一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 水貂出血性肺炎又稱水貂假單胞菌性肺炎，是主要發(fā)生在每年8-11月份水貂換毛 季節(jié)的一種急性傳染病，以出血性肺炎、急性死亡為特征，死前出現(xiàn)呼吸困難、鼻孔流出紅 色帶泡沫液體等癥狀，死后剖檢可見整個肺葉腫大并有彌漫性出血和敗血癥變化。本病世 界各地均有發(fā)生，每年可造成養(yǎng)殖場20 %-40 %的死亡率，是危害毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的重要細 菌性傳染病。
[0003] 該病病原為假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomonas)中的銅綠 假單胞菌（Pseudomonas aeruginolsa)，亦稱為綠胺桿菌（Bacterium pyocyaneum)，為革蘭 氏陰性桿菌，兩端鈍圓，一端有一根鞭毛，能運動。不能形成芽孢及莢膜。在普通瓊脂培養(yǎng)基 上生長良好，形成大小不一的菌落。多數(shù)能產(chǎn)生色素，使菌落周圍瓊脂培養(yǎng)基著色。綠膿桿 菌共有六3、(：、04、？、6、!1、1、6、1(^、~等14個血清型。我國各地水貂出血性肺炎的流行血 清型主要以G(6型）、B(2、5、16型)為主(括號內(nèi)為對應的國際血清分型系統(tǒng)IATS)。
[0004] 水貂出血性肺炎發(fā)病急，死亡快，發(fā)病時往往來不及治療，常用藥物替米考星、阿 奇霉素、卡那霉素治療效果不顯著，而且抗生素的濫用導致綠膿桿菌已產(chǎn)生耐藥性，因此需 要有效的疫苗來預防，國外有報道將細菌細胞壁提取物(JAMES E.PENNINGTON，1979)加類 毒素成分彈性蛋白酶制成免疫原，有一定的免疫效果，但制備過程復雜，成本高，不適合大 量生產(chǎn)使用，而且免疫次數(shù)多，免疫期短，不適合臨床應用，綠膿桿菌抗原型繁多，單一成分 的細胞提取物往往很難達到很好的保護效果。目前各國在水貂出血性肺炎的預防中多以菌 體滅活疫苗產(chǎn)品為主，將流行血清型的菌株滅活后制備成多價滅活疫苗，可有效預防同類 血清型菌株引起的該病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗，從而解決水貂綠膿桿菌滅活疫 苗研發(fā)中現(xiàn)有疫苗株免疫原性不強、各血清型之間免疫交叉保護力低的問題。
[0006] 本發(fā)明的一種水貂綠膿桿菌滅活疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其中使用的抗原 為13型水紹綠胺桿菌(？8611(1〇1]1〇11&8&61'1^;[1118&)1^03株，該菌株于2016年2月22日保藏在中 國武漢、武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:M2016068。
[0007] 上述的水貂綠膿桿菌是用甲醛進行滅活的；
[0008] 優(yōu)選佐劑為蜂膠佐劑或水佐劑；
[0009] 所述的疫苗中含菌量2 4.0 X 109CFU/mL。
[0010] 本發(fā)明制備的滅活疫苗安全可靠，能提供有效地同源攻毒保護，免疫后能夠產(chǎn)生 較強免疫力，接種貂群的發(fā)病率和死亡率均明顯減少，能夠有效預防水貂出血性肺炎的流 行和傳播，降低本病對毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失，有著廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0011] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例來進一步說明。
[0012] 本發(fā)明具體實施例所使用的培養(yǎng)基如下：
[0013] 生產(chǎn)用培養(yǎng)基：
[0014]十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基(NAC)配制：稱取4g NAC粉末加入100mL蒸餾水 中，充分混勻后，121°C滅菌15min，冷卻至50 °C~60 °C時，傾倒平板備用。
[0015] 改良營養(yǎng)普通肉湯培養(yǎng)基(NB)配制：稱取5g NB粉末加入100mL蒸餾水中，121°C滅 菌15min。臨用前加入終濃度2%胎牛血清的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，混合均勻后配制而成。
[0016]發(fā)酵培養(yǎng)基配制:蛋白胨2%，牛肉膏0.6%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.5%，用去離子 水配成，配完調(diào)?11值7.4~7.6，1121€3〇1^11，滅菌后按照培養(yǎng)基的2%加入健康胎牛血清。 [00 17] 實施例1:
[0018] 1.1綠膿桿菌菌株的分離純化方法
[0019] 從遼寧省疑似水貂出血性肺炎的某大型水貂養(yǎng)豬場選取發(fā)病水貂，無菌采集病貂 的肺臟、肝臟和心血劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基(NAC)上，置于37°C培養(yǎng)箱 培養(yǎng)16h~18h，挑取圓形、光滑、濕潤、扁平的菌落革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陰性細小桿 菌進行劃線純培養(yǎng)。
[0020] 將純培養(yǎng)菌株分別劃線接種于鮮血瓊脂平板和NAC平板，37°C培養(yǎng)16h~18h，選取 在十六烷三甲基溴化銨培養(yǎng)基上產(chǎn)生綠色熒光色素，在血瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生β溶血的小菌 落進行純化培養(yǎng)。
[0021] 根據(jù)綠膿桿菌的生化鑒定試驗要求進行鑒定，將進一步純化培養(yǎng)的兩株菌株，分 別進行綠膿色素培養(yǎng)基生長、氧化酶試驗、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、木糖分解試驗、硝 酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、42°C生長試驗等。結(jié)果均為表1所示。該菌株根據(jù)其病貂的來 源地命名為LN03株。
[0022]表1分離菌株生化試驗結(jié)果
[0023]
[0024] 1.2 16S rRNA基因序列測定與分析
[0025] 1 · 2 · 1 引物設計采用細菌的 16S rRNA通用引物F27 (5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）和下游引物R1492(5 ' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '）。引物送由上海生物工程技術(shù)服務 有限公司合成。引物由上海生物工程有限公司合成。
[0026] 1.2.2細菌DNA模板的制備過夜培養(yǎng)綠膿桿菌，取lml菌液到1.5mlEP管中，8000r/ min lOmin倒掉上清，沉淀用100μΙ蒸餾水懸浮，沸水煮沸15min，放在-20°C冰柜反復凍融3 次。5000r/min lOmin，收集上清即為細菌基因組DNA。
[0027] 1.2.3PCR擴增PCR擴增體系總體積為25yL，10XEx Taq Buffer 2.5yL、dNTPs 2μ L、上下游引物（ΙΟμL?θΙ/L)各0.5yL、模板DNA lyL、Ex Taq DNA聚合酶0.25yL，ddH20 18·25μ LoPCR 擴增條件：941€5111丨11;94°(：1111丨11，53°(：1111丨11，72 1€2111丨11，循環(huán)30次；72°(：延伸1511^11。
[0028] 1.2.4凝膠電泳將PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后，用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，然后用凝 膠成像儀分析結(jié)果。經(jīng)測定B型LN03株的16SrRNA基因片段大小為1524bp。用DNA快速回收試 劑盒回收PCR產(chǎn)物，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 1.2.5 16S rRNA擴增產(chǎn)物的克隆與測序?qū)⒒厥盏腜CR產(chǎn)物與pMD19-T在16°C連接 30min，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌，37°C過夜培養(yǎng)12h~16h。挑取平板上的單菌落于氨芐青霉素 抗性的LB液體培養(yǎng)基中37 °C過夜振蕩培養(yǎng)，次日應用菌液PCR的方法擴增16SrRNA基因篩選 陽性克隆，鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒交由青島華大基因科技股份有限公司測序。將序列 在GenBank中進行BLAST比對，與已發(fā)布的綠膿桿菌相應序列的同源性最高。
[0030] 1.3綠膿桿菌LN03株的血清學鑒定
[0031]綠膿桿菌血清分型按日本生研株式會社銅綠假單胞菌標準陽性血清試劑盒附帶 的說明書進行操作：
[0032] 1.3.1抗原的制備將被檢菌株劃線接種于NAC培養(yǎng)基上，置37°C培養(yǎng)24小時，再挑 取單個菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24小時。取單個菌落溶于100yL生理鹽水， 置于EP管中，制成抗原備用。
[0033] 1.3.2玻板凝集反應取10yL抗原與20yL血清在潔凈的玻板上充分混合，同時取10μ L抗原與20yL生理鹽水混合作為空白對照。結(jié)果判定：在lmin內(nèi)，在透明的背景下觀察到有 凝集塊，空白對照為陰性的為凝集反應陽性?？梢奓N03株于B型血清與抗原之間出現(xiàn)明顯的 凝集