一種機(jī)械法提取雞胚成肌細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的細(xì)胞提取方法，具體涉及的是一種雞胚成肌細(xì)胞的提取方法，包括如下步驟：第一步，雞胚滅菌，取胸大肌放入加D?Hank’s的培養(yǎng)皿中；第二步，修剪肌肉；第三步，用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌；第四步，過濾、離心；第五步，細(xì)胞鋪板，差速貼壁；第六步，消化獲得成肌細(xì)胞；第七步，計(jì)數(shù)、種板。本發(fā)明雞胚成肌細(xì)胞提取方法，即用機(jī)械振蕩法提取雞胚成肌細(xì)胞的技術(shù)，保證所提取成肌細(xì)胞的純度、數(shù)量、純度及活力均較其他方法高，為進(jìn)一步開展家禽肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)理實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種機(jī)械法提取雞胚成肌細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的細(xì)胞提取方法，具體的說，涉及的是一種雞胚成肌細(xì)胞的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肌肉組織中含有不同的細(xì)胞亞群，包括成肌細(xì)胞(Vanden et al.，2004)、肌衛(wèi)星細(xì)胞(Mauro et al., 1961)、多能性前體細(xì)胞(Jiang et al., 2002)、多潛能干細(xì)胞(Caseet al., 2005)等。肌源干細(xì)胞目前已被廣泛證明具有橫向分化潛能，能夠分化為3個(gè)胚層的組織細(xì)胞類型，包括(脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血細(xì)胞)(Sun et al., 2004；Hwang et al., 2004；Farace et al., 2004)。成肌細(xì)胞是主要的肌干細(xì)胞，是肌再生修復(fù)的主要種子細(xì)胞，起源于胚胎中胚層的干細(xì)胞。成肌細(xì)胞包括胚胎中的成肌細(xì)胞和成熟肌肉組織中的衛(wèi)星細(xì)胞，在成熟肌肉組織中，這些衛(wèi)星細(xì)胞位于肌膜與肌纖維基底膜之間。在肌肉胚胎發(fā)育過程中先由間充質(zhì)細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞，然后成肌細(xì)胞分裂、融合成多核肌纖維，從而形成肌小管(Ehrhardt et al., 2007)。成肌細(xì)胞具有與宿主肌肉細(xì)胞融合的能力，這也是其移植后的主要?dú)w宿，可以在肌纖維中長(zhǎng)期存活，有利于目的基因穩(wěn)定、持續(xù)地表達(dá)(Ehrhardt et al.，2007)。成肌細(xì)胞具有自我更新和促進(jìn)肌纖維再生的能力，是體外研究肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)理的理想載體。1961年至今，肌干細(xì)胞的研究已近半個(gè)世紀(jì)(Mauro et al., 1961 )，但是成肌細(xì)胞的分離與鑒定的方法仍然具有不確定性。
[0003]由于相關(guān)肌源干細(xì)胞的特異標(biāo)志還不清楚，所以目前主要是利用細(xì)胞的物理特性來進(jìn)行純化。目前常用的分離方法有組織塊貼壁、雙酶消化、差速貼壁、percoll分離等(李俊玲等，2007) ο由于分離方法與間充質(zhì)細(xì)胞分離方法類似，所以分離得到的細(xì)胞系中容易摻雜間充質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等(焦?jié)扇A等，2011)，且耗時(shí)長(zhǎng)，細(xì)胞得率和純度較低。
[0004]深入了解成肌細(xì)胞體外的分化過程，能相應(yīng)地調(diào)控對(duì)應(yīng)的體內(nèi)肌肉發(fā)育形成過程。有關(guān)家禽成肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性方面的研究國(guó)內(nèi)少有報(bào)道。因此，建立有效的分離、純化和培養(yǎng)方法，是成肌細(xì)胞應(yīng)用的前提條件。因此如何將成肌細(xì)胞高效分離，純度高，且價(jià)格低廉，易于推廣，對(duì)更深入研究家禽種質(zhì)資源特性與探究肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)理有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雞胚成肌細(xì)胞提取方法，即用機(jī)械振蕩法提取雞胚成肌細(xì)胞的技術(shù)，保證所提取成肌細(xì)胞的純度、數(shù)量、純度及活力均較其他方法高，為進(jìn)一步開展家禽肌肉發(fā)育調(diào)控機(jī)理實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，一種雞胚成肌細(xì)胞提取方法，包括如下步驟:
第一步，雞胚滅菌，取胸肌。
[0007]選取12胚齡發(fā)育良好的雞胚，用75%酒精噴灑雞胚蛋殼，用鑷子鈍頭輕輕敲破氣室后，再換用彎頭小鑷子輕輕將氣室處蛋殼捏走，掀走白膜，用彎頭小鑷子將雞胚取出放入超凈臺(tái)(放在紫外殺菌的濾紙上)，換用新的彎頭鑷子用鈍面將雞腹部皮膚抹去，將兩側(cè)胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌，放入已加D-Hank’s的培養(yǎng)皿中。
[0008]第二步，修剪肌肉
把剪下來的胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，用一個(gè)鑷子按住肌肉，另一個(gè)彎頭鑷子撕拉肌肉，使其破碎成糜散狀，再用彎頭剪刀剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將剪碎的胸大肌和細(xì)胞培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加細(xì)胞培養(yǎng)液至10ml。
[0009]第三步，用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌
用漩渦振蕩器(功率12W，振蕩頻率>2600次/分鐘)振蕩懸浮胸大肌，振蕩時(shí)間為I分鐘(期間振蕩1-2秒停止I秒)，靜置3分鐘后，用移液器收集上清細(xì)胞培養(yǎng)液(如此振蕩懸浮4至5次)。
[0010]第四步，過濾、離心
選用100目、400目和600目濾篩放置于直徑為1cm的培養(yǎng)皿上進(jìn)行過濾，將懸液倒入100目濾篩，去除肉糜和雜質(zhì)，之后將過濾后的細(xì)胞懸液再400目和600目逐級(jí)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液加入新離心管中，將過濾后的細(xì)胞懸液加入新離心管中，1200轉(zhuǎn)離心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重懸后再1000轉(zhuǎn)離心4min，吸掉上清，下層沉淀即為細(xì)胞。
[0011]第五步，細(xì)胞鋪板，差速貼壁
在所得細(xì)胞的離心管中加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打重懸，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以免損傷細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入直徑為1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1ml后放入培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。40分鐘后將細(xì)胞培養(yǎng)液移入新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，如此差速貼壁2次后，隔夜培養(yǎng)。
[0012]第六步，消化獲得成肌細(xì)胞
第二天早上，將培養(yǎng)皿中的上層細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，在培養(yǎng)皿表面加入2ml胰酶，I分鐘后細(xì)胞基本脫落，加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞重懸后加入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心4分鐘，用移液器吸掉上清，下層沉淀即為所需成肌細(xì)胞。
[0013]第七步，計(jì)數(shù)、種板
在離心管中加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將成肌細(xì)胞吹打重懸，取1yL細(xì)胞懸液加入200ulPCR管中，再加入10此臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性染料，混勻后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞懸液按照15?16的密度種板，之后加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液(六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL)輕輕吹打均勻，注意種板一定要均勻。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:利用漩渦振蕩器振蕩雞胚胸肌，在較短的時(shí)間內(nèi)迅速釋放大量的成肌細(xì)胞，且在短時(shí)間內(nèi)的不連續(xù)振蕩不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，成活率較高，達(dá)到95%以上，另外結(jié)合了差速貼壁法，使細(xì)胞的純度進(jìn)一步提高，保證了成肌細(xì)胞后續(xù)試驗(yàn)的順利進(jìn)行。另外，此方法免去了percoll分離法和雙酶消化法的繁瑣步驟及時(shí)間，且省去percoll和酶的費(fèi)用，價(jià)格低廉。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例做詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程。
[0016]實(shí)施例中所用的D-Hank’S為不含|丐離子和鎂離子的平衡鹽溶液，購(gòu)自BeijingSolarb1 Science & Technology C0., Ltd ;DMEM為含2.5mM L-glutamine、15mM HEPESBuffer、0.IuM sterile Filtered，購(gòu)自HyClone;膜酶為0.25% Trypsin-EDTA，雙抗含量為10000 Units/ml Penicillin、10000ug/ml streptomycin，胎牛血清均購(gòu)自gibco。
[0017]實(shí)施例中所用的細(xì)胞培養(yǎng)液配置如下(以50ml量為例):
胎牛血清:1ml
DMEM:40ml
雙抗:5ul
實(shí)施例:
取6個(gè)發(fā)育良好的12胚齡雞胚，75%酒精噴灑雞胚蛋殼，用鑷子鈍頭輕輕敲破氣室后，再換用彎頭小鑷子輕輕將氣室處蛋殼捏走，掀走白膜，用彎頭小鑷子將雞胚取出放入超凈臺(tái)(放在紫外殺菌的濾紙上)，用彎頭鑷子的鈍面將雞腹部皮膚抹去，將兩側(cè)胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌，放入已加D-Hank’s的培養(yǎng)皿中。把剪下來的胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，用一個(gè)鑷子按住肌肉，另一個(gè)彎頭鑷子撕拉肌肉，使其破碎成糜散狀，再用剪刀剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將剪碎的胸大肌和細(xì)胞培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加細(xì)胞培養(yǎng)液至10ml。
[0018]用漩渦振蕩器(功率12W，振蕩頻率>2600次/分鐘)振蕩懸浮胸大肌，振蕩時(shí)間為I分鐘(期間振蕩1-2秒停止I秒)，懸浮液靜置3分鐘后，用移液器收集上清細(xì)胞培養(yǎng)液(如此振蕩懸浮4至5次)。
[0019]選用100目、400目和600目濾篩放置于直徑為1cm的培養(yǎng)皿上進(jìn)行過濾，將懸液倒入100目濾篩，去除肉糜和雜質(zhì)，之后將過濾后的細(xì)胞懸液再400目和600目逐級(jí)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液加入新離心管中，1200轉(zhuǎn)離心7min，用移液器吸掉上清，加入2ml D-Hank's吹打清洗，重懸后1000轉(zhuǎn)離心4min，然后吸掉上清，下層沉淀即為細(xì)胞。
[0020]在所得細(xì)胞的離心管中加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打重懸，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以免損傷細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入直徑為1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1ml后放入培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。40分鐘后將細(xì)胞培養(yǎng)液移入新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，如此差速貼壁2次后，隔夜培養(yǎng)。
[0021]第二天早上，將培養(yǎng)皿中的上層細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，在培養(yǎng)皿表面加入2ml胰酶，I分鐘后細(xì)胞基本脫落，加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞重懸后加入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心4分鐘，用移液器吸掉上清，下層沉淀即為所需成肌細(xì)胞。
[0022]在離心管中加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打重懸，取1yL細(xì)胞懸液加入200ulPCR管中，再加入10 yL臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性染料，混勻。將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上；將混合液吸出少許，滴在蓋片邊緣，使細(xì)胞懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間(中間不能有氣泡)，在顯微鏡下觀察，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。之后按照:細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/4 X 10000。再取一滴細(xì)胞懸液于載玻片上，用甲醛固定5min，瑞士染液染色，鏡檢(10 X 40)。計(jì)算得:單位體積細(xì)胞數(shù)為8.746 X 107±0.047/ml，成活率為98.14%±0.21。
[0023]根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞懸液按照15-1O6的密度種板，之后加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液(六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL)輕輕吹打均勻，注意種板一定要均勻。
[0024]本發(fā)明在操作時(shí)一定要注意在漩渦振蕩器上振蕩時(shí)不可連續(xù)I分鐘振蕩，要振蕩I，2秒后間歇I秒再繼續(xù)振蕩，這樣可以保證細(xì)胞的活性。整個(gè)振蕩過程重復(fù)4至5次可以保證細(xì)胞的得率較高，過濾的次數(shù)和濾篩目數(shù)較高時(shí)可以得到較純的原代細(xì)胞。因此，用本方法獲得的成肌細(xì)胞活性、成活率和純度都保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，減少了實(shí)驗(yàn)誤差。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雞胚成肌細(xì)胞提取方法，其特征是，包括如下步驟: 第一步，雞胚滅菌，取胸大肌放入加D-Hank，s的培養(yǎng)皿中； 第二步，修剪肌肉 把胸大肌用0-他111^洗三遍，然后把0-他111^吸掉，剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將剪碎的胸大肌和細(xì)胞培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1ml ； 第三步，用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌 用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌，振蕩時(shí)間為I分鐘，靜置3分鐘后，用移液器收集上清細(xì)胞培養(yǎng)液，振蕩懸浮次數(shù)為4-5次； 第四步，過濾、離心 選用100目、400目和600目的濾篩放置于培養(yǎng)皿上進(jìn)行過濾，將步驟三得到的懸液倒入100目濾篩，去除肉糜和雜質(zhì)，之后將過濾后的細(xì)胞懸液再400目和600目逐級(jí)過濾，將過濾后的細(xì)胞懸液加入新離心管中，1200轉(zhuǎn)離心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重懸后再1000轉(zhuǎn)離心4min，吸掉上清，下層沉淀即為細(xì)胞； 第五步，細(xì)胞鋪板，差速貼壁 在步驟四所得細(xì)胞的離心管中加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹打重懸，將細(xì)胞懸液移入直徑為1cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加細(xì)胞培養(yǎng)液至1ml后放入培養(yǎng)箱正常培養(yǎng);40分鐘后將細(xì)胞培養(yǎng)液及沒有貼壁的細(xì)胞移入新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，如此差速貼壁2次后，隔夜培養(yǎng)；第六步，消化獲得成肌細(xì)胞 第二天早上，將培養(yǎng)皿中的上層細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液吸掉，在培養(yǎng)皿表面加入2ml胰酶，I分鐘后細(xì)胞基本脫落，加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞重懸后加入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心4分鐘，用移液器吸掉上清，下層沉淀即為所需成肌細(xì)胞； 第七步，計(jì)數(shù)、種板 在步驟六得到的含有成肌細(xì)胞的離心管中加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將成肌細(xì)胞吹打重懸，取1yL細(xì)胞懸液加入200ul PCR管中，再加入10 yL臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性染料，混勻后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù);根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞懸液種板，之后加入細(xì)胞培養(yǎng)液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞胚成肌細(xì)胞提取方法，其特征是，所述雞胚滅菌，取胸大肌的具體操作方法為:選取12胚齡發(fā)育良好的雞胚，用75%酒精噴灑雞胚蛋殼，用鑷子鈍頭輕輕敲破氣室后，再換用彎頭小鑷子輕輕將氣室處蛋殼捏走，掀走白膜，用彎頭小鑷子將雞胚取出放入超凈臺(tái)，用彎頭鑷子的鈍面將雞腹部皮膚抹去，將兩側(cè)胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌。3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的雞胚成肌細(xì)胞提取方法，其特征是，所述漩渦振蕩器功率12W，振蕩頻率>2600次/分鐘，漩渦振蕩器振蕩期間振蕩1-2秒停止I秒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞胚成肌細(xì)胞提取方法，其特征是，所述吹打重懸細(xì)胞時(shí)吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，以免損傷細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雞胚成肌細(xì)胞提取方法，其特征是，所述步驟七中的種板按照15?16的密度進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)液的加入量是六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK105886458SQ201610396066
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】趙振華, 李春苗, 黃華云, 黎壽豐, 王錢保, 梁忠, 劉帆, 劉一帆, 趙東偉, 盧建, 李新
【申請(qǐng)人】江蘇省家禽科學(xué)研究所