本發(fā)明涉及對腦癌的新治療方法，所述腦癌在過去對于治療特別有抗性，即星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤，腦癌(轉(zhuǎn)移性癌癥)和原發(fā)性CNS淋巴瘤。

發(fā)明背景

癌癥是最具有生命威脅的疾病之一。癌癥是其中身體一部分中的細胞經(jīng)歷失控生長的病癥。根據(jù)來自美國癌癥協(xié)會的最新數(shù)據(jù)，估計在2014年美國有167萬新增癌癥病例。癌癥是美國第二大死因(僅次于心臟病)并且估計在2014年奪去超過585,000條生命。實際上，預(yù)計生活在美國的所有男性中的50％和所有女性中的33％在他們的有生之年都將發(fā)展某種類型的癌癥。因此，癌癥構(gòu)成重大的公共健康負擔并且在美國導(dǎo)致了顯著成本。這些數(shù)字在其他地方在全球大多數(shù)國家中反映，盡管癌癥的類型和發(fā)展癌癥的群體的相對比例取決于許多不同因素(如包括遺傳和飲食)而變化。

世界衛(wèi)生組織(WHO)將原發(fā)性腦腫瘤分成四類。WHO I和II級是低級膠質(zhì)瘤，而間變性星形細胞瘤和間變性少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(WHOIII級)以及膠質(zhì)母細胞瘤(GBMs)(WHO IV級)總稱為惡性膠質(zhì)瘤。大多數(shù)原發(fā)性和繼發(fā)性腦腫瘤的預(yù)后是極壞的，因為缺乏有效的治療劑。它們是兒童中由于實體瘤導(dǎo)致的死亡的首因并且是年齡在15-34歲的青少年和成人中癌癥導(dǎo)致的死亡的第三大原因(Jemal等，CA Cancer J Clin 59 2009 225-249)。

在惡性膠質(zhì)瘤中，GBM是最常見的和致命的腫瘤，代表所有膠質(zhì)瘤的約50％。GBM的預(yù)后令人沮喪，突出了對新治療策略的需要。外科手術(shù)接著是烷基化劑替莫唑胺(TMZ)和放療的組合療法是對于患有GBM的患者的標準治療。TMZ的主要作用機制是通過DNA堿基的異常甲基化引發(fā)的，特別是DNA中的O6-甲基鳥嘌呤(Verbeek等，Br Med Bul，85，2008，17-33)。然而，許多患者對TMZ具有抗性或者僅顯示弱反應(yīng)。這已經(jīng)顯示是由O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)介導(dǎo)的錯配修復(fù)(MMR)賦予的(參見Weller等，Nat Rev Neurol，6，2010，39-51)。具有該修復(fù)系統(tǒng)的患者具有‘MGMT陽性GBM’。mTOR/DNAPKC途徑的激活也被認為發(fā)揮作用。迄今還未開發(fā)出針對MGMT陽性GBM具有活性的化療劑。MGMT的活性在其他星形膠質(zhì)細胞的腦腫瘤(即彌漫性星形細胞瘤(WHO II級)和間變性星形細胞瘤(WHOIII級))中也是重要的。這些至GBM的進展主要通過MGMT的甲基化來介導(dǎo)。因此可以看出，針對MGMT陽性星形細胞瘤具有活性的治療劑在防止這些彌漫性和間變性星形細胞瘤進展為GBM方面將是理想的。

因此，關(guān)鍵的是急切開發(fā)一種具有優(yōu)異抗腫瘤活性的新治療劑，其不僅針對MGMT陰性GBM還針對MGMT陽性GBM(以及其他星形膠質(zhì)細胞的腦腫瘤)，顯示優(yōu)異的CNS穿透并且具有可耐受的毒性性質(zhì)。

轉(zhuǎn)移性腦腫瘤作為癌癥起始于身體別處并擴散至腦。乳腺癌、肺癌、黑素瘤、結(jié)腸癌和腎癌通常轉(zhuǎn)移。經(jīng)常地，在原發(fā)性腫瘤之前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。轉(zhuǎn)移性腦腫瘤是成人中所有腦腫瘤中最常見的。估計每年可能存在高達170,000例新病例。盡管比GBM稍微好點，但是轉(zhuǎn)移性腦癌的預(yù)后通常是差的。再次，采用外科手術(shù)、治療和化療的組合，這些選項之中的確切組合取決于轉(zhuǎn)移癌的本性和發(fā)展階段(以及患者的健康)。外科手術(shù)(當可能時)和放療是應(yīng)用的標準治療。有時候使用化療。不幸的是，迄今還未有很大成功。這部分是由于需要化療劑顯示優(yōu)異的CNS穿透(當然，還有優(yōu)異的抗腫瘤活性和可耐受的毒性性質(zhì))。許多現(xiàn)有的化療劑顯示對血腦屏障的差的穿透。急切需要解決這些問題的新治療劑。

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)淋巴瘤源自淋巴細胞，但是應(yīng)當認為是腦腫瘤，因為其位置僅在腦中并且治療挑戰(zhàn)類似于其他腦腫瘤的那些。具體地，藥物遞送被血腦屏障阻礙并且腦毒性限制當前治療的使用。大多數(shù)原發(fā)性CNS淋巴瘤是彌漫性大B-細胞淋巴瘤(約90％)。盡管其相對稀少，但是其發(fā)病率和流行程度正在增加。當前，使用現(xiàn)有治療方案的中值存活率為44個月。對于該病癥還未建立特別有效的治療方案。當前優(yōu)選的化療劑是甲氨蝶呤。然而，其對血腦屏障的穿透并不令人滿意，并且不得不以極高的劑量施用。使用放療的組合療法可以改善結(jié)果，但是副作用可能是非常嚴重的。因此，需要一種改進的化療劑，其具有更大的穿透血腦屏障的能力并且還顯示針對原發(fā)性CNS淋巴瘤的優(yōu)異的抗腫瘤活性。

在WO-A-2010/085377中，公開了以下式I的化合物。它是首創(chuàng)一類(first-in-class)雙功能烷基化-HDACi融合分子，其有效地抑制HDAC途徑。

生物學(xué)測定顯示，式I的化合物有效地抑制1類和2類HDAC酶(例如HDAC1，IC₅₀為9nM)，并且已經(jīng)顯示具有針對多發(fā)性骨髓瘤細胞系的優(yōu)異的體外活性。此外，其通過顯著下調(diào)FANCD2，BRCA1，BRCA2，和TS(胸苷酸合成酶)抑制DNA修復(fù)，可能涉及HDAC6和HDAC8抑制。在NCI-60細胞系中的細胞毒性測定已經(jīng)顯示其具有極強的抗癌活性，與苯達莫司汀(Bendamustine)的72μM相比，其IC₅₀中值為2.2μM。WO-A-2013/113838包括了顯示式I的化合物(在說明書中稱為NL-101)針對許多細胞系的活性的數(shù)據(jù)，所述細胞系包括一些成膠質(zhì)細胞瘤細胞系。然而，考慮的細胞系中的每一種都是MGMT陰性GBM腫瘤細胞系。

發(fā)明概述

在本發(fā)明的第一方面，提供用于治療腦癌的式I的化合物或其藥用鹽：

所述腦癌選自MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性腦癌和原發(fā)性CNS淋巴瘤。

在臨床前體外和體內(nèi)研究中，已經(jīng)顯示式I的化合物不僅針對MGMT陰性GBM腫瘤具有活性，而且對于MGMT陽性GBM腫瘤具有活性。由此，還可以預(yù)期其對于其他MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腫瘤具有活性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，式I的化合物能夠非常好地穿透血腦屏障，使得其不僅針對MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腫瘤而且針對其他腦腫瘤的治療應(yīng)用理想。特別是，已經(jīng)進一步發(fā)現(xiàn)其具有非常好的針對轉(zhuǎn)移性腦癌以及原發(fā)性CNS淋巴瘤的活性。

在本發(fā)明的第二方面，提供了式I的化合物或其藥用鹽在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療選自MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性腦癌和原發(fā)性CNS淋巴瘤的腦癌。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種在需要其的患者中治療腦癌的方法，所述腦癌選自MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤、轉(zhuǎn)移性腦癌和原發(fā)性CNS淋巴瘤，所述方法包括將式I的化合物或其藥用鹽施用于所述患者。

附圖描述

圖1是在腦脊液和血液中EDO-S101濃度(μM)對時間的圖表；

圖2是在施用替莫唑胺之后，12種測試的GBM細胞系的IC₅₀的圖表；

圖3是在施用替莫唑胺和伏林司他(vorinostat)之后，12種測試的GBM細胞系的IC₅₀的圖表；

圖4是在施用苯達莫司汀之后，12種測試的GBM細胞系的IC₅₀的圖表；

圖5是在施用苯達莫司汀和伏林司他后，12種測試的GBM細胞系的IC₅₀的圖表；

圖6是對于12種測試的細胞系的每一種，細胞存活百分比針對EDO-S101(μM)濃度的圖表；

圖7a是作為注射后GBM12細胞生長測量值的發(fā)光針對時間的圖表；

圖7b是存活百分比針對時間的圖表，顯示了EDO-S101針對苯達莫司汀和對照的存活的延長。

圖8是對于移植了用EDO-S101處理的U251腫瘤的小鼠，進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表；

圖9是對于移植了用EDO-S101處理的U87腫瘤的小鼠，進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表；

圖10是對于僅用放療處理、用放療和2.5μM EDO-S101(在圖中顯示為NL-101)和5μM EDO-S101EDO-S101處理的U251，U87和T98G細胞，存活分數(shù)針對放療劑量(Gy)的圖表；

圖11是對于移植了用對照、放療和EDO-S101處理的U251腫瘤的小鼠，進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表；

圖12是對于移植了用對照、放療和替莫唑胺、EDO-S101以及放療和EDO-S101處理的U251腫瘤的小鼠，進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表；

圖13是對于移植了用對照、放療和EDO-S101處理的U87腫瘤的小鼠，進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表；

圖14是對于移植了用對照、放療和替莫唑胺、EDO-S101、以及放療和EDO-S101處理的U87腫瘤的小鼠，進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表；

圖15和16是在用對照載體、EDO-S101、替莫唑胺、以及放療和替莫唑胺處理后，原位熒光素酶-轉(zhuǎn)染的U251GBM小鼠的生物發(fā)光圖像；

圖17是在用對照載體、放療、EDO-S101、替莫唑胺、以及放療和替莫唑胺處理后，對于原位熒光素酶-轉(zhuǎn)染的U251GBM小鼠存活概率(％)針對時間的圖表；

圖18是對于移植了用對照、苯達莫司汀和EDO-S101處理的OCI-LY10CNS淋巴瘤的小鼠，存活百分比針對時間的圖表；和

圖19是對于在用MB-468乳腺癌細胞轉(zhuǎn)染后具有腦的三陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠，存活百分比針對時間的圖表，所述MB-468乳腺癌細胞用對照、苯達莫司汀和EDO-S101處理。

發(fā)明詳述

在本發(fā)明中，使用許多通用術(shù)語和措詞，其應(yīng)該如下解釋。

星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤是源自于腦內(nèi)星形的膠質(zhì)細胞(星形膠質(zhì)細胞)的腫瘤。它們分為低級(I和II)和高級(III和IV)。已知II級星形膠質(zhì)細胞腫瘤為彌漫性星形細胞瘤。盡管這些生長較慢，但是它們可以發(fā)展成為惡性原發(fā)性腫瘤。已知III級星形膠質(zhì)細胞腫瘤為間變性星形細胞瘤。這些是惡性腫瘤；它們生長更快并且傾向于侵入附近健康組織。已知IV級星形膠質(zhì)細胞腫瘤是多形性成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)。這些是高度惡性的，生長快速，容易擴散到附近組織，并且非常難以用常規(guī)治療來治療。

目前的標準化療治療是使用替莫唑胺(TMZ)。然而，許多患者對于反應(yīng)具有抗性或者僅顯示弱反應(yīng)。已經(jīng)顯示這是通過O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)介導(dǎo)的錯配修復(fù)(MMR)賦予的(參見Weller等，Nat Rev Neurol，6，2010，39-51)。具有該修復(fù)系統(tǒng)的患者具有‘MGMT陽性GBMs’。GBMs因此分成MGMT陰性GBMs和MGMT陽性GBMs，這取決于它們是否表達MGMT基因。已經(jīng)顯示本發(fā)明式I的化合物或其藥用鹽不僅具有針對MGMT陰性的GBMs的活性，而且具有針對MGMT陽性GBMs的活性。

MGMT活性在其他星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤中也是重要的，所述其他星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤即彌漫性星形細胞瘤(WHO II級)和間變性星形細胞瘤(WHO III級)。這些至GBMs的進展主要是通過MGMT導(dǎo)致的甲基化介導(dǎo)的。因此可以看到，因為式I的化合物及其藥用鹽具有針對MGMT陽性星形細胞瘤的活性，因此它也能夠預(yù)防這些彌漫性和間變性星形細胞瘤至GBMs的進展。

轉(zhuǎn)移性腦腫瘤是作為身體內(nèi)其他地方的癌癥起始并且擴散到腦的腦腫瘤。乳腺癌、肺癌、黑素瘤、系統(tǒng)性淋巴瘤、肉瘤、結(jié)腸癌、胃腸癌和腎癌通常轉(zhuǎn)移。

在本發(fā)明上下文中的原發(fā)性CNS淋巴瘤是源自腦內(nèi)的淋巴細胞、由所述淋巴細胞形成的惡性細胞的淋巴瘤。因此，認為其為腦腫瘤，因為其位置和治療挑戰(zhàn)類似于其他腦腫瘤的那些。

“藥用鹽”是指本發(fā)明化合物的鹽，其是藥學(xué)上可接受的，如上定義，并且具有所需的藥理學(xué)活性。這些鹽包括與無機酸或與有機酸形成的酸加成鹽。藥用鹽還包括堿加成鹽，其當存在的酸性質(zhì)子能夠與無機或有機堿反應(yīng)時可以形成。通常，這樣的鹽例如通過將游離酸或堿形式的這些化合物與化學(xué)計算量的適當?shù)膲A或酸在水中或在有機溶劑中或在這兩者的混合物中反應(yīng)來制備。通常，優(yōu)選非水性介質(zhì)如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。酸加成鹽的實例包括無機酸加成鹽，如例如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，氨基磺酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，和有機酸加成鹽，如例如乙酸鹽，三氟乙酸鹽，馬來酸鹽，富馬酸鹽，檸檬酸鹽，草酸鹽，琥珀酸鹽，酒石酸鹽，水楊酸鹽，甲苯磺酸鹽，乳酸鹽，萘磺酸鹽，蘋果酸鹽，扁桃酸鹽，甲磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽。堿加成鹽的實例包括無機鹽，如例如，鈉、鉀、鈣和銨鹽，和有機堿鹽，如例如乙二胺、乙醇胺、N，N-二亞烷基乙醇胺、三乙醇胺和堿性氨基酸鹽。

在本發(fā)明中，式I的化合物的藥用鹽可以優(yōu)選為鹽酸鹽，氫溴酸鹽，氫碘酸鹽，硫酸鹽，硫酸氫鹽，氨基磺酸鹽，硝酸鹽，磷酸鹽，檸檬酸鹽，甲磺酸鹽，三氟乙酸鹽，谷氨酸鹽，葡糖醛酸鹽，戊二酸鹽，蘋果酸鹽，馬來酸鹽，琥珀酸鹽，富馬酸鹽，酒石酸鹽，甲苯磺酸鹽，水楊酸鹽，乳酸鹽，萘磺酸鹽或乙酸鹽，并且更優(yōu)選乙酸鹽。

在本發(fā)明中，當將式I的化合物或其藥用鹽用于治療MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤時，這優(yōu)選選自MGMT陽性多形性成膠質(zhì)細胞瘤、彌漫性(WHO II級)星形細胞瘤和間變性(WHOIII級)星形細胞瘤，并且最優(yōu)選為MGMT陽性多形性成膠質(zhì)細胞瘤。

在本發(fā)明中，當將式I的化合物或其藥用鹽用于治療轉(zhuǎn)移性腦癌時，這優(yōu)選選自轉(zhuǎn)移性乳腺癌、轉(zhuǎn)移性系統(tǒng)性淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性肺癌、轉(zhuǎn)移性黑素瘤、轉(zhuǎn)移性肉瘤和轉(zhuǎn)移性胃腸癌，并且最優(yōu)選轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

根據(jù)本發(fā)明第一、第二和第三方面施用于患者的式I的化合物或其藥用鹽和包含其的藥物的治療有效量是以下量，所述量以適用于任何藥物治療的合理的效益/風險比賦予對所治療的受試者根據(jù)本發(fā)明的治療效果。治療效果可以是客觀的(即，通過某種測試或標記可測量的)或主觀的(即，受試者給出效果指示或感覺)。認為根據(jù)本發(fā)明的式I的化合物或其藥用鹽的有效量是這樣的量，其中以0.1至70mg/kg患者體重(例如，0.5至50mg/kg體重，如1，5，10，20，30，40or 50mg/kg體重)的劑量范圍包括式I的化合物或其藥用鹽。

對于任何具體患者的特定治療有效劑量水平將取決于各種因素，所述因素包括被治療的病癥和病癥嚴重性；使用的具體化合物的活性；使用的具體組合物；患者的年齡，體重，整體健康，性別和飲食；給藥時間，給藥途徑和使用的具體化合物的排泄率；治療持續(xù)時間；與使用的具體化合物組合或同時使用的藥物；和醫(yī)藥領(lǐng)域公知的類似因素。

根據(jù)本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽和包含它們的藥物的給藥形式的適當實例非限制性地包括口服、局部、腸胃外、舌下、直腸、陰道、經(jīng)眼和鼻內(nèi)。腸胃外給藥包括皮下注射，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。優(yōu)選地，將式(I)的化合物或其藥用鹽和包含它們的藥物腸胃外施用，并且最優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。

優(yōu)選地，將式I的化合物或其藥用鹽以0.1mg/kg至70mg/kg患者體重的劑量水平靜脈內(nèi)施用于需要其的患者，并且最優(yōu)選以0.5mg/kg至50mg/kg患者體重的劑量水平靜脈內(nèi)施用于需要其的患者。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的第一、第二和第三方面中，可以優(yōu)選將式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物在治療周期的第1天、第8天和第15天、在治療周期的第1天和第8天或僅在治療周期的第1天施用于需要其的患者。

在本發(fā)明第一、第二和第三方面的另一個優(yōu)選實施方案中，出人意料地發(fā)現(xiàn)式I的化合物及其藥用鹽當與放療聯(lián)合施用時顯著更有效，并且實際上在體內(nèi)和體外研究中似乎與放療都具有協(xié)同效應(yīng)。因此，在本發(fā)明第一、第二和第三方面中，可以將式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物用于治療需要其的患者，其中在用所述式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物治療之前或之后，還為需要其的患者提供放療。優(yōu)選地，在用所述式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物治療之前，為所述患者提供放療治療?？梢砸赃B續(xù)5天1至5Gy并且優(yōu)選以連續(xù)5天2Gy的劑量提供放療。

在本發(fā)明第一、第二和第三方面的另一個優(yōu)選實施方案中，所述治療進一步包括向需要其的患者施用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑，并且所述式I的化合物或其藥用鹽和所述血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑可以同時、順序或分開施用，并且優(yōu)選同時施用。優(yōu)選地，所述血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑是貝伐珠單抗。

在本發(fā)明第一、第二和第三個實施方案的另一個優(yōu)選實施方案中，所述治療還包括向需要其的患者施用聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑，并且所述式I的化合物或其藥用鹽和所述聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑可以同時、順序或分開施用，并且優(yōu)選同時施用。優(yōu)選地，所述聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑選自rucaparib、奧拉帕利(olaparib)和veliparib。

在本發(fā)明第一、第二和第三個實施方案的另一個優(yōu)選實施方案中，所述治療還包括向需要其的患者施用PD-1/PDL-1(免疫檢查點)抑制劑，并且所述式I的化合物或其藥用鹽和所述PD-1/PDL-1(免疫檢查點)抑制劑可以同時、順序或分開施用，并且優(yōu)選同時施用。優(yōu)選地，所述PD-1/PDL-1(免疫檢查點)抑制劑是伊匹木單抗。

當意欲用于口服給藥時，本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以是固體或液體形式，其中半固體、半液體、混懸液和凝膠形式被包括在本文中考慮為固體或液體的形式內(nèi)。

本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以使用藥學(xué)領(lǐng)域公知的方法制備用于給藥。適當?shù)乃幬镏苿┖洼d體的實例描述在E.W.Martin的"Remington′s Pharmaceutical Sciences"中。

作為用于口服給藥的固體組合物，本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以配制成粉末、顆粒、壓縮片劑、藥丸、膠囊、口香糖、糯米紙囊劑(wafer)等形式。該固體組合物典型地含有一種或多種惰性稀釋劑，作為包含所有活性劑的單一片劑或作為各自包含本發(fā)明的組合的單一活性劑的多個分開的固體組合物(在試劑盒的情形中)。另外，可以存在以下中的一種或多種：粘合劑如羧甲基纖維素，乙基纖維素，微晶纖維素，或明膠；賦形劑，如淀粉，乳糖或糊精，崩解劑，如海藻酸，海藻酸鈉，玉米淀粉等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；助流劑，如膠體二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷油，水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑；和著色劑。

當本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物是膠囊形式(例如，明膠膠囊)時，除了上述類型的材料以外，它還可以含有液體載體，如聚乙二醇，環(huán)糊精或脂肪油。

本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以是液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液劑、乳劑或混懸劑。該液體可以用于口服給藥或者用于通過注射遞送。當意欲用于口服給藥時，本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物可以包含甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和增香劑中的一種或多種。在用于通過注射給藥的本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物中，還可以包括表面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑和等張劑中的一種或多種。

優(yōu)選的給藥途徑是腸胃外給藥，包括但不限于，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，靜脈內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，硬膜外，鼻內(nèi)，腦內(nèi)，心室內(nèi)，鞘內(nèi)，陰道內(nèi)或透皮。優(yōu)選的給藥方式留待執(zhí)業(yè)醫(yī)生判斷，并且將部分取決于醫(yī)學(xué)病癥的部位(如癌癥部位)。在更優(yōu)選的實施方案中，靜脈內(nèi)施用本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物。

本發(fā)明第一、第二和第三方面的液體的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物，無論它們是溶液、混懸液或其他類似形式，還可以包括以下中的一種或多種：無菌稀釋劑，如注射用水，鹽水溶液，優(yōu)選生理鹽水，林格氏溶液，等張氯化鈉，固定油，如合成甘油單酯或二酯，聚乙二醇，甘油，或其他溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇，或?qū)αu基苯甲酸甲酯；和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖。腸胃外組合或組合物可以被包封在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓿管、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的輔劑。

可以通過任何便利的途徑，例如通過輸注或推注，通過上皮或皮膚黏膜襯里吸收，并且優(yōu)選通過推注，施用本發(fā)明第一、第二和第三方面的式I的化合物或其藥用鹽或包含它們的藥物。

實施例

在以下實施例中，將具有下式I的化合物稱為EDO-S101。

如WO-A-2010/085377的實施例6所述，制備EDO-S101。將EDO-S101溶解在DMSO(100X母液)中并保存在4℃，之后在使用日懸浮在介質(zhì)中。

實施例1在Sprague-Dawley大鼠中EDO-S101的CNS藥物代謝動力學(xué)分析

在以40mg/kg尾靜脈注射EDO-S101后在大鼠中確定CNS藥物代謝動力學(xué)。通過微透析探針以18時間間隔從血液和腦室中收集微透析液樣品。用UV檢測(CE-UV)，通過毛細管電泳，確定這些樣品中的藥物濃度，接著計算各種藥物代謝動力學(xué)參數(shù)。

使用氣態(tài)異氟烷(在20％氧和80％氮氣的混合物中的1％異氟烷)將六只大鼠麻醉，并且固定在立體定位的框架(KOPF Instruments，Tujunga，CA)中。在整個程序中保持麻醉。將每個引導(dǎo)套管(CMAMicrodialysis Inc.，Acton，MA)立體定位地植入側(cè)腦室(AP-0.9，L 1.6，V 3.4，相對于前囟和頭骨)，然后通過螺釘和牙科粘合劑固定頭骨。在外科手術(shù)后，將每只大鼠單獨收容，隨意提供食物和水3天，以從插管手術(shù)中恢復(fù)。在清醒的自由移動的大鼠上進行微透析實驗。在實驗當日，將引導(dǎo)套管中的管心針用微透析探針(CMA/11，具有4mm膜，CMA Microdialysis Inc.，Acton，MA)替換，并且將血管微透析探針(CMA/20，具有4mm膜，CMA Microdialysis Inc.，Acton，MA))植入頸靜脈。所述探針具有進口管，所述進口管與注射器連接以遞送人工腦脊髓液(146mM NaCl，1.2mM CaCl₂，3mM KCl，1mM MgCl₂，1.9mM Na₂HPO₄，0.1mM NaH₂PO₄，pH 7.4)到腦室中并且將Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS)遞送到血液中，流速為0.5μl/min。出口管與微級分收集器連接，以在4℃收集微透析液。在劑量給藥之前，允許大鼠恢復(fù)至少24小時。在(靜脈內(nèi))注射EDO-S101之后，在3小時內(nèi)收集十八個樣品。將所有樣品加樣至毛細管電泳，用UV檢測(CE-UV)以確定腦脊髓液(CSF)和血液中的EDO-S101的濃度。在實驗后用CO₂吸入將大鼠處死。在每個實驗結(jié)束時通過目檢證實探針的位置。

通過CE-UV(Agilent 3D CE)測量微透析液中的EDO-S101。簡而言之，用1M氫氧化鈉將毛細管預(yù)先處理2分鐘，用水預(yù)先處理2分鐘和用運行緩沖液[100mmol/l乙酸銨溶液(用乙酸調(diào)節(jié)至pH 3.1)-乙腈(50∶50，v/v)]預(yù)先處理3分鐘。將樣品以0.7psi的壓力注射5s并且注射體積約為5nl。在注射后，將EDO-S101在50μm I.D.和50/65cm長度(有效長度/總長度)的熔融二氧化硅毛細管中在15kv和25℃下分離。以UV在300nM檢測來自EDO-S101的吸光度。在光電倍增管(PMT)上收集發(fā)射。

為了對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用雙向重復(fù)測量ANOVA，接著是Tukey’s檢驗。認為P＜0.05是顯著的。作為CSF和血液曲線下面積(AUC)的比率，確定CNS穿透。

在分析結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)EDO-S101以16.5％的CNS穿透，很好地穿過血腦屏障(參見圖1)。其可以以11.2μM的C_max獲得高CNS濃度。因此，EDO-S101對于腦腫瘤的治療應(yīng)用是理想的。還顯示其具有非常短的在血液中約6分鐘和在腦中約9分鐘的半衰期。由于藥物濃度是基于EDO-S101在300nM的UV波長下的吸光度確定的，所以所有測量值是關(guān)于未代謝化的EDO-S101的。結(jié)果總結(jié)在以下表1中。

表1

實施例2 EDO-S101和已知化合物對于各種MGMT陽性和陰性細胞系的體外活性測試

設(shè)計體外實驗，其中使用一系列代表MGMT陰性和MGMT陽性腫瘤細胞的GBM細胞系。

化合物：1-100μM EDO-S101，1-50μM替莫唑胺(TMZ)，1-50μM替莫唑胺+500nM伏林司他，1-40μM苯達莫司汀，1-40μM苯達莫司汀和500nM伏林司他。

細胞系：A172，LN229，SNB19，SW1783，U251，U373和U87：MGMT陰性細胞系；LN18，Mz54，T98G，U138，U118：MGMT陽性細胞系

使用了十二種代表III級和IV神經(jīng)膠質(zhì)瘤并且具有不同MGMT表達、藥物和放療敏感性的成膠質(zhì)細胞瘤細胞系和五種患者來源的成膠質(zhì)細胞瘤干細胞(參見以上)。將四種來源于患者的成膠質(zhì)細胞瘤干細胞(由Hotchkiss Brain Institute，醫(yī)學(xué)系，University of Calgary，Calgary，Alberta，加拿大的J.Gregory Cairncross，和Samuel Weiss友情提供)和一種來自米蘭University la Bicocca的Angelo Vescovi教授的轉(zhuǎn)染熒光素酶的PTC#8在成分確定的無血清培養(yǎng)基(SFM)中和以非貼壁球體培養(yǎng)的方式培養(yǎng)。將細胞重懸浮于無血清的補充有20ng/ml表皮生長因子(Sigma-Aldrich)，20ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(Sigma-Aldrich)，B-27補充劑1X(Gibco，Life Technologies)和抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。在將3×10³個細胞鋪平板于具有干細胞培養(yǎng)基的96孔平板中之后，直接加入EDO-S101處理。在倒置顯微鏡下以×4放大率，在處理后5天對球體計數(shù)。如果球體具有至少15個細胞，將球體計數(shù)。

將細胞以2x 10⁴個細胞/ml的密度接種到24孔平板中。將細胞留下貼壁并在5％FCS DMEM中培養(yǎng)24小時。此刻之后，將細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下維持。每天用倒置相差顯微照相機(Nikon Diaphot，東京，日本)進行形態(tài)學(xué)控制，之后將細胞用胰蛋白酶處理并計數(shù)。將用胰蛋白酶處理并重懸浮在1.0ml鹽水中的細胞用NucleoCounterTM NC-100(自動細胞計數(shù)系統(tǒng)，Chemotec，Cydevang，DK)計數(shù)，以便評估細胞生存力。所有實驗一式三份進行。通過GraFit方法(Erithacus Software Limited，Staines，UK)計算IC₅₀值。使用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT；Sigma-Aldrich)測定測量細胞生存力。

還如上所述測定所有十二種細胞系針對苯達莫司汀和伏林司他的IC₅₀和IC₂₀值。接下來，進行使用固定劑量的伏林司他(IC₂₀值)和改變劑量的苯達莫司汀的組合測定。計算苯達莫司汀當與伏林司他組合時的新IC₅₀值。

如從圖2可以看出的，U251，U373，SW1783，A172和U87 GBM細胞系對于TMZ高度敏感，而LN229，SNB19和U138中等敏感。然而，MGMT陽性GBM細胞系LN18，Mz54，T98G和U118對于TMZ具有抗性。

在分開的實驗中，將TMZ與500nM伏林司他組合使用。已知伏林司他與TMZ在GBM細胞系中具有協(xié)同作用。如從圖3張可以看出，盡管MGMT陽性GBM細胞系LN18和U118對于該組合時敏感的，但是T98G和Mz54仍然是極具抗性的。T98G的IC₅₀被降低，但是其并非在人中可以實現(xiàn)的劑量范圍。

圖4顯示GBM細胞系中沒有一種對于苯達莫司汀高度敏感，但是LN18，LN229，SNB19，U138，U251，U373，SW1783和U87 GBM細胞系對于苯達莫司汀中度敏感，而A172，Mz54，T98G和U118對苯達莫司汀具有抗性。如從圖5中可以看出，當苯達莫司汀與500nM伏林司他組合時，獲得了與TMZ和伏林司他非常類似的結(jié)果，即所有細胞系(除了Mz54和T98G以外)是高度敏感的，而T98G的IC₅₀降低，它不是人中可實現(xiàn)的劑量范圍。

與其他單一化合物和組合比較，圖6張十二種測試的細胞系的IC₅₀曲線顯示了所有十二種細胞系，包括所有MGMT陽性細胞系，對于EDO-S101是高度敏感的。這顯示EDO-S101是針對MGMT陰性和MGMT陽性GBMs二者的高度有希望的治療劑。

對于不同細胞系的IC₅₀值的總結(jié)顯示在以下表2中。

表2

實施例3 EDO-S101在小鼠模型中對于多形性成膠質(zhì)細胞瘤的體內(nèi)評估

基于通過生物發(fā)光成像確定的腫瘤生長和通過Kaplan-Meier分析確定的存活分析，在鼠腦腫瘤模型中確定EDO-S101針對GBM的治療活性。

使用立體定位平臺，在麻醉下在無胸腺小鼠中通過腦內(nèi)注射3X10⁵個轉(zhuǎn)染熒光素酶的GBM12細胞，產(chǎn)生鼠腦腫瘤模型。GBM12是MGMT陰性腫瘤細胞系。在外科手術(shù)之前，將十八周齡的無胸腺小鼠進行最少7天適應(yīng)/隔離。在無菌條件下在層流凈化罩中進行外科手術(shù)。給予Tylenol 300mg/kg PO，以用于在外科手術(shù)前鎮(zhèn)痛24小時，手術(shù)后持續(xù)48小時。通過吸入1-2％異氟烷實現(xiàn)麻醉。在小鼠變得完全被麻醉后，將其置于Kopf立體定位儀器中。將少量BNP抗生素軟膏(桿菌肽，新霉素和多粘菌素的混合物)涂抹在其眼睛上以防止手術(shù)期間的感染和角膜損傷。將一條軟織物放在小鼠身體和尾巴上以防止手術(shù)期間過度熱損失。頭皮區(qū)域用2％聚維酮碘(Betadine)清潔并用棉尖涂藥器干燥。在頭皮中進行中線矢狀切割。

根據(jù)通過參考Franklin和Paxinos的小鼠腦地圖測定的坐標(AP：0.5mm，LM：2.5mm)，在左頭骨上用外科鉆頭(Kopf)或Dremel鉆頭鉆一個小的鉆孔。將硬腦脊膜外科暴露，并將具有26S-號傾斜針頭的10μl-Hamilton注射器放低到左腦半球中直至3mm的深度，并緩慢輸入(0.5μl/min)5μl的3X10⁵個轉(zhuǎn)染了熒光素酶的GBM12細胞腫瘤細胞。將針頭放置原位達5分鐘以防止回流，然后緩慢取出。用傷口夾密封皮膚。在外科手術(shù)后，將小鼠在溫暖環(huán)境中康復(fù)并且當運動能力恢復(fù)時返回至它們的籠子中。將籠子放在加熱墊頂部以最小化康復(fù)期間的身體熱損失。在手術(shù)后監(jiān)視小鼠，至少一天兩次，共5天，或直至康復(fù)完成。在腦內(nèi)腫瘤細胞移植后+4天開始，然后隨后在第+11天和第+18天，通過尾靜脈施用EDO-S101(60mg/kg體重)或苯達莫司汀(50mg/kg體重)。將肢體麻痹作為存活分析的終點。

在腦內(nèi)注射GBM細胞后，將所有小鼠進行生物發(fā)光成像(BLI)，從腦內(nèi)注射后第4天開始，一周兩次，以監(jiān)視實時體內(nèi)腫瘤生長。使用Xenogen Lumina光學(xué)成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA)進行BLI。用異氟烷將小鼠麻醉，之后以150mg/kg的劑量進行熒光素的腹膜內(nèi)注射，提供熒光素酶的飽和底物濃度。在熒光素注射后10分鐘記錄到峰值發(fā)光信號。使用Living Image軟件(Xenogen，Alameda，CA)限定涵蓋顱內(nèi)信號區(qū)域的目標區(qū)域，并且記錄總光子/s/立體弧度/cm2。

使用ANOVA來確定每個時刻實驗組之間的差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性。使用Prism4軟件(GraphPad Software，LaJolla CA)產(chǎn)生Kaplan-Meier存活曲線，以對數(shù)秩檢驗得出曲線之間的統(tǒng)計學(xué)差異。認為P＜0.05是顯著的。

在GBM(GBM12)的該患者衍生的異種移植物模型中，將EDO-S101以IV 60mg/kg每周一次在腦內(nèi)移植腫瘤細胞后+4，+11，+18天施用(MTD劑量)。將苯達莫司汀以IV 50mg/kg在+4，+11，+18天給予(MTD劑量)。發(fā)現(xiàn)EDO-S101具有顯著的治療活性，抑制腫瘤生長和延長存活，中值存活為66天，相比之下，苯達莫司汀為58天，并且在非處理對照中為52天(參見圖7a和7b)。EDO-S101具有優(yōu)異的針對該MGMT陰性多形性成膠質(zhì)細胞瘤的治療活性。

使用細胞系U87G和U251G，以類似的方式采用上述步驟。再次，通過尾靜脈靜脈內(nèi)施用EDO-S101(60mg/kg)，但是在這些實驗中，將其在第1，8和15天施用。替代苯達莫司汀，施用TMZ作為比較，16mg/kg，連續(xù)5天，po。在28天之后處死小鼠。

對于已經(jīng)植入U251腫瘤的小鼠，在圖8中進展時間(TTP)概率(％)針對時間的圖表顯示，對于用EDO-S101處理的小鼠的TTP顯著長于對于對照小鼠和用TMZ處理的那些觀察到的。對于移植了U87腫瘤的小鼠觀察到了類似的TTP的顯著增加，EDO-S101的TTP顯著長于對照和TMZ兩者(參見圖9)。

實施例4在多形性成膠質(zhì)細胞瘤的鼠模型中對于放療和替莫唑胺(單獨或組合)EDO-S101(單獨或與放療組合)的體內(nèi)評估

在第一個實驗中，將U251，U87和T98G細胞系用單獨放療或用放療和EDO-S101處理。

對于克隆存活，將指數(shù)生長的細胞(70％匯合)在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用適當濃度的EDO-S101或載體(0.1％的DMSO終濃度)處理24小時。使用6MV線性加速器Elekta Synergy，使用臨床上校準的30×30cm的輻射面積進行腫瘤細胞輻射。在完全裝填培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶之上和之下放置兩cm厚的有機玻璃板以補償積累效應(yīng)(build-up effect)。除了輻射暴露以外，以與輻射的細胞一樣處理非輻射對照。在處理之后，將細胞以適當濃度(1,000個細胞)稀釋并且再接種在新的100mm組織培養(yǎng)皿中(一式三份)并溫育14天。在第14天，去除培養(yǎng)基，并將克隆用甲醇：乙酸(10∶1，v/v)固定，并用結(jié)晶紫染色。計數(shù)含有超過50個細胞的克隆。計算平板效率(PE)為觀察到的克隆數(shù)/鋪平板的細胞數(shù)。計算存活分數(shù)為與對照中形成的數(shù)目相比在處理的平皿中形成的克隆數(shù)。根據(jù)線性-二次公式：S(D)/S(O)＝exp-(aD+bD2)，通過加權(quán)的、分層的線性回歸擬合數(shù)據(jù)，使用SPSS(Chicago，IL)統(tǒng)計軟件分析存活曲線。

對于MGMT陰性U251MG成膠質(zhì)細胞瘤細胞系，測量的IC₅₀對于EDO-S101為6.60μM(相比之下，對于苯達莫司汀為30μM，并且對于替莫唑胺為20μM)。

對于MGMT陰性U87G成膠質(zhì)細胞瘤細胞系，測量的IC₅₀對于EDO-S101為1.36μM(相比之下，對于苯達莫司汀為50μM，并且對于替莫唑胺為20μM)。

對于MGMT陽性T98G成膠質(zhì)細胞瘤細胞系，測量的IC₅₀對于EDO-S101為7.70μM(相比之下，對于苯達莫司汀為52μM，并且對于替莫唑胺為＞100μM)。

如從圖10可以看出，在所有3種GBM細胞系中，與單獨放療相比，當放療與一個劑量的EDO-S101(2.5μM或5μM)聯(lián)用時，成膠質(zhì)細胞瘤細胞的％存活率顯著降低。

接下來，采用實施例3的步驟，使用GBM細胞系U251和U87，在小鼠中制備GBMs皮下(s.c.)異種移植物模型。

將如上制備的U251小鼠進行放療(2Gy，連續(xù)5天)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或僅對照處理。在任何輻射之前，小鼠用氯胺酮(25mg/ml)/甲苯噻嗪(5mg/ml)的混合物麻醉。麻醉的攜帶腫瘤的小鼠以2Gy的劑量接收病灶輻射，連續(xù)5天。使用X-射線線性加速器以200cGy/min的劑量速率在室溫遞送輻射。將所有小鼠用特別設(shè)計的鉛裝置屏蔽，以允許輻射到右后肢。將小鼠保持在這些條件下直至所有輻射完成。

根據(jù)實施例3的步驟進行GBM的進展研究。進展時間概率(％)針對時間的圖表顯示在圖11中。從這很明顯，用EDO-S101處理的小鼠的進展時間要顯著長于對于放療處理的腫瘤所觀察到的。

在后續(xù)實驗中，將以相同方式制備的U251小鼠進行以下處理：當前的放療和替莫唑胺的金標準處理(2Gy，連續(xù)5天，和16mg/kg，連續(xù)5天，po)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)處理，用EDO-S101和放療(2Gy，連續(xù)5天，和60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或?qū)φ仗幚怼Ｔ趫D12中顯示了進展時間概率(％)針對時間的圖表。從這很明顯，用EDO-S101和放療處理的小鼠的進展時間要顯著長于用單獨EDO-S101處理的腫瘤所觀察到的。此外，對于放療和EDO-S101的組合的進展時間要顯著長于對于用放療和替莫唑胺(當前的金標準處理)處理的腫瘤所觀察到的。

遵照相同的實驗順序，但是這次是使用GBM細胞系U87在小鼠中制備的GBM的皮下異種移植物模型。在第一個實驗中，將如上制備的U87小鼠進行以下處理：放療(2Gy，連續(xù)5天)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或僅對照處理。進行GBM進展的研究。圖13中顯示了進展時間概率(％)針對時間的圖表。從這很明顯，用EDO-S101(在圖13中稱為NL101)處理的小鼠的進展時間要顯著長于對于放療處理的腫瘤所觀察到的。

在與關(guān)于U251小鼠所用類似的后續(xù)實驗中，將以相同方式制備的U87小鼠進行以下處理：當前的的金標準處理-放療和替莫唑胺(2Gy，連續(xù)5天，和16mg/kg，連續(xù)5天，po)，用EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)處理，用EDO-S101和放療(2Gy，連續(xù)5天，和60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或?qū)φ仗幚?。圖14中顯示了進展時間概率(％)針對時間的圖表。從這很明顯，用EDO-S101和放療處理的小鼠的進展時間要顯著長于對于用單獨EDO-S101處理的腫瘤所觀察到的。此外，對于放療和EDO-S101的組合的進展時間要顯著長于對于放療和替莫唑胺(當前的金標準處理)所觀察到的。還應(yīng)當注意，對于用單獨EDO-S101處理的U87小鼠觀察到的進展時間確實要大于用組合的放療和替莫唑胺處理所取得的進展時間。

腫瘤的進展時間從對于U251G小鼠異種移植物模型的對照的約17-18天增加至對于放療和替莫唑胺的組合的42天，到對于單獨的EDO-S101的超過50天(顯著性P＝0.924)，到對于EDO-S101和放療的組合的顯著超過50天(顯著性P＝0.0359)。

發(fā)現(xiàn)腫瘤的進展時間從對于U87G小鼠異種移植物模型的對照的約15天增加至對于放療和替莫唑胺的組合的35天，到對于單獨的EDO-S101的40天(顯著性P＝2372)，到對于EDO-S101和放療的組合的顯著超過50天(顯著性P＝0.0001)。

實施例5腫瘤的組織學(xué)評估：U251-轉(zhuǎn)染熒光素酶的細胞的原位移植模型

將按照實施例3的步驟用U251-熒光素酶同位素地(isotopically)轉(zhuǎn)染的小鼠用以下處理：放療(2Gy，連續(xù)5天)，替莫唑胺(16mg/kg，連續(xù)5天，po)，放療和替莫唑胺(2Gy，連續(xù)5天和16mg/kg，連續(xù)5天，po)，EDO-S101(60mg/kg，靜脈內(nèi)，在治療周期的第1，8和15天)或?qū)φ蛰d體。

使用Hamamatsu成像系統(tǒng)(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA)監(jiān)視顱內(nèi)腫瘤生長。將小鼠用2％至4％異氟烷(Baxter，Deerfield，IL，USA)麻醉，接著腹膜內(nèi)注射150mg/kg d-熒光素(In Vivo Imaging Solutions)。同時測量五只動物，并且將發(fā)光照相機設(shè)置為1分鐘曝光，中等合并(medium binning)，1f/光圈(stop)，封閉激發(fā)濾鏡，和開啟發(fā)射濾鏡。將照相機設(shè)置為2s曝光，中等合并，和8f/光圈。將視野設(shè)定為22cm以一次捕獲五只小鼠。使用相同的設(shè)定，以一周一次的基礎(chǔ)獲取系列圖像。使用Living Image軟件(Caliper Life Sciences)定量生物發(fā)光強度。

在任何輻射之前，將小鼠用氯胺酮(25mg/ml)/甲苯噻嗪(5mg/ml)的混合物麻醉。麻醉的攜帶腫瘤的小鼠以2Gy的劑量接收病灶輻射，連續(xù)5天。使用X-射線線性加速器以200cGy/min的劑量速率在室溫遞送輻射。將所有小鼠用特別設(shè)計的鉛裝置屏蔽，以允許輻射到右后肢。將小鼠保持在這些條件下直至所有輻射完成。

使用下列順序獲得橫平面的所有圖像：橫向T2-加權(quán)渦輪自旋回波(turbo spin-echo，TSE)順序(重復(fù)時間[TR]微秒/回波時間[TE]微秒)6766/120，獲得信號數(shù)量4，192x 192矩陣)，應(yīng)用的切片厚度0.9mm，交叉間隙(intersection gap)0.0mm，和傾倒角160°。視野為36x 60mm²，其整體包括在腫瘤中，獲得的三維像素尺寸為0.3x 0.3x 1.0mm³。

連續(xù)變量總結(jié)為平均值和標準偏差(SD)或中值和中值的95％CI。對于非正態(tài)分布的連續(xù)變量，通過進行Kruskal-Wallis檢驗建立對照和處理組之間的統(tǒng)計學(xué)比較。對于正態(tài)分布的連續(xù)變量，通過對未成對數(shù)據(jù)(對于兩個比較)進行ANOVA檢驗或進行Student t檢驗，建立對照和處理組之間的統(tǒng)計學(xué)比較。

在開始不同治療方案后50天，處死小鼠并在用對照、EDO-S101、替莫唑胺、以及放療和替莫唑胺進行處理的小鼠中，將最終顱內(nèi)損傷可視化。結(jié)果顯示在圖15和16中。使用EDO-S101和替莫唑胺研究獲得類似的結(jié)果，兩者都顯示13只小鼠中5只(38.5％)具有某個級別的腫瘤，與此對比，在對照中11只小鼠中8只(72.7％)具有某個級別的腫瘤。然而，EDO-S101處理的13只小鼠中僅有1只顯示大的損傷，而13只替莫唑胺處理的小鼠中有2只顯示大的損傷。在放療和替莫唑胺研究中，11只小鼠中僅2只(18.2％)在研究結(jié)束時顯示損傷，盡管這些兩者都是大損傷。從這可以得出結(jié)論，EDO-S101在預(yù)防GBMs擴散方面高度有效。

EDO-S101在預(yù)防GBMs擴散方面的功效進一步在圖17中強調(diào)，該圖顯示了存活概率(％)針對時間(天)的圖表。用EDO-S101處理的小鼠的存活概率顯著大于關(guān)于用放療或替莫唑胺處理的那些的存活概率。僅用放療和替莫唑胺的組合處理的小鼠顯示了與單獨EDO-S101相比更高的總存活概率。

實施例6 EDO-S101在原發(fā)性CNS淋巴瘤鼠模型中的體內(nèi)評估

重復(fù)實施例3的步驟，除了用1x 10⁵個轉(zhuǎn)染了熒光素酶的OCI-LY10B淋巴瘤細胞建立鼠模型，產(chǎn)生原發(fā)性CNS淋巴瘤模型。在腦內(nèi)移植OCI-LY10B淋巴瘤細胞后第+4，+11和+18天，將EDO-S101(60mg/kg體重)，苯達莫司汀(50mg/kg體重)和對照通過尾靜脈靜脈內(nèi)施用于分開的測試小鼠組。EDO-S101和苯達莫司汀兩者都顯著抑制腫瘤生長并且延長存活，中值存活分別為62天和54天，與此對比，非處理對照為48天(參見圖18a和18b)。因此，EDO-S101似乎是原發(fā)性CNS淋巴瘤的有希望的治療。

實施例7 EDO-S101在腦的三陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌(Triple Metastatic Breast Cancer)的小鼠模型中的體內(nèi)評估

重復(fù)實施例3的步驟，除了用1x 10⁵個轉(zhuǎn)染了熒光素酶的MB-468乳腺癌細胞建立小鼠模型，產(chǎn)生原發(fā)性CNS淋巴瘤模型。在腦內(nèi)移植MB-468乳腺癌細胞后第+4天，將EDO-S101(60mg/kg體重)，苯達莫司汀(50mg/kg體重)和對照通過尾靜脈靜脈內(nèi)施用于分開的測試小鼠組。EDO-S101顯示了顯著的治療活性，抑制腫瘤生長并且延長存活，中值存活為71天，與此對比，苯達莫司汀為62天，并且非處理對照為55天(參見圖19a和19b)。因此，EDO-S101似乎是轉(zhuǎn)移性腦癌的特別有希望的治療。

總之，實驗顯示了EDO-S101穿過血腦屏障的能力是非常好的。這使得它成為治療腦癌的有希望的候選物。實驗數(shù)據(jù)進一步顯示，其不僅具有針對MGMT陰性GBMs的活性，而且具有針對MGMT陽性GBMs的活性，使得其高度有希望作為治療MGMT陽性GBMs和其他MGMT陽性星形膠質(zhì)細胞腦腫瘤的治療劑，因為對于這些還未開發(fā)出療法。還顯示了它在原發(fā)性CNS淋巴瘤和轉(zhuǎn)移性腦癌中都顯著延長中值存活，再次使得它是兩種病癥的非常有希望的候選治療劑。數(shù)據(jù)還顯示，當將EDO-S101與放療組合施用時，則它在GBM的治療中顯示了與單獨EDO-S101相比顯著改善的活性。