膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)，包括：用于感染膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體，所述病毒載體中包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR；病毒載體導(dǎo)入裝置，用于所述病毒載體導(dǎo)入到所述膠質(zhì)細(xì)胞中；激光刺激裝置，用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將所述特定波長(zhǎng)的光線傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)通過(guò)病毒載體刺激感染膠質(zhì)細(xì)胞，接著通過(guò)激光刺激裝置產(chǎn)生的特定波長(zhǎng)的光線刺激感染了病毒載體的膠質(zhì)細(xì)胞，從而特異性的刺激膠質(zhì)細(xì)胞提高bFGF表達(dá)。本發(fā)明還提供了一種上述膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，并公開其應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生長(zhǎng)因子調(diào)控【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及ー種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中ー類重要的細(xì)胞類型，膠質(zhì)細(xì)胞的功能對(duì)于神經(jīng)元正常代謝的運(yùn)轉(zhuǎn)，突觸可塑性的維持和腦內(nèi)微血管血流的控制都發(fā)揮重要作用。膠質(zhì)細(xì)胞的重要功能同釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和各類生長(zhǎng)因子密切相關(guān)，膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌ATP，絲氨酸和谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)還可以分泌bFGF，BDNF(腦相關(guān)生長(zhǎng)因子)，NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)等生長(zhǎng)因子。
[0003]喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF),是一種重要的生長(zhǎng)因子，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、増殖和代謝維持中發(fā)揮重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，bFGF主要由膠質(zhì)細(xì)胞合成和釋放，對(duì)于神經(jīng)元的正常發(fā)育和維持正常生理功能都發(fā)揮重要作用。bFGF合成和釋放同多種神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病相關(guān)，以嚴(yán)重影響人類健康的帕金森氏病為例，黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元的功能受bFGF的精細(xì)調(diào)節(jié)，bFGF不僅能維持多巴胺能神經(jīng)元在胚胎發(fā)育階段的正常發(fā)育，還可以對(duì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)作用，提高bFGF的在體水平對(duì)于治療帕金森氏病具有重要的預(yù)防和治療意義。
[0004]傳統(tǒng)的提高膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)的方法多通過(guò)藥物刺激膠質(zhì)細(xì)胞的方法進(jìn)行，通過(guò)激活膠質(zhì)細(xì)胞上的多巴胺能受體和內(nèi)部的分子通路來(lái)促使膠質(zhì)細(xì)胞釋放bFGF，但該方法特異性低，在影響膠質(zhì)細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)干預(yù)神經(jīng)元或其他細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]基于此，有必要提供一種特異性提高bFGF表達(dá)的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0006]ー種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)，包括:
[0007]用于感染膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體，所述病毒載體中包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR ；
[0008]病毒載體導(dǎo)入裝置，用于所述病毒載體導(dǎo)入到所述膠質(zhì)細(xì)胞中；
[0009]激光刺激裝置，用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將所述特定波長(zhǎng)的光線傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。
[0010]在一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子為CMV，所述光敏基因?yàn)镃hETA，綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)?eYFP。
[0011 ] 在一個(gè)實(shí)施例中,所述病毒載體導(dǎo)入裝置為注射器。
[0012]在一個(gè)實(shí)施例中，所述激光刺激裝置包括激光發(fā)生器和光纖，所述激光發(fā)生器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光，所述光纖用于將所述激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。[0013]ー種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0014]將包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR的融合質(zhì)粒以及與慢病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒pCMV A R8.74和pMD2.G.一起，用脂質(zhì)體一起轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中，然后將所述293FT細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，破碎細(xì)胞膜、過(guò)柱，取上清液，所述上清液中含有用于感染膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體，所述病毒載體中包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR ；
[0015]提供用于所述病毒載體導(dǎo)入到所述膠質(zhì)細(xì)胞中的病毒載體導(dǎo)入裝置；
[0016]提供用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將所述特定波長(zhǎng)的光線傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞的激光刺激裝置。
[0017]在一個(gè)實(shí)施例中，所述啟動(dòng)子為CMV，所述光敏基因?yàn)镃hETA，綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)?eYFP。
[0018]在一個(gè)實(shí)施例中，所述病毒載體導(dǎo)入裝置為注射器。
[0019]在一個(gè)實(shí)施例中，所述激光刺激裝置包括激光發(fā)生器和光纖，所述激光發(fā)生器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光，所述光纖用于將所述激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。
[0020]ー種上述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)在治療帕金森癥、癲癇、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙、中風(fēng)或抑郁癥中的應(yīng)用。
[0021]這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)通過(guò)病毒載體刺激感染膠質(zhì)細(xì)胞，接著通過(guò)激光刺激裝置產(chǎn)生的特定波長(zhǎng)的光線刺激感染了病毒載體的膠質(zhì)細(xì)胞，從而特異性的刺激膠質(zhì)細(xì)胞提高bFGF表達(dá)。這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)用于提高膠質(zhì)細(xì)胞的bFGF表達(dá)，相對(duì)于傳統(tǒng)的提高膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)的方法，特異性較高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為病毒載體感染離體小鼠膠質(zhì)細(xì)胞48hr后的明場(chǎng)照片(BF)和熒光(FL)照片對(duì)比圖；
[0023]圖2為采用激光刺激裝置對(duì)實(shí)施例1得到的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光刺激，得到的刺激電流和內(nèi)向光電流的對(duì)比圖；
[0024]圖3為通過(guò)免疫熒光共定位的方法確定膠質(zhì)細(xì)胞在體特異性表達(dá)光感基因得到的eYFP和ChETA的表達(dá)對(duì)比圖；
[0025]圖4為通過(guò)藍(lán)光刺激在體膠質(zhì)細(xì)胞三周后，取出紋狀體的組織進(jìn)行勻漿，ELISA后得到的bFGF表達(dá)對(duì)比圖；
[0026]圖5為通過(guò)免疫熒光的方法對(duì)TH進(jìn)行染色，評(píng)估多巴胺能神經(jīng)元在bFGF作用下的數(shù)量變化，得到的對(duì)比圖；
[0027]圖6為將神經(jīng)干細(xì)胞移植入受損的紋狀體部位，然后進(jìn)行藍(lán)光刺激，3周之后檢測(cè)其表達(dá)多巴胺能分子標(biāo)記物的情況得到的對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
[0029]—實(shí)施方式的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng),包括用于病毒載體、病毒載體導(dǎo)入裝置和激光刺激裝置。
[0030]病毒載體用于感染膠質(zhì)細(xì)胞，病毒載體中包括依次連接的ITR (invertedterminal repeat，反向終端重復(fù)序列)、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR。
[0031]本實(shí)施方式中，啟動(dòng)子為CMV，光敏基因?yàn)镃hETA，綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)閑YFP。
[0032]本實(shí)施方式中，病毒載體為慢病毒載體。
[0033]光感基因調(diào)控技術(shù)是近幾年快速發(fā)展的ー種新興技術(shù)，其原理是基于基因治療的方法給哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)入不同的對(duì)光敏感的基因，通過(guò)不同波長(zhǎng)的光對(duì)特定細(xì)胞類型活性進(jìn)行調(diào)控。Channelrhodopsin-2 (ChR2)編碼陽(yáng)離子通道蛋白，493nm波長(zhǎng)的藍(lán)光光照后使陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞，而興奮細(xì)胞活性。
[0034]ChETA把ChR2的E123突變?yōu)樘K氨酸或丙氨酸，提高了對(duì)頻率較高的光照的敏感性和穩(wěn)定性。利用光感基因ChETA的電傳導(dǎo)性和快速動(dòng)力學(xué)特性，不僅可以實(shí)現(xiàn)通過(guò)光來(lái)誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，還可以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和突觸的傳遞性。
[0035]病毒載體導(dǎo)入裝置用于病毒載體導(dǎo)入到膠質(zhì)細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，病毒載體導(dǎo)入裝置為注射器。
[0036]激光刺激裝置用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將特定波長(zhǎng)的光線傳送到膠質(zhì)細(xì)胞。
[0037]激光刺激裝置包括激光發(fā)生器和光纖，激光發(fā)生器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光，光纖用于將激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光傳送到膠質(zhì)細(xì)胞。
[0038]上述膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0039]S10、將包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR的融合質(zhì)粒以及與慢病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒pCMV A R8.74和pMD2.G.一起，用脂質(zhì)體一起轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中，然后將293FT細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，破碎細(xì)胞膜、過(guò)柱，取上清液，上清液中含有用于感染膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體，病毒載體中包括依次連接的反向終端重復(fù)序列ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和反向終端重復(fù)序列ITR。
[0040]具體而言,將該轉(zhuǎn)染后的293FT細(xì)胞傳代至25代后即需要更換新的一批細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將培養(yǎng)293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液換成無(wú)血清含有5mM丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液后繼續(xù)孵育16小吋。
[0041]然后，用超速離心機(jī)對(duì)上述293FT細(xì)胞進(jìn)行破膜得到細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液通過(guò)20%的蔗糖濾柱，收集上清，得到含有攜帯光敏基因的病毒的細(xì)胞液。該病毒滴度能達(dá)3X IO8TUAiL以上，用滅菌的磷酸鹽緩沖液重懸含有攜帯光敏基因的病毒的細(xì)胞液得到重懸液，其中含有攜帯光敏基因的病毒的細(xì)胞液與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:1000。
[0042]本實(shí)施方式中，啟動(dòng)子為CMV，光敏基因?yàn)镃hETA，綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)閑YFP。
[0043]本實(shí)施方式中，包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR的融合質(zhì)粒通過(guò)如下步驟制備得到:將人源化CMV-ChETA密碼子(由Stanford大學(xué)KarlDeisseroth教授的實(shí)驗(yàn)室2007年饋贈(zèng)，GENE ID:3077445)通過(guò)Hindlll/BamHI酶切位點(diǎn)融入到開放型框架質(zhì)粒pCS2-eYFP-1TR(于2008年從Clotech公司購(gòu)得)的N末端。
[0044]構(gòu)建成功后的融合質(zhì)粒通過(guò)Qiagen公司的maxiprep試劑盒純化擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增的正向引物序列為SEQ ID N0.1所示的序列，反向引物序列為SEQ ID N0.2所示的序列，目標(biāo)產(chǎn)物的大小為3.6kb。
[0045]S20、提供用于病毒載體導(dǎo)入到膠質(zhì)細(xì)胞中的病毒載體導(dǎo)入裝置。
[0046]病毒載體導(dǎo)入裝置用于病毒載體導(dǎo)入到膠質(zhì)細(xì)胞中。在一個(gè)實(shí)施例中，病毒載體導(dǎo)入裝置為注射器。 [0047]S30、提供用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將特定波長(zhǎng)的光線傳送到膠質(zhì)細(xì)胞的激光刺激裝置。
[0048]激光刺激裝置用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將特定波長(zhǎng)的光線傳送到膠質(zhì)細(xì)胞。
[0049]激光刺激裝置包括激光發(fā)生器和光纖，激光發(fā)生器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光，光纖用于將激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光傳送到膠質(zhì)細(xì)胞。
[0050]這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)通過(guò)病毒載體刺激感染膠質(zhì)細(xì)胞，接著通過(guò)激光刺激裝置產(chǎn)生的特定波長(zhǎng)的光線刺激感染了病毒載體的膠質(zhì)細(xì)胞，從而特異性的刺激膠質(zhì)細(xì)胞提高bFGF表達(dá)。這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)用于提高膠質(zhì)細(xì)胞的bFGF表達(dá)，相對(duì)于傳統(tǒng)的提高膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)的方法，特異性較高。
[0051]這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)可以用于治療帕金森癥、癲癇、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙、中風(fēng)或抑郁癥。
[0052]下通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)這種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的作用進(jìn)行進(jìn)一歩的解釋和實(shí)驗(yàn)證明。
[0053]實(shí)施例1
[0054]病毒載體的構(gòu)建以及侵染體外膠質(zhì)細(xì)胞
[0055]將包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR的融合質(zhì)粒，和慢病毒包裝的質(zhì)粒pCMV A R8.74、pMD2.G.(1.5 g) 一起,利用脂質(zhì)體(Invitrogen公司產(chǎn)品)一起轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞(ATCC公司產(chǎn)品，該細(xì)胞傳代至25代后即需要更換新的ー批細(xì)胞株)中(每200，000個(gè)細(xì)胞用6mg/L脂質(zhì)體)，24hr后用含有5mM丙酮酸鈉的DMEM替代原293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，16小時(shí)后，利用超速離心機(jī)在50，OOOg速度下破膜，將懸液通過(guò)20%的蔗糖濾柱，收集上清。該病毒滴度能達(dá)3X 108TU/mL以上，產(chǎn)出的病毒顆粒以滅菌的磷酸鹽緩沖液以1:1000的體積比進(jìn)行重懸。將獲取的病毒按1:400的體積比混入無(wú)血清DMEM中，用于感染目標(biāo)細(xì)胞:星型膠質(zhì)細(xì)胞；6小時(shí)后，將含病毒的培養(yǎng)液換成新鮮含有10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)-72小時(shí)；放到顯微鏡下觀察，如果80%左右的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的標(biāo)記蛋白，可初步證實(shí)轉(zhuǎn)染成功。
[0056]試驗(yàn)用的膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)自新生小鼠紋狀體的膠質(zhì)細(xì)胞，利用上述的攜帯光感基因的病毒載體感染膠質(zhì)細(xì)胞(感染濃度為1:500)，感染24hr后用含10%血清的培養(yǎng)基替代感染時(shí)的無(wú)血清培養(yǎng)基后繼續(xù)觀察，在48hr后的明場(chǎng)照片(BF)和熒光(FL)照片如圖1所示。
[0057]圖1中可以觀察到膠質(zhì)細(xì)胞有綠色熒光表達(dá)，提示光感基因標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞成功。
[0058]實(shí)施例2
[0059]以膜片鉗技術(shù)對(duì)紋狀體來(lái)源的膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的光敏通道蛋白的進(jìn)行功能驗(yàn)證。
[0060]采用激光刺激裝置對(duì)上述細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光刺激，這種系統(tǒng)在此刺激模式下，光強(qiáng)到
1.1mW左右，光刺激的相關(guān)參數(shù)為:10Hz，50ms。
[0061]以電壓鉗的形式記錄相關(guān)由光所誘發(fā)的內(nèi)向光電流，以確認(rèn)光敏型膠質(zhì)細(xì)胞被光特異性地改變了興奮性。
[0062] 得到的刺激電流和內(nèi)向光電流的對(duì)比圖為圖2，由圖2可以看出，藍(lán)光刺激膠質(zhì)細(xì)胞，單個(gè)脈沖刺激和連續(xù)光脈沖刺激可以誘發(fā)對(duì)應(yīng)的光電流。
[0063]實(shí)施例3
[0064]在體試驗(yàn)。
[0065]利用光基因載體對(duì)在體的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行感染，通過(guò)綠色熒光驗(yàn)證光基因?qū)δz質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記。
[0066]通過(guò)攜帶光感基因的病毒載體對(duì)小鼠的紋狀體部位進(jìn)行注射，病毒注射劑量為3微升，注射后首先通過(guò)免疫熒光共定位的方法確定膠質(zhì)細(xì)胞在體特異性表達(dá)光感基因，得到圖3。
[0067]由圖3可以看出，免疫熒光共定位表明在體膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物eYFP和光基因ChETA，表明光基因可以特異的標(biāo)記膠質(zhì)細(xì)胞。
[0068]光感基因小鼠紋狀體膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)I周后，在對(duì)應(yīng)位置植入直徑200 U m的光纖，光照的平均強(qiáng)度為10mW/mm2，然后通過(guò)藍(lán)光刺激在體膠質(zhì)細(xì)胞，每周照射3次，共持續(xù)三周，3周之后取出紋狀體的組織進(jìn)行勻漿，在此時(shí)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法對(duì)組織內(nèi)的堿性成纖維生長(zhǎng)因子進(jìn)行定量測(cè)量，得到圖4。
[0069]由圖4可以看出，在體攜帯光基因的膠質(zhì)細(xì)胞在光照后釋放bFGF顯著高于對(duì)照組和攜帯空殼病毒組。
[0070]通過(guò)MPTP的方法建立小鼠的帕金森氏病模型，在模型發(fā)病2周后，通過(guò)光調(diào)控的方法增加組織內(nèi)的bFGF因子的含量，然后通過(guò)免疫熒光的方法對(duì)酪氨酸羥化酶(TH)進(jìn)行染色，從而評(píng)估多巴胺能神經(jīng)元在bFGF作用下的數(shù)量變化，得到圖5。
[0071]從圖5中可以明顯看出攜帯光基因的光照組的多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量顯著高于對(duì)照組和空殼病毒組。在升高bFGF因子的作用下，多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多，提示bFGF對(duì)ro動(dòng)物模型的受損傷部位有一定的修復(fù)作用。
[0072]進(jìn)ー步評(píng)估bFGF在體水平升高后對(duì)干細(xì)胞修復(fù)I3D模型的影響，建立MPTP的小鼠的帕金森病模型，在體感染膠質(zhì)細(xì)胞2周后，將神經(jīng)干細(xì)胞移植入受損的紋狀體部位，然后進(jìn)行藍(lán)光刺激，每周刺激3次，刺激3周之后通過(guò)免疫熒光共定位的方法對(duì)移植入紋狀體的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行定位，同時(shí)檢測(cè)其表達(dá)多巴胺能分子標(biāo)記物(TH/DAT/Nurr)的情況，得到圖6。
[0073]從圖6中可以看出在干細(xì)胞移植模型中，攜帯光基因的光照組的干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的數(shù)量顯著高于對(duì)照組和空殼病毒組。
[0074]在bFGF升高的作用下，干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元的分化明顯增多，提示在體bFGF的升高可以提高干細(xì)胞對(duì)帕金森氏病的修復(fù)效果。
[0075]結(jié)合上述試驗(yàn)，可以得出如下結(jié)論。
[0076]1.紋狀體來(lái)源的膠質(zhì)細(xì)胞，且對(duì)光刺激的不同頻率做出--對(duì)應(yīng)的光電流；
[0077]i1.光特異性刺激在體膠質(zhì)細(xì)胞有效提高bFGF的釋放；
[0078]ii1.光特異性刺激膠質(zhì)細(xì)胞后，有效提高在體bFGF的水平和濃度，促進(jìn)局部多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量増加。
[0079]iv.光在動(dòng)物體內(nèi)特異性刺激膠質(zhì)細(xì)胞后，有效促進(jìn)移植干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元方向分化，并修復(fù)帕金森氏病中受損的神經(jīng)回路。
[0080]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)`范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.ー種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)，其特征在于，包括: 用于感染膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體，所述病毒載體中包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR ； 病毒載體導(dǎo)入裝置，用于所述病毒載體導(dǎo)入到所述膠質(zhì)細(xì)胞中； 激光刺激裝置，用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將所述特定波長(zhǎng)的光線傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)，其特征在干，所述啟動(dòng)子為CMV，所述光敏基因?yàn)镃hETA，綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)閑YFP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)，其特征在于，所述病毒載體導(dǎo)入裝置為注射器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)，其特征在于，所述激光刺激裝置包括激光發(fā)生器和光纖，所述激光發(fā)生器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光，所述光纖用于將所述激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。
5.ー種膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 將包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR的融合質(zhì)粒以及與慢病毒病毒包裝相關(guān)的混合質(zhì)粒pCMV AR8.74和pMD2.G.一起，用脂質(zhì)體一起轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中，然后將所述293FT細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，破碎細(xì)胞膜、過(guò)柱，取上清液，所述上清液中含有用于感染膠質(zhì)細(xì)胞的病毒載體，所述病毒載體中包括依次連接的ITR、啟動(dòng)子、光敏基因、綠色熒光標(biāo)記基因和ITR ； 提供用于所述病毒載體導(dǎo)入到所述膠質(zhì)細(xì)胞中的病毒載體導(dǎo)入裝置； 提供用于產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光線并將所述特定波長(zhǎng)的光線傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞的激光刺激裝置。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述啟動(dòng)子為CMV，所述光敏基因?yàn)镃hETA，綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)閑YFP。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述病毒載體導(dǎo)入裝置為注射器。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述激光刺激裝置包括激光發(fā)生器和光纖，所述激光發(fā)生器用于產(chǎn)生波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光，所述光纖用于將所述激光發(fā)生器產(chǎn)生的波長(zhǎng)為470nm的藍(lán)光傳送到所述膠質(zhì)細(xì)胞。
9.一種如權(quán)利要求1~4任ー項(xiàng)所述的膠質(zhì)細(xì)胞bFGF表達(dá)提高系統(tǒng)在治療帕金森癥、癲癇、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙、中風(fēng)或抑郁癥中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/89GK103555747SQ201310501115
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】楊帆, 屠潔, 劉運(yùn)輝, 王立平 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院