H9n2亞型禽流感病毒ns1基因缺失減毒活疫苗候選株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過反向遺傳技術(shù)對(duì)H9N2亞型禽流感病毒（AIV)NSl蛋白長(zhǎng)度 進(jìn)行修飾構(gòu)建廣譜性J19N2亞型AIV減毒活疫苗的方法，主要涉及的AIV為BJ-94-like和 Y280-like譜系的毒株。
【背景技術(shù)】
[0002]H9N2亞型禽流感病毒呈世界性流行，自其于1994年在中國(guó)大陸雞群首次分離后 廣為傳播，逐漸在我國(guó)形成了地方性流行疾病，給我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除 感染家禽外，J19N2亞型AIV還能感染哺乳動(dòng)物（豬和人等）。雖然H9N2亞型AIV感染人只 是引起亞臨床或者輕微的臨床癥狀，但J19N2亞型AIV能夠與其他亞型禽流感病毒重組從而 產(chǎn)生新的致死人的流感病毒，如H5亞型禽流感病毒和H7N9亞型流感病毒。因此，H9N2亞 型禽流感的防控在公共衛(wèi)生上也具有重要意義。
[0003] 疫苗免疫是防控禽流感的有效手段。然而由于AIV的基因組是分節(jié)段的RNA病毒 易發(fā)生重配，RNA聚合酶復(fù)制的低保真性易導(dǎo)致病毒的快速變異，因此，現(xiàn)有滅活疫苗對(duì)禽 流感防控效果并不理想。目前我國(guó)使用的全病毒滅活疫苗既有針對(duì)早期的毒株，如Ck/SH/ F/98和Ck/SD/6/96(BJ/94譜系）（LiC，YuK，TianG，etalEvolutionofH9N2influenza virusesfromdomesticpoultryinMainlandChina.Virology, 2005, 340:70-83) 〇 也有 針對(duì)近期的流行株（Y280 譜系）（ZhangY,YinY，BiY，etal.Molecularandantigenic characterizationofH9N2avianinfluenzavirusisolatesfromchickenflocks between1998and2007inChina.VetMicrobiol2012, 156, 285-293.)，免疫雞群仍不 時(shí)有H9N2亞型Al的疫情爆發(fā)。實(shí)驗(yàn)室條件下，SPF雞群接種早期毒株制備的滅活疫苗 后，使用當(dāng)前流行的J19N2亞型AIV以滴鼻方式進(jìn)行攻毒，仍會(huì)發(fā)生高水平的排毒（Sun Y,PuJ,JiangZ,etal.GenotypicevolutionandantigenicdriftofH9N2influenza virusesinChinafrom1994to2008.VetMicrobiol, 2010, 146:215-225.);而使用部分 流行株制備的滅活疫苗也不能很好地保護(hù)SPF雞只抵御H9N2病毒的攻擊（劉東，宮曉，劉 曉東，等.2013.H9N2亞型禽流感流行分析及疫苗毒株的篩選.中國(guó)動(dòng)物檢疫.2013. 30. (6) :45-50 ;萬(wàn)曉朋，曾顯營(yíng)，田國(guó)彬，等.H9N2亞型禽流感流行株滅活疫苗種毒的篩選.中 國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2010. 32 (4) : 277-280)。因此，研制針對(duì)不同譜系H9亞型AIV毒株具有交 叉保護(hù)性的疫苗迫在眉睫。
[0004] 與傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具 有交叉保護(hù)效果好的優(yōu)勢(shì)。而且，減毒活疫苗可通過噴霧或者飲水的方式免疫，使用方 便，大大降低了人力成本。以新城疫活疫苗為例，不需注射而僅用飲水就能快速、方便地 完成雞只的大規(guī)模免疫（Senne DA, King D J，Kapczynski D R. Control of Newcastle disease by vaccination. Developments in biologicals, 2004, 119165-70. )〇-些石開宄 表明，通過阻礙或降低流感病毒的NS1蛋白的活性能夠致弱病毒（Quinlivan M，Zamarin D，Garcia-SastreA，etal.Attenuationofequineinfluenzavirusesthrough truncationsoftheNSlprotein.Journalofvirology, 2005, 79(13):8431-9.ZhouB,Li Y，BelserJA.，etal.NS-basedliveattenuatedHlNlpandemicvaccinesprotectmice andferrets.Vaccine，2010, 28(50) : 8015-8025.)，且NS1 蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)其進(jìn)行改 造并不會(huì)影響病毒本身的抗原性。隨著流感病毒反向遺傳技術(shù)的發(fā)展和成熟，能夠在體 外對(duì)病毒的毒力相關(guān)基因進(jìn)行修飾而快速獲得致弱的重組病毒，獲得潛在的減毒活疫苗 候選株。本研宄中，我們以A/chicken/Taixing/10/2010(TX)株（ZhuY，Yang，LiuW，et al.ComparisonofbiologicalcharacteristicsofH9N2avianinfluenzaviruses isolatedfromdifferenthosts，Archivesofvirology，2015, 160:917-927)為母本，對(duì) 其NS1基因的長(zhǎng)度進(jìn)行不同程度的缺失，使得NS1蛋白分別保留73、100和128個(gè)氨基酸， 通過反向遺傳技術(shù)拯救出3株H9亞型AIVNS1缺失株。測(cè)定缺失株的毒力和免疫效力，挑 選出毒力最低而同時(shí)又能保持免疫效力的重組病毒作為疫苗候選株，免疫雞后觀察其對(duì)不 同譜系H9亞型AIV攻毒提供的保護(hù)交叉保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]H9N2亞型AIV感染給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前主要使用H9N2亞型禽流 感滅活疫苗來防控該病。由于J19N2亞型禽流感滅活疫苗只能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的HI抗體，不 能提供細(xì)胞免疫和黏膜免疫，對(duì)易發(fā)生抗原變異的J19N2亞型AIV很難提供交叉保護(hù)，常常 發(fā)生免疫失敗。因此，有必要研制出能誘導(dǎo)細(xì)胞、體液和黏膜免疫，產(chǎn)生交叉保護(hù)性的新型 弱毒活疫苗。
[0006] 以當(dāng)前流行的Y280譜系的A/chicken/Taixing/10/2010 (TX)株為母本，對(duì)NS1基 因的長(zhǎng)度進(jìn)行不同程度的缺失，使得NS1蛋白分別保留73、100和128個(gè)氨基酸；野生型NS1 蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0. 12所示；上述保留73、100和128個(gè)氨基酸的序列分別是 SEQIDN0. 13、SEQIDN0. 14和SEQIDN0. 15。利用反向遺傳技術(shù)拯救出3株H9亞型重 組AIV。測(cè)定重組病毒的毒力指標(biāo)和免疫抗體產(chǎn)生情況，篩選出安全性好且免疫原性好的重 組病毒作為疫苗候選株，免疫雞后評(píng)價(jià)其對(duì)不同譜系H9亞型AIV攻毒提供的保護(hù)作用，篩 選出能提供交叉保護(hù)的弱毒活疫苗。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：H9N2亞型禽流感病毒NS1基因缺失減毒活疫苗候選 株rTX-NSl-128,它是以A/chicken/Taixing/10/2010TX株為母本，對(duì)NS1基因的長(zhǎng)度進(jìn)行 缺失，使得NS1蛋白只保留了128個(gè)氨基酸；所述的128個(gè)氨基酸的序列如SEQIDN0. 15 所示。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了rTX-NSl-128的構(gòu)建方法，是以A/chicken/ Taix