一種優(yōu)化制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及全病毒疫苗制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種優(yōu)化制備滅活疫苗和/或 減毒活疫苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 全病毒疫苗（包括弱毒苗與滅活苗）在現(xiàn)代疫苗應(yīng)用中依舊占據(jù)相當(dāng)大的比重。 全病毒疫苗又被稱為常規(guī)疫苗，包括滅活疫苗與減毒活疫苗，其中減毒活疫苗是采用人工 定向變異的方法，或從自然界篩選出毒力高度減弱或基本無毒的活的微生物制成的疫苗。 減毒活疫苗接種后，在機(jī)體內(nèi)有一定的生長(zhǎng)繁殖能力，免疫效果強(qiáng)而持久，一般只需接種一 次,免疫能力會(huì)終生保持，除刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫外，尚能產(chǎn)生局部免疫保 護(hù)。按照這一標(biāo)準(zhǔn)，最好的疫苗無疑就是活的、減毒的病原體，然而散毒威脅是其始終無法 回避的問題。滅活疫苗是選用免疫原性強(qiáng)的病原微生物經(jīng)培養(yǎng)，用物理或化學(xué)方法將其滅 活后，再經(jīng)純化制成。滅活疫苗已失去對(duì)機(jī)體的感染力，但仍保持其免疫原性，可以刺激機(jī) 體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫力，抵抗野毒株的感染。滅活疫苗常需多次接種，接種一次不產(chǎn)生具有保 護(hù)作用的免疫，僅僅是"初始化"免疫系統(tǒng)。非全病毒疫苗可最大限度地降低毒力逆轉(zhuǎn)的風(fēng) 險(xiǎn)，其中亞單位疫苗是在大分子抗原攜帶的多種特異性的抗原決定簇中，只有少量抗原部 位對(duì)保護(hù)性免疫應(yīng)答起重要作用。通過化學(xué)分解等蛋白質(zhì)水解方法使天然蛋白質(zhì)分離，提 取病毒特殊區(qū)域，篩選出具有免疫活性的片段制成的疫苗。亞單位疫苗能消除許多無關(guān)抗 原誘發(fā)的抗體，從而減少疫苗的副反應(yīng)和疫苗引起的相關(guān)疾病?；蚬こ桃呙缡侵咐肈NA 重組生物技術(shù)，將病原體外殼蛋白質(zhì)中能誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的天然或人工合成的遺傳物質(zhì) 定向插入細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，經(jīng)純化后而制得的疫苗。但是這兩 類疫苗的不足之處是免疫原性較低，且不全面，需與佐劑合用才能產(chǎn)生好的免疫效果，因此 往往達(dá)不到最佳的保護(hù)效果。
[0003] 目前全病毒疫苗制備領(lǐng)域面臨的難題是，很多疫苗生產(chǎn)用毒株效價(jià)不高，這直接 影響著疫苗的效果。國(guó)內(nèi)外一些課題組將苗毒在不同的保存條件下，發(fā)現(xiàn)效價(jià)滴度呈現(xiàn)一 定規(guī)律的變化，并最終確定合適的保存條件。還有一些課題組采用免疫佐劑提高疫苗效用， 如無機(jī)佐劑（氫氧化鋁等）、有機(jī)佐劑（細(xì)菌產(chǎn)物等）、合成佐劑（左旋咪唑等）、油劑（費(fèi) 氏佐劑等），以及環(huán)孢素A、雷帕霉素等免疫抑制劑。然而，國(guó)家正式審批的佐劑類型非常有 限，也不提倡用于人體，這些佐劑主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而動(dòng)物多次注射后常會(huì)發(fā)生佐劑病， 因此佐劑的使用要求非常謹(jǐn)慎，也受到極大限制。此外，另一些課題組對(duì)生產(chǎn)用毒株進(jìn)行毒 株表型或遺傳學(xué)改造，使其更適合于弱毒苗或滅活苗的開發(fā)。還有研究者嘗試不同細(xì)胞系， 如將貼壁細(xì)胞改換成懸浮細(xì)胞，以通過增加單位體積的細(xì)胞密度，提升細(xì)胞增殖病毒的效 價(jià)滴度。上述方案一定程度地提高了疫苗毒的效價(jià)滴度，但并沒有通過深入了解病毒復(fù)制 的宿主細(xì)胞因素，發(fā)現(xiàn)并開發(fā)有利于病毒復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種優(yōu)化制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗的方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2(Gliomatumor suppressorcandidateregiongene2,GLTSCR2)編碼蛋白P60 在制備滅活疫苗和 / 或減 毒活疫苗中的應(yīng)用，所述膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2編碼蛋白的氨基酸序列如SeqIDNo. 1所 示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006]P60蛋白是一種定位于細(xì)胞核仁的核糖體蛋白P60,其可提高4科類病毒效價(jià)1-3 個(gè)lg單位，包括冠狀病毒（如傳染性支氣管炎病毒）、副粘病毒（如犬瘟熱與新城疫病毒）、 正粘病毒（如流感病毒）、及皰瘆病毒（如單純皰瘆病毒與馬立克病毒）。分子質(zhì)量為60kDa 的P60蛋白與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、DNA損傷應(yīng)答及細(xì)胞凋亡關(guān)系十分密切。據(jù)報(bào)道，在DNA損傷 情況下，核仁蛋白P60可定位至細(xì)胞核質(zhì)，并與重要的腫瘤抑制因子P53結(jié)合，穩(wěn)定P53的 同時(shí)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；另一方面，為了應(yīng)對(duì)核仁應(yīng)激，P60蛋白可阻斷核糖體蛋白與MDM2結(jié) 合，從而促進(jìn)P53泛素化降解。此外，PI3K-Akt/PKB信號(hào)途徑在細(xì)胞存活與病毒致病等方 面都起到重要作用，PTEN是該通路的主要?jiǎng)x車蛋白，但P60基因敲除后PTEN會(huì)迅速降解， 并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。因此在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，P60擁有"腫瘤抑制因子"及"抑制癌癥的路障"雙重 身份。P60獨(dú)特的生化特性與復(fù)雜功能使之迅速成為科研熱點(diǎn)，但是在病毒學(xué)領(lǐng)域，鮮見文 獻(xiàn)報(bào)道。
[0007] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，P60蛋白可通過幾種細(xì)胞途徑發(fā)揮功能，如調(diào)控先天免疫系統(tǒng)、 細(xì)胞防御系統(tǒng)、蛋白合成系統(tǒng)。
[0008] 本發(fā)明提供一種優(yōu)化的制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗的方法，在宿主細(xì)胞中過 表達(dá)膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2,并用滅活疫苗和/或減毒活疫苗生產(chǎn)用毒株接種宿主細(xì)胞，培 養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液。
[0009] 所述滅活疫苗和/或減毒活疫苗包括但不限于冠狀病毒科（如傳染性支氣管炎病 毒）、副粘病毒科（如犬瘟熱與新城疫病毒）、正粘病毒科（如流感病毒）及皰疹病毒科（如 單純皰疹病毒和馬立克病毒）等的滅活疫苗和/或減毒活疫苗。
[0010] 前述的方法，待宿主細(xì)胞的匯合度達(dá)到80~90%時(shí)，按1~10個(gè)TCID5。接種滅 活疫苗和/或減毒活疫苗生產(chǎn)用毒株。
[0011] 本發(fā)明中采用的細(xì)胞培養(yǎng)方式為貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。
[0012] 本發(fā)明還提供一種過表達(dá)膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2的宿主細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明還提供上述宿主細(xì)胞在制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明通過在宿主細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)編碼P60蛋白的基因，優(yōu)化用于制備滅活疫苗和 /或減毒活疫苗的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制環(huán)境，提高4科類病毒（包括冠狀病毒科、副粘病毒科、正 粘病毒科及皰疹病毒科）效價(jià)1-3個(gè)lg單位，本發(fā)明為優(yōu)化全病毒疫苗的病毒滴度提供了 新策略與可行依據(jù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景和創(chuàng)新意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1為p60在病毒感染宿主細(xì)胞中的特性與功能；其中，A1，兩種細(xì)胞的蛋白p60 在未感染時(shí)的細(xì)胞定位，可見位于細(xì)胞核中；A2,在人單純皰疹病毒-l(HSV-l)感染后，可 見P60遷移至細(xì)胞質(zhì)；A3,在新城疫病毒（NDV)感染后，可見p60遷移至細(xì)胞質(zhì)；B，HSV-1 感染（10TCID5。)Η印-2不同時(shí)間后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行細(xì)胞核-質(zhì)分離，再采用各抗體進(jìn)行 western-blot分析，可見p60與其伴侶蛋白PTEN均出現(xiàn)先入核后出核的定位變化趨勢(shì)；C, 在病毒感染同時(shí)加入DNA合成抑制劑PMEG(+)，不同時(shí)間后（實(shí)驗(yàn)條件與A與B相同），可 見PMEG(10μM)不會(huì)影響p60總表達(dá)水平，但是會(huì)顯著影響細(xì)胞定位，推測(cè)p60出核與病毒 復(fù)制直接相關(guān)；D，將PTEN敲除96h后（800ng)，過表達(dá)GFP-N1或GFP-p60 (10μg)，40h后 感染HSV-1不同時(shí)間，可見PTEN的敲除沒有抑制過表達(dá)p60對(duì)病毒復(fù)制的增進(jìn)作用，因此 P60發(fā)揮功能與PTEN并不完全相關(guān)。
[0016] 圖2為實(shí)施例中過表達(dá)或敲除p60基因?qū)?種病毒復(fù)制的影響；其中，A1，從左至 右依次為，Hep-2細(xì)胞過表達(dá)對(duì)照GFP-N1質(zhì)粒后感染NDV、過表達(dá)GFP-p60質(zhì)粒后感染NDV、 只感染NDV、H印-2細(xì)胞敲除對(duì)照scramble基因后（Neg)感染NDV、敲除對(duì)照p60基因后感 染NDV，所用質(zhì)粒10μg，過表達(dá)時(shí)間為40小時(shí)（A2同）；敲除siRNA用量為800ng，時(shí)間為96 小時(shí)（A2同）；感染時(shí)間為48小時(shí)，10個(gè)TCID5Q(A2同），而后采用細(xì)胞病變法測(cè)病毒滴度； A2,從左至右依次為，除了p60樣品重復(fù)1次（標(biāo)號(hào)2-3)，其他樣品處理方法與A1同，所用 病毒蛋白NP抗體，1:1000稀釋。可見p60敲除不利于NDV復(fù)制，而過表達(dá)則可優(yōu)化病毒復(fù) 制；B1，從左至右依次為，Η印-2細(xì)胞過表達(dá)對(duì)照GFP-N1質(zhì)粒后感染HSV-1、過表達(dá)GFP-p60 質(zhì)粒后感染、只感染HSV-1、細(xì)胞敲除對(duì)照scramb1e基因后感染、敲除對(duì)照ρ60基因后感染， 所用質(zhì)粒10μg，過表達(dá)時(shí)間為40小時(shí)（Β2同）；敲除siRNA為800ng，時(shí)間為96小時(shí)（圖 B2同）；感染時(shí)間為48小時(shí)，10個(gè)TCID5Q(B2同），然后采用細(xì)胞病變法測(cè)病毒滴度；B2,從 左