本發(fā)明涉及惡性腫瘤治療的技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及惡性膠質(zhì)瘤治療的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一類能夠封閉人類細(xì)胞缺氧反應(yīng)途徑的多肽在治療腫瘤，尤其是惡性膠質(zhì)瘤，更特定地是根據(jù)WHO2007病理分級為IV的惡性膠質(zhì)瘤，以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的高發(fā)病率和高致死率疾病。膠質(zhì)瘤(glioma)是由神經(jīng)外胚層分化而來的膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜等)引發(fā)的腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率位列第一。依據(jù)惡變細(xì)胞的來源類型不同，膠質(zhì)瘤可分為：星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞混合瘤三種。按組織學(xué)形態(tài)又可分為：核異質(zhì)型、有絲分裂型、微血管富集型以及壞死型4個等級。1級通常預(yù)后較好，可通過外科手術(shù)完全切除；2級病變加重，病灶開始向周圍播散，界限不清；3-4級屬惡性膠質(zhì)瘤，侵襲及增殖活躍，易轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。根據(jù)WHO2007年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，惡性膠質(zhì)瘤定義為高于或等于WHOIII級的膠質(zhì)細(xì)胞瘤，具體包括間變性星形細(xì)胞瘤(III級)、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(III級)、間變性少突星形細(xì)胞瘤(III級)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(IV級)、巨細(xì)胞膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(IV級)、嗅神經(jīng)母細(xì)胞瘤(IV級)和幕上原始神經(jīng)外胚葉腫瘤(IV級)等，其中前三者可統(tǒng)稱為“間變性膠質(zhì)瘤”。惡性膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約為5～8/10萬，約占所有膠質(zhì)細(xì)胞瘤的50％。在美國，每年新增病例有14000例，近20年來發(fā)病率呈上升趨勢。而且，因惡性膠質(zhì)瘤呈浸潤性無限制增生、與正常腦組織無明顯界限并富含血管，還具有高復(fù)發(fā)率和低治愈率。雖經(jīng)多年努力，其死亡率和致殘率仍很高，間變型星形細(xì)胞瘤的中位生存期為2～5年。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IV級惡性膠質(zhì)瘤，在所有類型的腦膠質(zhì)瘤中侵襲性最強(qiáng)、惡性程度最高，平均存活期僅12個月。
目前惡性膠質(zhì)瘤的治療已發(fā)展為手術(shù)、放療和化療聯(lián)合的綜合治療模 式。各治療方法在改善患者生存、提高患者生活質(zhì)量方面協(xié)同發(fā)揮作用，由于惡性膠質(zhì)瘤具有侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)，致使神經(jīng)外科手術(shù)無法完全切除，而后續(xù)進(jìn)行的放療和化療又難以徹底地消除殘存腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞最終引起腫瘤的復(fù)發(fā)，導(dǎo)致患者預(yù)后差，死亡率高。惡性膠質(zhì)瘤對傳統(tǒng)的放療和化療不敏感，即使經(jīng)過多年發(fā)展，目前治療效果仍并不能令人滿意。
有研究表明，膠質(zhì)瘤侵襲和復(fù)發(fā)均與某些基因或細(xì)胞因子過度表達(dá)有關(guān)，而myc和HIF就是近幾年來發(fā)現(xiàn)的一些調(diào)控基因。近年來低氧誘導(dǎo)因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展和預(yù)后中的作用受到關(guān)注。缺氧誘導(dǎo)因子是一類介導(dǎo)低氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，能激活許多缺氧相關(guān)基因的表達(dá)，是在缺氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵性物質(zhì)。大量資料顯示，HIFs與腫瘤行為的諸多重要方面均有關(guān)。首先，在實(shí)體瘤內(nèi)，很易觀察到HIFs的活化：其次，細(xì)胞培養(yǎng)時，HIFs可調(diào)控與腫瘤相關(guān)的基因的表達(dá)；第三，HIFs的失活對腫瘤模型的行為有重要作用。
現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)展了一些針對癌細(xì)胞增殖所涉及的特定基因的多肽或蛋白質(zhì)，如CN100484575C記載了7種多肽，其能夠特異性牢固地結(jié)合到myc家族基因的啟動子和其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的下游基因啟動子上，長久地關(guān)閉myc家族基因和相關(guān)下游基因，終止由于myc家族基因突變和相關(guān)基因變異引起的myc家族基因的過度表達(dá)，和/或終止myc家族基因調(diào)控的下游轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞生長因子基因的過度表達(dá)，從而長期關(guān)閉通過myc家族基因逃脫細(xì)胞增殖調(diào)控而因起的細(xì)胞惡性增殖途徑。CN100418574C記載了20多種肽，其能夠特異性牢固地結(jié)合到HIF-1α基因自身啟動子或其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動的超過40個下游基因啟動子上，所述分子可長久地關(guān)閉包括細(xì)胞糖酵解反應(yīng)和/或免疫發(fā)炎反應(yīng)和/或血管發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞缺氧反應(yīng)的分子途徑，從而長期關(guān)閉晚期癌癥細(xì)胞或者慢性炎癥細(xì)胞在缺氧條件下無控制增殖。
但是，膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素多步驟的復(fù)雜過程，包括癌基因的啟動，擴(kuò)增或過度表達(dá)以及抑癌基因的突變和缺失。近幾年來研究發(fā)現(xiàn)了一些對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展較為重要的相關(guān)基因，包括IMP3、ATX、EMP1、IDH1、myc、Micro-RNA7、PTEN、HIF、TIP30、p53等。一些基因本身與多種癌癥相關(guān)，例如myc基因在Burkitt淋巴瘤，非Burkitt淋巴瘤，乳腺癌，宮頸癌，前列腺癌，胃腸癌，骨肉瘤，黑素瘤，畸胎瘤，粒細(xì)胞和漿細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞白血病，惡性膠質(zhì)瘤，神經(jīng)母細(xì)胞瘤和小細(xì)胞肺癌，鼻咽癌惡性細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)，針對一種特定基因的藥物是否確實(shí)能夠具有治療發(fā)病機(jī)理 復(fù)雜的癌癥的作用，尚需要進(jìn)行不斷的探索和驗證。上述兩個專利CN100484575C和CN100418574C也僅僅是利用細(xì)胞或動物模型等驗證了在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等中的一定的作用。對于惡性膠質(zhì)瘤，其中所涉及的肽是否同樣能夠具有治療作用，并不能簡單推斷得到，尚需要對其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的狀況，尋找更具有針對性的治療膠質(zhì)瘤，尤其是惡性膠質(zhì)瘤，更具體地是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的藥物仍將是目前急需解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種治療膠質(zhì)瘤，尤其是是根據(jù)WHO2007病理分級為III和IV的惡性膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的藥物。
本發(fā)明以特異性封閉人類細(xì)胞缺氧反應(yīng)途徑的一系列多肽為研究對象，確定了其對腫瘤，尤其是惡性膠質(zhì)瘤，更特定地是根據(jù)WHO2007病理分級為III和IV的惡性膠質(zhì)瘤，更特定地是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療作用
因此，本發(fā)明提供：
結(jié)合HIF基因的多肽在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用；
其中所述腫瘤為膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；
其中所述多肽序列如SEQ ID NO.1-22所示。
上述的多肽可與藥學(xué)上可接受的載體混合，用于制備藥物或藥物組合物；其中所述藥物或藥物組合物可制備成栓劑、注射劑、吸入制劑或外用制劑。
在本發(fā)明的背景下，適宜的藥物制劑包括適于口服、鼻、局部(包括口腔或舌下)、非消化道(包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用的制劑，或用于通過吸入施用的制劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。制劑可以任選包裝在離散的劑量單位中。
適于非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其中任選地含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與預(yù)期接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其中含有懸浮劑和/或增稠劑。所述制劑可以提供為單位劑量或多次劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶；還可以在冷凍-干燥(凍干的)條件下保存，僅需要在即將使用前添加無菌液體載體例如鹽水、注射用水?；蛘?，可提供所述制劑用于連續(xù)輸注?？梢詮那笆龅臒o菌粉末、顆粒及片劑的類型制備即配即用的注射溶液和懸浮液。
吸入給藥時，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝或其它便利的氣溶膠噴 霧遞送裝置方便地遞送化合物。氣溶膠包裝可含有適宜的噴射劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體?；蛘?，通過吸入或吹入給藥時，化合物可以采取干粉組合物的形式，例如該化合物與適宜粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以提供為單位劑型，例如作為膠囊、凝膠或發(fā)泡包，借助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述粉末。其它的制劑包含可釋放治療劑的可植入裝置及粘性貼片。
需要時，可以采用適于活性成分緩釋的上述制劑。藥物組合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑和/或防腐劑。這些藥物分子能夠透過細(xì)胞膜，核膜，到達(dá)靶部位，因此，可以通過肌肉注射，靜脈注射，口服膠囊，靜脈輸液途徑及腫塊部位原位注射和皮膚滲透的方法給藥。給藥量根據(jù)病人的具體情況，例如體重，年齡，具體的疾病和病情，以及醫(yī)生的臨床經(jīng)驗來決定，但通常可以是0.01-20mg/天，可以分一次或多次給藥。
設(shè)計了如下用于人類惡性腫瘤治療的藥物多肽分子。藥物多肽分子和靶向位置見如下表1和序列表。
封閉HIF-1a和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的染色質(zhì)肽藥物氨基酸序列和靶位
分析表明，這些染色質(zhì)肽藥物分子對癌細(xì)胞的HIF-1α基因的封閉具有高度專一性。第一是很少正常細(xì)胞的HIF-1α基因被封閉，而癌細(xì)胞的等位基因能與這些染色質(zhì)肽特異結(jié)合，這可能是正常細(xì)胞的HIF-1α編碼基因區(qū)域的DNA處于高度凝縮狀態(tài)，不易與這些染色質(zhì)肽結(jié)合；而在惡性細(xì)胞，HIF-1α編碼基因被激活，處于舒展?fàn)顟B(tài)，易于和染色質(zhì)肽藥物分子結(jié)合。第二，在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HIF-1α網(wǎng)絡(luò)調(diào)控?zé)o關(guān)的DNA區(qū)域，沒有這些封閉劑的結(jié)合位點(diǎn)。這些染色質(zhì)肽能夠被用來同時封閉HIF-1α基因本身的轉(zhuǎn)錄和HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子所驅(qū)動的導(dǎo)致細(xì)胞缺氧反應(yīng)(糖酵解反應(yīng)，免疫炎癥反應(yīng)和血管新生反應(yīng))的超過40個功能基因的轉(zhuǎn)錄；從而關(guān)閉了癌細(xì)胞原位缺氧條件下的惡性增殖，通過炎癥反應(yīng)向鄰近組織侵潤和通過新生血管向全身轉(zhuǎn)移的HIF-1α途徑。重要的是，這些染色質(zhì)肽沒有直接封閉對身體許多組織更新增殖必需的至關(guān)重要的細(xì)胞增殖/Cycle蛋白質(zhì)活動瀑布，也沒有封閉啟動Cycle基因群轉(zhuǎn)錄的共同轉(zhuǎn)錄因子E2元件/E2F1轉(zhuǎn)錄因子；它只是關(guān)閉了癌細(xì)胞所單獨(dú)居住的低氧環(huán)境下細(xì)胞繼續(xù)增殖/侵潤/轉(zhuǎn)移途徑，因此，它對身體正常細(xì)胞無害而能夠特異選擇性地關(guān)閉腫瘤細(xì)胞惡性增殖/侵潤/轉(zhuǎn)移，能夠被開發(fā)成為對大多數(shù)組織類型癌癥的治本藥物。
基于此，我們對上述多肽是否能夠適用于治療惡性膠質(zhì)瘤，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和探索。
下面通過具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)一步描述，但本發(fā)明并不限于實(shí)施例所述的范圍。
實(shí)施例
多肽合成
通過固相肽合成技術(shù)(SPPS)合成序列表中SEQ ID NO.1-22的多肽，包括將用保護(hù)基保護(hù)的氨基酸分步添加到增長的寡肽鏈上，該寡肽鏈錨固于化學(xué)穩(wěn)定的顆粒上，以便能通過簡單過濾將合成的肽與試劑和溶劑分離，合成結(jié)束后，將鏈從載體上裂解下來，再進(jìn)行提純。
多肽藥效試驗
對癌細(xì)胞的抑制作用
細(xì)胞系和臨床材料
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U-87、A172，前沿淋巴結(jié)星細(xì)胞瘤細(xì)胞系SHG-44、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SW1783，星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞RA，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，肺癌細(xì)胞系NCI-H460、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7均通過商業(yè)途徑獲得，其在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，MD)保藏。所有這些細(xì)胞均在合適的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)，例如McCoys 5A(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于HCT116，培養(yǎng)基均添加了10％胎牛血清(Cansera Intemational Inc.，Ontario，Canada)和1％抗生素/抗真菌劑溶液(Sigma-Rich)。將細(xì)胞維持在37℃、5％CO2的加濕氣氛下。
將上述細(xì)胞按照標(biāo)準(zhǔn)流程培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入上述多肽(SEQ ID NO.1-22，分別簡稱為肽1-22)。其中每種多肽濃度為15μmol/L，對于每種細(xì)胞的每個多肽實(shí)驗組設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10分鐘。酶標(biāo)儀570nm測定吸光度。
細(xì)胞抑制率按下式計算：
細(xì)胞抑制率＝(空白對照組OD值-實(shí)驗組OD值)/空白對照組OD值×100％。具體結(jié)果如下：
結(jié)果表明，上述SEQ ID NO.1-22的多肽對各類細(xì)胞系的抑制作用分為四個層次，其中對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U-87、A172(IV級)的抑制作用顯著地高于其他癌細(xì)胞系，其次為前沿淋巴結(jié)星細(xì)胞瘤細(xì)胞系SHG-44、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SW1783(III級)，再者為星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞RA(II-III級)，最后為結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、肺癌細(xì)胞系NCI-H460和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7。這四個層次抑制率經(jīng)過t檢驗計算p值，相互之間均達(dá)到了顯著差異，前兩者p值＜0.001，第二和第三者之間p值＜0.005，第三和第四者之間p值＜0.01?？梢钥闯觯鲜鲭膶τ谀z質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出對其他類型腫瘤細(xì)胞的抑制，而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，對惡性程度最高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用顯著強(qiáng)于分組處于II-III級的細(xì)胞系。
另外，在這22個肽中，SEQ ID NO.1-4，12-22所示的多肽對各類腫瘤細(xì)胞系的抑制作用相類似，但顯著強(qiáng)于SEQ ID NO.5-11所示的多肽(p值＜0.01)。
隨后，以每種多肽濃度為7.5μmol/L進(jìn)行重復(fù)試驗，其結(jié)果整體上與上述濃度下進(jìn)行的試驗相一致，即抑制率達(dá)到濃度為15μmol/L時的大約60％。但令人驚奇的是，對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U-87、A172(IV級)，在多肽濃度為7.5μmol/L的情況下產(chǎn)生了與多肽濃度為15μmol/L比較接近的抑制率，SEQ ID NO.1-4，12-22多肽的抑制率達(dá)到62％以上，SEQ ID NO.5-11多 肽達(dá)到53％以上，而對于其他類型的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并不存在類似的情況。這表明，對于惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的抑制，加入的多肽濃度為對其他類型膠質(zhì)瘤細(xì)胞多肽濃度的一半時，仍能獲得幾乎相同的抑制作用。
另外，還以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的組合為例，在如上兩種總濃度下重復(fù)進(jìn)行了細(xì)胞抑制試驗(兩者濃度相同，總濃度同上)，結(jié)果表明組合肽的效果比單一肽明顯更優(yōu)，例如對于U-87，在7.5μM和15μM濃度時的抑制率，兩者分別為66％和80％，以及69％和84％。這表明，上述肽可以組合使用，并能獲得更優(yōu)的抑制效果。
動物用藥
材料方法與CN100418575C中所述建立乳腺腫瘤模型的實(shí)例類似，每組小鼠為5只。試驗用多肽(SEQ ID NO.1-22)，化學(xué)合成，純度98.5％。
將上述膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U-87，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SW1783，星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞RA，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7接種至裸鼠形成腫瘤。實(shí)驗用6-8周齡的BALB/c小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司)。對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，取對數(shù)生長期的上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞，每只裸鼠腦部接種6×105個細(xì)胞(分散于5μl PBS緩沖液中)，實(shí)驗前用8％的水合氯醛將裸鼠麻醉，置于腦立體定位儀固定，細(xì)胞接種于紋狀體右部(前囟前0.6mm，側(cè)1.8mm，深3mm)，根據(jù)WHO2007的病理分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗，分別獲得與上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞系對應(yīng)的處于IV級-II級的小鼠。分別在建模后第10，15，20和25天尾靜脈注射200μl生理鹽水(其中含有的各肽，單次給藥劑量為30μg/只和60μg/只)。
結(jié)果分析
SEQ ID NO.1-22肽藥物處理組的試驗鼠，對于60μg/只的用量，U-87建立的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫塊在第18-22天消失，SW1783建立的膠質(zhì)瘤腫塊在第23-27天消失，RA建立的膠質(zhì)瘤腫塊在第25-28天消失，乳腺腫瘤腫塊在用藥后第34-37天完全消失。對于30μg/只的用量，U-87建立的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫塊在第22-25天消失，SW1783建立的膠質(zhì)瘤腫塊在第31-35天消失，RA建立的膠質(zhì)瘤腫塊在第34-37天消失，乳腺腫瘤腫塊在用藥后第43-46天完全消失?？梢钥吹?，對于惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，即使在注射多肽的濃度存在一倍差異時，其腫瘤消失時間并無顯著區(qū)別，而這在其他類型膠質(zhì)瘤 中并非如此。而就膠質(zhì)瘤整體相對于乳腺腫瘤而言，上述多肽的治療結(jié)果前者明顯優(yōu)于后者。上述結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗的結(jié)果相一致。
對于U-87建立的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫塊，60μg/只的用量時，所有給藥治療組腫塊在給藥第7天開始萎縮，其中，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16多肽處理組消失最快，分別在第一次治療后第14天和第15天，腫塊完全消失。SEQ ID NO.1-4，12-22相比SEQ ID NO.5-11在使得腫塊消失的天數(shù)上有明顯優(yōu)勢，即為上述的平均18天和22天。30μg/只的用量時，所有給藥治療組腫塊在給藥第9天開始萎縮，其中，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16多肽處理組消失最快，分別在第一次治療后第18天和第19天，腫塊完全消失。SEQ ID NO.1-4，12-22相比SEQ ID NO.5-11在使得腫塊消失的天數(shù)上有明顯優(yōu)勢，即為上述的平均22天和25天。這兩組肽在其他腫瘤類型中的表現(xiàn)與在U-87建立的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中一致(具體數(shù)據(jù)如上所示)。
對于乳腺癌，60μg/只的用量時，所有給藥治療組腫塊在給藥第12天開始萎縮，其中SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16多肽處理組分別在第一次治療后第29天和第30天，腫塊完全消失。30μg/只的用量時，結(jié)果與60μg/只的用量時相對應(yīng)。
另外，還以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的組合為例，進(jìn)行了上述試驗。對于U-87建立的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫塊，總濃度60μg/只的用量時，兩個組合給藥治療組腫塊在給藥第5天開始萎縮，其中，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的組合處理組消失在所有處理組中最快，在第一次治療后第11天，腫塊完全消失。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的組合，在第一次治療后第13天，腫塊完全消失。30μg/只的用量時，兩個組合給藥治療組腫塊在給藥第7天開始萎縮，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的組合處理組消失在所有處理組中也是最快，在第一次治療后第16天，腫塊完全消失。SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的組合，在第一次治療后第18天，腫塊完全消失?？梢钥闯?，在組合使用上述多肽后，能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，獲得顯著更優(yōu)的治療效果。
動物安全性試驗
采用包含上述多肽的生理鹽水溶液。
安全試驗1
取健康20-25g的健康小白鼠，分組，每組24只，雌雄各12只。各組分別用上述多肽腹腔注射，濃度為0.4mg/ml的封閉劑生理鹽水溶液0.25ml，即0.1mg。對照組注射生理鹽水。在注射后7天內(nèi)，觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚、毛、自主神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、黏膜、眼睛、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的變化。并在48小時內(nèi)每小時測量肛溫一次。對照組注射生理鹽水。結(jié)果，48小時內(nèi)，體溫全部正常。用藥組和對照組各相觀察指標(biāo)都沒有異常變化。
安全試驗2
取1.3kg-1.5kg健康大白兔，分組，每組五只。腹腔注射濃度為1mg/ml的封閉劑生理鹽水溶液。注射劑量為0.1g/kg體重。對照組注射生理鹽水。90天內(nèi)每天一次，觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚、毛、自主神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)、黏膜、眼睛、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的變化。并在48小時內(nèi)每小時測量肛溫一次。對照組注射生理鹽水。用藥組和對照組各相觀察指標(biāo)都沒有異常變化。
以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書的內(nèi)容所作的等效變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。