專利名稱：麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗及制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗及制備工藝，是對該疫苗現(xiàn)有制備工藝的改進(jìn)，屬于疫苗制備方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
麻疹病毒屬副粘病毒科麻疹病毒屬(morbillivirus)，與其它副粘病毒不同之處為無特定的神經(jīng)氨酸酶活力。麻疹病毒屬單股負(fù)鏈核糖核酸(RNA)病毒，外殼脂蛋白包膜上有短小突起，帶血凝素，可凝集猴紅血球。此病毒可在人二倍體細(xì)胞、人羊膜細(xì)胞、狗腎細(xì)胞、雞胚細(xì)胞等多種細(xì)胞上培養(yǎng)增殖。從1965年國家批準(zhǔn)生產(chǎn)麻疹減毒活疫苗開始，各廠家均用雞胚(CEC)細(xì)胞生產(chǎn)，病毒培養(yǎng)容器為轉(zhuǎn)瓶或靜止培養(yǎng)，收獲病毒方式為原液一次收獲。此疫苗問世四十多年，但從未有廠家改變其疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)和培養(yǎng)及收獲方式。用雞胚(CEC)細(xì)胞生產(chǎn)麻疹減毒活疫苗，多年來就有潛在外源因子(禽病毒)危險(xiǎn)的爭論和對雞蛋過敏者不能接種的局限性。病毒的培養(yǎng)方式在六、七十年代就已確定。轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)有著轉(zhuǎn)機(jī)機(jī)械故障導(dǎo)致生產(chǎn)損失的必然，靜止培養(yǎng)有著對培養(yǎng)室的面積要求和收獲的局限性，同時(shí)收獲的病毒原液也因存在批間差而失去均一性(因病毒培養(yǎng)后為以一次性以原液方式獲取，并根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的病變程度，收獲病毒原液)。另一點(diǎn)原代細(xì)胞的獲取操作比較麻煩及耗材大，但上述操作方法卻被各生產(chǎn)廠家一直延續(xù)至今。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗的制備工藝，旨在解決用雞胚(CEC)生產(chǎn)存在外源因子污染和一小部分人存在過敏反應(yīng)的可能及解決了生產(chǎn)效率和質(zhì)量不高的問題。本發(fā)明公開的麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗制備工藝，包括以下步驟
1)將人胚肺二倍體細(xì)胞按1:2 — 1 4比例傳代至細(xì)胞工廠，E-MEM培養(yǎng)液的pH為 7. 2^7. 6、牛血清含量為1(T15% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的3(Γ40%;同時(shí)，長-47株麻疹病毒以1 (IO(TlOOO)的感染復(fù)數(shù)加入細(xì)胞工廠中，33°C培養(yǎng)細(xì)胞及病毒；
2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5(Γ60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以培養(yǎng)液2-3倍的HanKs'液或PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液；加入199疫苗液，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的25、0%，33°C繼續(xù)培養(yǎng)；重復(fù)三次，收獲病毒液；
3 )將三次收獲的病毒液保存于(2、) V，待無菌試驗(yàn)合格后，將疫苗液通過0. 65 μ m孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于(2、)°C或 (-25 -20) 0C0所述的麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗制備工藝，還可以通過以下步驟實(shí)現(xiàn)1)將人胚肺二倍體細(xì)胞按1:2 — 1 4比例傳代傳至細(xì)胞工廠，E-MEM培養(yǎng)液的pH為 7. 2^7. 6、牛血清含量為10 15% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的3(Γ40% ；37°C培養(yǎng)3-5天，對人胚肺二倍體細(xì)胞進(jìn)行傳代；
2)長-47株麻疹病毒以1 (IO(TlOOO)的感染復(fù)數(shù)加入已形成細(xì)胞單層的細(xì)胞工廠中， 33 °C培養(yǎng)病毒；
3)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5(Γ60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以培養(yǎng)液2-3倍的HanKs'液或PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液；加入199疫苗液，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的25、0%，33°C繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞病變出現(xiàn)75%開始進(jìn)行收毒，收獲病毒液，重復(fù)三次；
4)將三次收獲的疫苗液保存于(2、)V，待無菌試驗(yàn)合格后，將疫苗液通過0. 65 μ m孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于(2、)°C或 (-25 -20) 0C0在上述的麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗制備工藝中，所述的人胚肺二倍體細(xì)胞可以選擇2BS株或KMB-17或MRC-5中的任一種。本發(fā)明的積極效果在于采用人胚肺二倍體細(xì)胞培養(yǎng)病毒，改變了培養(yǎng)病毒的宿主，避免了潛在的外源因子(禽病毒)污染的可能，和對雞蛋過敏者接種該疫苗產(chǎn)生過敏的危險(xiǎn)，并消除了接種者對異體蛋白的攝入。利用細(xì)胞工廠為培養(yǎng)病毒容器，可連續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)病毒；還能至病毒培養(yǎng)高峰，連續(xù)三次收獲疫苗原液，減小了疫苗生產(chǎn)的批間差異；合并原液經(jīng)過濾過濃縮，可將細(xì)胞碎片濾除，使疫苗液更加澄清，體積縮小易保存，以(2、)！或 (-25 -20) °C低溫凍存方式保存，以稀釋方法制備半成品。本發(fā)明制備工藝比用雞胚(CEC) 細(xì)胞生產(chǎn)的麻疹疫苗收獲率高，細(xì)胞殘存量少；利用人胚肺二倍體細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)基質(zhì)， 生產(chǎn)中的可控性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于用消化原代雞胚(CEC)細(xì)胞培養(yǎng)病毒的方法。大大提高了疫苗收獲率及疫苗質(zhì)量。
具體實(shí)施例方式通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1
1)將人胚肺二倍體細(xì)胞(2BS)按1 :4比例傳代至細(xì)胞工廠，E-MEM培養(yǎng)液的PH為7. 2、 牛血清含量為10% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的30% ；同時(shí)，以長-47株麻疹病毒、1 500的感染復(fù)數(shù)加入細(xì)胞工廠中，33°C培養(yǎng)細(xì)胞及病
2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5(Γ60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以培養(yǎng)液2-3倍的HanKs'液或PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液；加入199疫苗液，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的25、0%，33°C繼續(xù)培養(yǎng)，收獲病毒液，重復(fù)三次；
3)將三次收獲的病毒液保存于(2、)V，待無菌試驗(yàn)合格后，將病毒液通過0.65 μ m孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5倍，保存于(2、)V ；
4)根據(jù)病毒滴度，將濃縮的病毒液稀釋成疫苗。 經(jīng)檢定全部符合2011版《藥典三部》對該疫苗的質(zhì)量要求。
實(shí)施例2:
1)將人胚肺二倍體細(xì)胞(KMB-17)按1:3比例傳代至細(xì)胞工廠，E-MEM培養(yǎng)液的pH為 7. 4、牛血清含量為12% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的35% ；同時(shí)，長-47株麻疹病毒以1 1000的感染復(fù)數(shù)加入細(xì)胞工廠中，33°C培養(yǎng)細(xì)胞及病毒；
2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5(Γ60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以培養(yǎng)液2-3倍的HanKs'液或PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液；加入199疫苗液，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的30%，33°C繼續(xù)培養(yǎng)；重復(fù)三次，收獲病毒液；
3)將三次收獲的病毒液保存于(2、)°C，待無菌試驗(yàn)合格后，將病毒液通過0.65μ m 孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于 (-25 -20) V ；
4)根據(jù)病毒滴度，將濃縮的病毒液稀釋成疫苗。經(jīng)檢定全部符合2011版《藥典三部》對該疫苗的質(zhì)量要求。實(shí)施例3:
1)人二倍體細(xì)胞(2BS)株按1:2比例傳代傳至使用代至細(xì)胞工廠，E-MEM生長液的PH 為7. 6、牛血清含量為14% (ml/ml)，37°C培養(yǎng)3天，待細(xì)胞長成均勻、致密的單層；
2)按1:100的感染復(fù)數(shù)以長-47株麻疹病毒感染細(xì)胞，所用維持液E-MEM培養(yǎng)液的pH 為7. 4、牛血清含量為2%(ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的30% ；
3)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)50%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以相當(dāng)于2 3倍的HanKs'液或 PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液，加入199疫苗液，繼續(xù)置33°C培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變出現(xiàn)75%時(shí)開始進(jìn)行收獲病毒液，重復(fù)三次；
4)將三次收獲的病毒液保存于(2、)V，待無菌試驗(yàn)合格后，將病毒液通過0. 65 μ m孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于(2、)V ；
5)根據(jù)病毒滴度，將濃縮的病毒液稀釋成疫苗。經(jīng)檢定全部符合2011版《藥典三部》對該疫苗的質(zhì)量要求。實(shí)施例4
1)人胚肺二倍體細(xì)胞(MRC-5)株按1:4比例傳代傳至使用代至細(xì)胞工廠，E-MEM生長液的PH為7. 6、牛血清含量為15% (ml/ml)，37°C培養(yǎng)3天，待細(xì)胞長成均勻、致密的單層；
2)按1:500的感染復(fù)數(shù)以長-47株麻疹病毒感染細(xì)胞，所用維持液E-MEM培養(yǎng)液的pH 為7. 5、牛血清含量為3%(ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的35% ；
3)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)50%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以相當(dāng)于2 3倍的HanKs'液或 PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液，加入199疫苗液，繼續(xù)置33°C培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變出現(xiàn)75%開始進(jìn)行收獲病毒液，重復(fù)三次；
4)將三次收獲的病毒液保存于(2、)°C，待無菌試驗(yàn)合格后，將病毒液通過0.65μ m 孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于 (-25 -20) V ；
5)根據(jù)病毒滴度，將濃縮的病毒液稀釋成疫苗。
經(jīng)檢定全部符合2011版《藥典三部》對該疫苗的質(zhì)量要求。按實(shí)施例1-2生產(chǎn)的麻疹原液滴度結(jié)果見下表一
表一實(shí)施例1-2麻疹長47毒種同時(shí)法生產(chǎn)疫苗原液滴度結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗制備工藝，包括以下步驟1)將人胚肺二倍體細(xì)胞按1:2 — 1 4比例傳代至細(xì)胞工廠，E-MEM培養(yǎng)液的pH為 7. 2^7. 6、牛血清含量為1(T15% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的3(Γ40% ；同時(shí)，以長-47株麻疹病毒1 (IO(TlOOO)的感染復(fù)數(shù)加入細(xì)胞工廠中，33°C培養(yǎng)細(xì)胞及病毒；2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5(Γ60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以培養(yǎng)液2-3倍的HanKs'液或PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液；加入199疫苗液，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的25、0%，33°C繼續(xù)培養(yǎng)；收獲病毒液，重復(fù)三次；3)將三次收獲的病毒液保存于(2、) V，待無菌試驗(yàn)合格后，將病毒液通過0. 65 μ m孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于(2、)°C或 (-25 -20) 0C0
2.一種麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗制備工藝，包括以下步驟1)將人胚肺二倍體細(xì)胞按1:2 — 1 4比例傳代傳至細(xì)胞工廠，E-MEM培養(yǎng)液的pH為 7. 2^7. 6、牛血清含量為1(T15% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的3(Γ40% ；37°C培養(yǎng)3-5天，對人胚肺二倍體細(xì)胞進(jìn)行傳代；2)以長-47株麻疹病毒1 (IO(TlOOO)的感染復(fù)數(shù)感染人胚肺二倍體細(xì)胞，所用維持液E-MEM培養(yǎng)液的pH為7. Γ7. 6、牛血清含量為2 3% (ml/ml)、濃度為3%的谷氨酰胺含量為1%，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的3(Γ40% ；3)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)5(Γ60%病變時(shí)，棄去細(xì)胞工廠內(nèi)的液體，以培養(yǎng)液2-3倍的HanKs'液或PBS液清洗細(xì)胞表面，充分振搖后排空洗液；加入199疫苗液，加入量為每層細(xì)胞工廠體積的25、0%，33°C繼續(xù)培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞病變出現(xiàn)75%開始進(jìn)行收獲病毒液，重復(fù)三次；4)將三次收獲的病毒液保存于(2、) V，待無菌試驗(yàn)合格后，將病毒液通過0. 65 μ m孔徑的中空纖維濾柱進(jìn)行過濾澄清，以孔徑為300k的超濾膜濃縮5 10倍，保存于(2、)°C或 (-25 -20) 0C0
3.權(quán)利要求1或2所述的麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗制備工藝，其特征在于所述的人胚肺二倍體細(xì)胞選自2BS株或KMB-17或MRC-5。
全文摘要
本發(fā)明公開麻疹長-47株制備二倍體細(xì)胞減毒活疫苗及制備工藝，用二倍體細(xì)胞株制備麻疹減毒活疫苗，病毒培養(yǎng)容器為細(xì)胞工廠，可連續(xù)三次收獲病毒液，并以濃縮液形式保存。并通過了猴體神經(jīng)毒力試驗(yàn)及安全性試驗(yàn)。此技術(shù)屬于對麻疹減毒活疫苗生產(chǎn)的重大改革，對麻疹減毒活疫苗的生產(chǎn)質(zhì)量有著質(zhì)的飛躍。解決用雞胚(CEC)生產(chǎn)存在外源因子污染和一小部分人存在過敏反應(yīng)的可能及解決了生產(chǎn)效率和質(zhì)量不高的問題。
文檔編號A61K39/155GK102343087SQ201110322559
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者雙慧, 姜威, 張勇, 張宇, 沈宏杰, 王擁軍, 王瑋, 禇東琳, 鄒勇, 鄭曉麗, 閆磊 申請人:長春祈健生物制品有限公司