蛋白質(zhì)顯示的活性，特別是由全長蛋白質(zhì)顯示的蛋白酶活性。在某些情況下，在體內(nèi)或體外例如通過酶促或化學(xué)方法翻譯后修飾ADAMTS蛋白。應(yīng)理解，本發(fā)明的ADAMTS蛋白包括選擇性剪接同種型、保守修飾的蛋白質(zhì)、大體上同一的蛋白質(zhì)、同源物等。在本發(fā)明的說明書中，ADAMTS蛋白包括來自例如哺乳動物例如靈長類動物、人、猴、兔、豬、嚙齒類動物、小鼠、大鼠、倉鼠、沙鼠、犬科動物、貓科動物的ADAMTS家族的任何成員及其生物活性衍生物。也包括具有活性的突變的和變異的ADAMTS蛋白，同樣地包括ADAMTS蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本發(fā)明的ADAMTS蛋白還可包含幫助純化、檢測或兩者的標簽。本文中描述的ADAMTS蛋白還可用治療性部分或適合于體外或體內(nèi)成像的部分進行修飾。如本文中所使用的，“ADAMTS13蛋白，，是指具有ADAMTS13活性，特別是在VWF的殘基Tyr-842與Met_843之間切割肽鍵的能力的任何蛋白質(zhì)或多肽。在示例性實施方案中，ADAMTS13蛋白是指包含與NP_620594(ADAMTS13同種型1，前蛋白原)的氨基酸序列或NP_620594(ADAMTS13同種型1，成熟多肽)的氨基酸75-1427高度相似的氨基酸序列的多肽。在另一個實施方案中，ADAMTS13蛋白是指包含與NP_620596(ADAMTS13同種型2，前蛋白原)的氨基酸序列或NP_620594(ADAMTS13同種型2，成熟多肽)的氨基酸75至1371高度相似的氨基酸序列的多肽。在另一個實施方案中，ADAMTS13蛋白包括與NP_620595(ADAMTS13同種型3，前蛋白原)的氨基酸序列或NP_620595(ADAMTS13同種型1，成熟多肽)的氨基酸75至1340高度相似的氨基酸序列的多肽。如本文中所使用的，ADAMTS13蛋白包括具有vWF切割活性的天然變體和具有vWF切割活性的人工結(jié)構(gòu)。如本發(fā)明中所使用的，ADAMTS13包括保留一定基本活性的任何天然變體、可選擇的序列、同種型或突變蛋白質(zhì)。人群體中發(fā)現(xiàn)的ADAMTS13突變的實例包括但不限于R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V、R1336W.已發(fā)現(xiàn)所述突變中的許多突變與血栓性血小板減少性紫癜(TTP)相關(guān)。ADAMTS13蛋白還包括包含翻譯后修飾的多肽。例如，已顯示ADAMTS13在殘基614、667和1；354上被N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)修飾，已預(yù)測殘基142、146、552、579、707、828和1235也可以該方式被修飾?？赏ㄟ^在哺乳動物細胞培養(yǎng)中表達來制備具有蛋白水解活性的重組ADAMTS13，如Plaimauer等人，(2002,Blood.15；100(10):3626-32)和US2005/0266528(為了所有目的將所述文獻和專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中所描述的。表達ADAMTS13的細胞的重組培養(yǎng)的方法公開于PlaimauerB,ScheiflingerF中。GeminHematol.2004Jan；41(1)對-33，為了所有目的將其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。如本文中所使用的，“一個ADAMTS活性單位”被定義為ImL混合的正常人血漿的活性的量，無論所使用的測定是什么。例如，當ADAMTS蛋白為ADAMTS13時，一個ADAMTS13FRETS-VWF73活性單位是切割與被ImL的混合正常人血漿切割的FRETS-VWF73底物的量相同的量的FRETS-VWF73底物所需的活性的量(Kokame等人，BrJHaematol.2005Apr；129(1):93-100)。方便地，ADAMTS13活性可通過功能測定法例如利用經(jīng)修飾的vonWillebrand因子肽作為ADAMTS13的底物的功能測定法來進行測定(Tripodi等人JThrombHaemost.2008Sep；6(9):15；34_41)。測定重組人ADAMTS13活性的優(yōu)選方法公開于Gerritsen等人(AssayofvonWillebrandfactor(vffF)-cleavingproteasebasedondecreasedcollagenbindingaffinityofdegradedvffF-.atoolforthediagnosisofthromboticthrombocytopenicpurpura(TTP).ThrombHaemost1999；82:1386-1389)12中。在一個實施方案中，為了被認為是上文中定義的ADAMTS13蛋白，多肽或蛋白質(zhì)必須具有至少的天然ADAMTS13的vWF切割活性。在其它實施方案中，ADAMTS13蛋白可包含至少10%的天然ADAMTS13的活性。在其它實施方案中，ADAMTS13蛋白可包含至少5%、10%、20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^；100%的天然ADAMTS13的活性。ADAMTS13蛋白的量也可通過例如使用Rieger等人Q006，ThrombHaemost.200695(2):212-20)中公開的ELISA法測量ADAMTS13抗原來進行測定。如本文中所使用的，“μg的ADAMTS13”或“μg的ADAMTS13抗原”意指提供與ImL的混合正常人血漿所提供的水平相同的可被ELISA測定檢測的蛋白質(zhì)水平的ADAMTS13的量。這基于ImL正常人血漿中存在lmgADAMTS13的公布的估計，從而是近似測量。如本文中所使用的，術(shù)語〃生物活性衍生物〃，當用于ADAMTS蛋白的背景中時，還包括通過重組DNA技術(shù)獲得的多肽。這可包括本領(lǐng)域已知的任何方法，所述方法用于(i)通過基因工程，例如通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄和/或DNA的擴增產(chǎn)生重組DNA，(ii)通過轉(zhuǎn)染，即，通過電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核或真核細胞，(iii)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細胞，例如以連續(xù)或分批式方式，(iv)表達ADAMTS蛋白，例如組成型地或當誘導(dǎo)時，和(ν)分離所述ADAMTS蛋白，例如從培養(yǎng)基或通過收獲轉(zhuǎn)化的細胞，以(vi)獲得大體上純化的重組ADAMTS蛋白，例如通過離子交換層析、大小排阻層析、親和層析、疏水作用層析等。術(shù)語"生物活性衍生物"還包括嵌合分子，例如與第二多肽例如免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域或白蛋白結(jié)構(gòu)域組合(以改善生物學(xué)/藥理學(xué)性質(zhì)例如ADAMTS蛋白在哺乳動物(特別是人)的循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期)的ADAMTS蛋白或其功能片段。如本文中所使用的，術(shù)語“超濾”包括多種其中流體靜力壓迫使液體透過半透膜的膜過濾法。高分子量的懸浮的固體和溶質(zhì)得到保留，然而水和低分子量溶質(zhì)通過膜。該分離法通常用于純化和濃縮大分子(IO3-IOfiDa)溶液，特別是蛋白質(zhì)溶液。取決于它們保留的分子的大小，許多超濾膜是可獲得的。超濾的特征通常在于2nm至0.05μM的膜孔大小和1至10巴的操作壓力，并且特別地用于將膠體樣蛋白質(zhì)與小分子如糖和鹽分離。相反地，納米過濾是另一種壓力驅(qū)動的過濾法，特征通常在于0.5至2nm的膜孔大小和5至40巴的操作壓力。納米過濾通常用于在一個方面實現(xiàn)糖、其它有機分子與多價鹽之間的分離以及在另一個方面單價鹽與水之間的分離。通常，可以以死端式過濾模式或正切流動過濾(TFF)模式進行超濾。如本文中所使用的，術(shù)語“滲濾”是指另一種膜過濾法，有時稱為正切流動過濾(TFF)，其中沿著超濾膜的表面正切地泵動所述液體。通常，在通過膜后用滲濾緩沖液稀釋滲余物液體，隨后將其在返回連續(xù)流動過程中返回至膜。通常，可以以死端式過濾模式或正切流動過濾(TFF)模式進行滲濾。這樣，可將單個系統(tǒng)用于超濾和滲濾操作例如，以首先使用超濾濃縮樣品，然后通過滲濾進行緩沖液更換。如本文中所使用的，術(shù)語"多胺"是指一組由碳、氮和氫組成并且包含兩個或更多個氨基的有機化合物中的任何有機化合物。例如，所述術(shù)語包括選自尸胺、腐胺、胍丁胺、鳥氨酸、精胺和精脒的分子。在用于ADAMTS蛋白的表達的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(chemicallydefinedculturemedium)的某些實施方案中，存在于培養(yǎng)基中的多胺的濃度在約0.5mg/L至約30mg/L,或約0.5mg/L至約20mg/L、或約0.5mg/L至約10mg/L、或約lmg/L至約10mg/L、或約2mg/L至約10mg/L、或約2mg/L至約8mg/L、或約2mg/L至約5mg/L的范圍內(nèi)。在一個具體的實施方案中，多胺為濃度約2mg/L至約8mg/L的腐胺。如本文中所使用的，術(shù)語“化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基”是指其中所有成分的身份和濃度都是已知的合成生長培養(yǎng)基?；瘜W(xué)成分確定的培養(yǎng)基不包含細菌、酵母、動物或植物提取物，雖然它們可以包括或不包括個別植物或動物源性成分(例如，蛋白質(zhì)、多肽等)。商購可得化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的非限定性實例包括不同的EX-CELL培養(yǎng)基(SAFCBiosciences,Inc)、不同的達爾伯克改良伊格爾(DME)培養(yǎng)基(Sigma-AldrichCo；SAFCBiosciences,Inc)、Ham’s營養(yǎng)培養(yǎng)基(Sigma-AldrichCo；SAFCBiosciences,Inc)等。制備化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的方法在本領(lǐng)域中，例如在第6，171，825和6，936，441號美國專利、WO2007/077217以及第2008/0009040和2007/0212770號專利申請公布(為了所有目的將所述專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中是已知的。如本文中所使用的，術(shù)語“不含寡肽的培養(yǎng)基”是指不包含寡肽例如衍生自蛋白質(zhì)水解物的寡肽的不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，培養(yǎng)基不包含具有20或更多個氨基酸的寡肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，培養(yǎng)基不包含具有15或更多個氨基酸的寡肽。在本發(fā)明的另一個實施方案中，培養(yǎng)基不包含具有10個或更多個氨基酸的寡肽。在一個實施方案中，培養(yǎng)基不包含具有7個或更多個氨基酸的寡肽。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基不包含具有5個或更多個氨基酸的寡肽。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基不包含具有3個或更多個氨基酸的寡肽。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，培養(yǎng)基不包含具有2個或更多個氨基酸的寡肽。制備不含寡肽的培養(yǎng)基的方法在本領(lǐng)域中，例如在第6，171，825和6，936，441號美國專利、WO2007/077217以及第2008/0009040號和第2007/0212770號美國專利申請公布(為了所有目的將所述專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中是已知的。如本文中所使用的，術(shù)語“無血清培養(yǎng)基”是指未補充有動物血清的培養(yǎng)基。雖然許多時候無血清培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，但無血清培養(yǎng)基可補充有分離的動物或植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)級分。制備無血清培養(yǎng)基的方法在本領(lǐng)域中，例如在第6，171，825和6，936，441號美國專利、WO2007/077217以及第2008/0009040號和第2007/0212770號美國專利申請公布(為了所有目的將所述專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中是已知的。如本文中所使用的，術(shù)語“無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基”是指未補充有動物血清、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)級分的培養(yǎng)基。雖然許多時候無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，但無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基可包含植物或酵母水解物。制備無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基的方法在本領(lǐng)域中，例如在第6，171，825和6，936，441號美國專利、WO2007/077217以及第2008/0009040號和第2007/0212770號美國專利申請公布(為了所有目的將所述專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中是已知的?！氨磉_載體”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體，其具有一系列允許特定核酸在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的特定核酸元件。表達載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表達載體包括有效地連接于啟動子的待轉(zhuǎn)錄的核酸。當術(shù)語“異源”，當用于指核酸的部分時，表示所述核酸包含在自然界中未以相同的彼此關(guān)系被發(fā)現(xiàn)的兩個或更多個子序列。例如，所述核酸通常是重組產(chǎn)生的，具有兩個或更多個來自無關(guān)基因的序列(它們經(jīng)排列產(chǎn)生新型功能核酸)，例如來自一個來源的啟動子和來自另一個來源的編碼區(qū)。類似地，異源蛋白質(zhì)表示所述蛋白質(zhì)包含在自然界中未以相同的彼此關(guān)系被發(fā)現(xiàn)的兩個或更多個子序列(例如，融合蛋白)?！皢幼印北欢x為一系列指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列。如本文中所使用的，啟動子包括轉(zhuǎn)錄起始位點附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型啟動子的情況下，TATA元件。啟動子還任選地包括遠端增強子或阻遏子元件，其可位于遠離轉(zhuǎn)錄起始位點多達數(shù)千堿基對?！敖M成型”啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下具有活性的啟動子?！罢T導(dǎo)型”啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下具有活性的啟動子。術(shù)語“有效連接的”是指核酸表達控制序列(例如啟動子或一系列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點)與第二核酸序列之間的功能連接，其中所述表達控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于所述第二序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。如本文中所使用的，術(shù)語"約"是指與指定值相差正或負10%的大致范圍。例如，語言〃約20%"包括18-22%的范圍。III.ADAMTS蛋白表達在一個方面，本發(fā)明提供了表達具有高比活性的具有血小板反應(yīng)蛋白模體(ADAMTS)蛋白的去整合素和金屬蛋白酶的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在補充有至少一種選自鈣、鋅和煙酰胺(維生素似)的成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有編碼ADAMTS蛋白的核酸的細胞。在具體的實施方案中，在補充有至少兩種選自鈣、鋅和煙酰胺(維生素B3)的成分的培養(yǎng)基中表達ADAMTS蛋白。在另一個實施方案中，所述培養(yǎng)基補充有鈣、鋅和煙酰胺(維生素B3)。在某些實施方案中，用于表達ADAMTS蛋白的培養(yǎng)基可包括無動物蛋白質(zhì)、無寡肽或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在一個方面，提供了用于產(chǎn)生ADAMTS蛋白的方法。在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟在補充有鋅、鈣和煙酰胺的至少一種的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有編碼ADAMTS蛋白的核酸的細胞；從培養(yǎng)物中取出一部分上清液；進行離心或過濾步驟以除去任何殘留細胞；進行超濾步驟以濃縮ADAMTS蛋白；和利用包含至少鈣或鋅的緩沖液進行滲濾步驟。在某些實施方案中，鈣的濃度可以為至少約0.lmM、0.3mM、0.5mM、0.75mM、lmM、l.5mM、2mM、3mM、5mM或超過5mM鈣。在其它實施方案中，鋅的濃度可以為至少約0.5μM、1μΜ、2μM、3μΜ、5μΜ、10μM或超過10μM的鋅。在某些實施方案中，收獲物，無細胞上清液或滲濾緩沖液包含上述濃度的鈣和鋅的組合。在某些實施方案中，超濾和/或滲濾膜的截斷值可以為例如約150kD或125kD或IOOkD或75kD或50kD或30kD或IOkD或小于10kD。在某些實施方案中，ADAMTS蛋白為ADAMTS13或其生物活性衍生物。在具體的實施方案中，ADAMTS13蛋白是人ADAMTS13蛋白或其生物活性衍生物。在某些實施方案中，用于所述方法的培養(yǎng)基可以是無動物蛋白質(zhì)、無寡肽或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在一個實施方案，所述方法還包括選自離子交換層析、大小排阻層析、親和層析和疏水相互作用層析的純化步驟。在另一個實施方案中，鋅的補充可通過添加含鋅蛋白質(zhì)或多肽制劑來提供。例如，常用胰島素制劑以使利用約lmg/L至約10mg/L胰島素的培養(yǎng)基補充也可導(dǎo)致約0.03μM至約1.511|1的鋅的補充(如根據(jù)關(guān)于似￥01^1NInnoLetSubQ，重組人胰島素的詳細專題論文計算的，這可見Medscape服務(wù)器)的濃度包含鋅。因此，在一個實施方案中，用于表達ADAMTS蛋白的培養(yǎng)基可補充含鋅胰島素制劑。被選擇用于培養(yǎng)宿主細胞系的本文中公開的補充有鋅、鈣和/或煙酸(維生素B3)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對于本發(fā)明不是至關(guān)重要的并且可以是本領(lǐng)域已知的適合用于培養(yǎng)哺乳動物細胞的那些培養(yǎng)基之任一或組合。培養(yǎng)基例如達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基、Ham'sF-12培養(yǎng)基、伊格爾最低必需培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基等是商購可得的。生長因子例如重組胰島素的添加是任選的。在一個實施方案中，用于培養(yǎng)表達ADAMTS蛋白(例如，ADAMTS13)的細胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可包含一種或多種商購可得的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基例如達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)和Ham'sF-12培養(yǎng)基的混合物，所述培養(yǎng)基補充有除鋅、鈣和煙酰胺(維生素B3)外的一種或多種成分?？捎糜谘a充商購可得的培養(yǎng)基的成分的非限定性實例包括必需氨基酸(例如，谷氨酰胺)、非離子型表面活性劑(例如，Synperonic)、伯胺(例如，乙醇胺)、聚胺(例如，腐胺)、痕量金屬(例如，鐵)和緩沖劑(例如，碳酸氫鈉)。在具體實施方案中，所述培養(yǎng)基是表1提供的BCS培養(yǎng)基。在另一個具體實施方案中，所述培養(yǎng)基是BACD培養(yǎng)基，例如BACD-A13培養(yǎng)基。表1.細胞培養(yǎng)基BCS的組成.權(quán)利要求1.一種用于表達具有血小板反應(yīng)蛋白模體(ADAMTS)蛋白的去整合素和金屬蛋白酶的方法，所述方法包括在包含至少約2μM的濃度的鋅或至少約0.5mM的濃度的鈣的至少一種的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有編碼ADAMTS蛋白的核酸的細胞。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少約2μM的鋅。3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約2μM至約12μM的鋅。4.權(quán)利要求1至3的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少約5μM的鋅。5.權(quán)利要求1至4的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約5μM至約12μM的鋅。6.權(quán)利要求1至5的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少約0.5mM的鈣。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約0.5mM至約1.5mM的鈣。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少約2μM的鋅和至少約0.5mM的鈣。9.權(quán)利要求1至8的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含至少約ang/L的煙酰胺(維生素B3)。10.權(quán)利要求1至9的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含至少約7mg/L的煙酰胺(維生素B3)。11.權(quán)利要求1至10的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約ang/L至約10mg/L的煙酰胺(維生素B3)。12.權(quán)利要求1至11的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含至少約0.5mg/L的多胺。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述多胺是腐胺。14.權(quán)利要求13所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含約2mg/L至約8mg/L的腐胺。15.權(quán)利要求1至14的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基不含動物蛋白質(zhì)。16.權(quán)利要求1至15的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的。17.權(quán)利要求1至16的任一項所述的方法，其中所述細胞選自細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、鳥類細胞和哺乳動物細胞。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是選自人細胞系、倉鼠細胞系和鼠細胞系的細胞系。19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述細胞系選自CHO細胞系、BHK細胞系和HEK細胞系。20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述細胞系是CHO細胞系。21.權(quán)利要求1至20的任一項所述的方法，其中所述編碼ADAMTS蛋白的核酸還包含誘導(dǎo)型啟動子。22.權(quán)利要求1至21的任一項所述的方法，其中所述方法包括分批細胞培養(yǎng)。23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分批細胞培養(yǎng)是重復(fù)分批細胞培養(yǎng)。24.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述分批細胞培養(yǎng)是分批補料細胞培養(yǎng)。25.權(quán)利要求1至21和23的任一項所述的方法，其中所述方法包括連續(xù)細胞培養(yǎng)。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述連續(xù)細胞培養(yǎng)包括連續(xù)懸浮細胞培養(yǎng)。27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述連續(xù)細胞培養(yǎng)包括連續(xù)附著細胞培養(yǎng)。28.權(quán)利要求沈所述的方法，其中以恒化模式進行所述培養(yǎng)。29.權(quán)利要求沈或27所述的方法，其中以灌注模式進行所述培養(yǎng)。30.權(quán)利要求27或四所述的方法，其中將微載體用于培養(yǎng)細胞。31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述微載體是多孔微載體。32.權(quán)利要求23和25至31的任一項所述的方法，其中將所述培養(yǎng)物維持至少7天。33.權(quán)利要求32所述的方法，其中將所述培養(yǎng)物維持至少一個月。34.權(quán)利要求33所述的方法，其中將培養(yǎng)物維持至少2個月。35.權(quán)利要求1至34的任一項所述的方法，其中將所述培養(yǎng)物維持在約35°C至約37°C的溫度下。36.權(quán)利要求1至35的任一項所述的方法，其中將所述培養(yǎng)物維持在約6.9至約7.3的PH下。37.權(quán)利要求36所述的方法，其中將所述培養(yǎng)物維持在約7.05至約7.15的pH下。38.權(quán)利要求1至37的任一項所述的方法，其中所述ADAMTS蛋白為ADAMTS13。39.權(quán)利要求38所述的方法，其中培養(yǎng)基中ADAMTS13蛋白的比活性為至少約600U/mgADAMTS13蛋白。40.權(quán)利要求39所述的方法，其中培養(yǎng)基中ADAMTS13蛋白的比活性為至少約800U/mgADAMTS13蛋白。41.權(quán)利要求38至40的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)物產(chǎn)生至少約400U的ADAMTS13活性/L培養(yǎng)物/天(U/L/D)。42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述培養(yǎng)物產(chǎn)生至少約800U的ADAMTS13活性/L培養(yǎng)物/天(U/L/D)。43.一種用于產(chǎn)生ADAMTS組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)在無動物蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有編碼ADAMTS蛋白的核酸的細胞；(b)從培養(yǎng)物中取出一部分上清液；(c)進行過濾或離心步驟以除去任何殘留細胞；(d)進行超濾步驟以濃縮ADAMTS蛋白；和(e)利用包含至少約0.5μM的鋅以及至少約0.ImM的鈣的緩沖液進行滲濾步驟；由此制備ADAMTS組合物。44.權(quán)利要求43所述的方法，其中培養(yǎng)細胞的步驟包括分批細胞培養(yǎng)。45.權(quán)利要求43所述的方法，其中培養(yǎng)細胞的步驟包括連續(xù)細胞培養(yǎng)。46.權(quán)利要求43至45的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含鈣。47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少0.5mM的鈣。48.權(quán)利要求43至47的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含鋅。49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少2μM的鋅。50.權(quán)利要求43至49的任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含煙酰胺(維生素Β3)。51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少ang/L的煙酰胺(維生素B3)。52.權(quán)利要求43至51的任一項所述的方法，其中所述滲濾緩沖液包含至少約5μM的鋅以及至少約2mM的鈣。53.權(quán)利要求43至52的任一項所述的方法，其中所述ADAMTS蛋白是ADAMTS13。54.權(quán)利要求43至53的任一項所述的方法，其中在步驟(c)結(jié)束至步驟(e)結(jié)束之間損失低于約20%的ADAMTS13比活性。55.權(quán)利要求M所述的方法，其中在步驟(c)結(jié)束至步驟(e)結(jié)束之間損失低于約10%的ADAMTS13比活性。56.權(quán)利要求43至55的任一項所述的方法，其中所述ADAMTS13組合物具有至少約1000U/mg的比活性。57.權(quán)利要求56所述的方法，其中所述ADAMTS13組合物具有至少約1500U/mg的比活性。58.一種利用方法制備的ADAMTS蛋白組合物，所述方法包括根據(jù)權(quán)利要求1至42的任一項所述的方法在細胞培養(yǎng)物中表達ADAMTS蛋白。59.一種利用權(quán)利要求43至57的任一項所述的方法制備的ADAMTS蛋白組合物。全文摘要本發(fā)明提供了用于表達ADAMTS蛋白例如ADAMTS13的培養(yǎng)基。還提供了用于表達和純化ADAMTS蛋白的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法對于表達具有高比活性的ADAMTS蛋白是有用的。還提供了具有高比活性的ADAMTS例如ADAMTS13的蛋白質(zhì)組合物，所述蛋白質(zhì)組合物根據(jù)本文中提供的方法被表達和純化。文檔編號C12N9/64GK102549145SQ201080042028公開日2012年7月4日申請日期2010年7月30日優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日發(fā)明者A·施彭格,L·格里爾伯格爾,M·哈斯拉赫爾,M·賴特爾,R·格里爾伯格爾申請人:巴克斯特保健股份有限公司,巴克斯特國際公司