本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防多發(fā)性硬化的方法，所述方法包括施用二十二碳六烯酸(DHA)和羥脯氨酸的綴合物。

發(fā)明背景

4-羥脯氨酸(4-羥基-2-吡咯烷-羧酸，本文稱(chēng)之為羥脯氨酸)是天然存在的氨基酸。4-羥脯氨酸被認(rèn)為不是必需氨基酸，并且此外，4-羥脯氨酸的藥理活性在本領(lǐng)域中是未知的。

然而，某些包含N-取代的羥脯氨酸衍生物的取代的肽為已知的ACE-抑制物，并且已確立了它們控制高血壓的能力(例如卡托普利；賴(lài)諾普利；依那普利和莫維普利)。奧沙西羅(一種另外的N-?；苌?具有消炎、抗風(fēng)濕和傷口愈合活性。用于腸胃外營(yíng)養(yǎng)的市售輸注物偶爾包含脯氨酸作為佐劑(例如，與其他氨基酸、碳水化合物和電解質(zhì)組合)。

某些ω-3和ω-6脂肪酸被認(rèn)為是必需脂肪酸，盡管是人類(lèi)健康所必需的，但它們不能由人體產(chǎn)生。已知其他ω脂肪酸是條件必需的，即，在某些條件下是人體必需的。ω脂肪酸可見(jiàn)于魚(yú)類(lèi)、海產(chǎn)品和某些植物中。ω脂肪酸也稱(chēng)為多不飽和脂肪酸(PUFA)，在腦功能以及正常的生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。同時(shí)，由于它們可降低心臟病的風(fēng)險(xiǎn)，它們變得受歡迎。研究顯示，ω脂肪酸減少炎癥，并可有助于降低慢性疾病諸如心臟病、癌癥和關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)。ω脂肪酸在腦中高度集中，并且顯示對(duì)認(rèn)知和行為功能是重要的。ω脂肪酸缺乏的癥狀包括疲勞、記憶力差、皮膚干燥和心臟問(wèn)題。

多發(fā)性硬化(MS)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的慢性疾病，與脫髓鞘和神經(jīng)退行性變相關(guān)。MS表現(xiàn)出炎性自身免疫性紊亂的許多特點(diǎn)(hallmark)，包括血腦屏障(BBB)的破壞；淋巴細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞至病變部位的募集；多種CNS病變的存在。已提出了多種病因，包括自身免疫、致病因子(infectious agent)、環(huán)境觸發(fā)物和遺傳因素。然而，存在實(shí)質(zhì)性證據(jù)表明，失調(diào)的免疫應(yīng)答(包括針對(duì)髓鞘蛋白的免疫機(jī)制)在觸發(fā)疾病發(fā)作中起作用。

通常，MS影響CNS中的腦、脊髓和視神經(jīng)，且不損害(spare)外周神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)根和外周神經(jīng)。MS中炎性和神經(jīng)退行性過(guò)程之間的相互作用通常導(dǎo)致間歇性神經(jīng)失調(diào)(disturbance)(急性惡化事件)，隨后是障礙(disability)的進(jìn)行性累積。在MS發(fā)作(attack)期間，炎癥在稱(chēng)為“斑塊(plaque)”的呈塊狀(patch)的CNS的白質(zhì)區(qū)域中發(fā)生。該過(guò)程之后是腦和脊髓中的髓鞘的破壞，導(dǎo)致功能減退或損失。

發(fā)明概述

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于治療多發(fā)性硬化(MS)或治療多發(fā)性硬化癥狀的方法，所述方法包括施用根據(jù)式MW-001的羥脯氨酸和二十二碳六烯酸(DHA)的綴合物：

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于預(yù)防多發(fā)性硬化(MS)的突發(fā)(outburst)的方法，所述方法包括施用根據(jù)式MW-001的羥脯氨酸和二十二碳六烯酸(DHA)的綴合物：

在一些實(shí)施方案中，提供了一種用于預(yù)防由多發(fā)性硬化(MS)引起的持續(xù)慢性退化(deterioration)的方法，所述方法包括施用根據(jù)式MW-001的羥脯氨酸和二十二碳六烯酸(DHA)的綴合物：

附圖簡(jiǎn)述

本文僅以示例的方式參考附圖描述了本發(fā)明。現(xiàn)詳細(xì)具體參考附圖，強(qiáng)調(diào)的是，所示的細(xì)節(jié)僅以示例的方式并且僅用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明性討論的目的，并且為了提供被認(rèn)為是本發(fā)明的原理和概念方面的最有用和容易理解的描述是什么而呈現(xiàn)。就這一點(diǎn)而言，不試圖以比對(duì)于本發(fā)明的基本理解所必需的更詳細(xì)地顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，結(jié)合附圖的描述使得在實(shí)踐中如何可具體化本發(fā)明的若干形式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯。

圖1為示出了未治療的EAE小鼠、從第0天起用羥脯氨酸和二十二碳六烯酸(DHA)的綴合物即MW-001(本文還稱(chēng)為MWL-001)治療的EAE小鼠和從第10天起用同一綴合物治療的EAE小鼠的平均臨床評(píng)分的圖。

圖2為示出了未治療的EAE小鼠、用MW-001(本文還稱(chēng)為MWL-001)口服治療的EAE小鼠和用MW-001ip治療的EAE小鼠的平均臨床評(píng)分的圖。

圖3為示出了用MP治療的EAE小鼠、用MW-001(本文還稱(chēng)為MWL-001)治療的EAE小鼠和用MW-001+MP(甲基潑尼松龍)治療的EAE小鼠的平均臨床評(píng)分的圖。

圖4為示出了MWL-001對(duì)人類(lèi)淋巴細(xì)胞的活化的體外作用的圖。

圖5(A、B和C)為對(duì)照未治療的EAE動(dòng)物的用H&E染色的脊髓切片的組織病理學(xué)照片。P＝實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)，M＝腦膜浸潤(rùn)，及D＝擴(kuò)散浸潤(rùn)。

圖6(A和B)為在第0天用MWL-001(i.p.)治療的EAE動(dòng)物的用H&E染色的脊髓切片的組織病理學(xué)照片。

圖7(A和B)為在第10天用MWL-001(i.p.)治療的EAE動(dòng)物的用H&E染色的脊髓切片的組織病理學(xué)照片。

具體實(shí)施方式

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，提供了一種用于治療或預(yù)防多發(fā)性硬化(MS)的突發(fā)和/或預(yù)防由MS引起的持續(xù)慢性退化的方法，所述方法包括施用根據(jù)式MW-001的羥脯氨酸和二十二碳六烯酸(DHA)的綴合物：

術(shù)語(yǔ)“治療(treatment)”或“治療(treating)”旨在包括急性癥狀的治療、預(yù)防急性癥狀的復(fù)發(fā)及急性癥狀的改善。注意，“治療(treating)”指癥狀的改善和潛在狀況的消退中的一者或兩者。在許多實(shí)施方案中，化合物或組合物的施用可以不直接作用于疾病狀態(tài)，而是作用于某些惡性癥狀，并且該癥狀的改善導(dǎo)致疾病狀態(tài)的一般性和期望的改善。

如本文使用的，措辭“多發(fā)性硬化”指中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的炎性脫髓鞘疾病，其典型特征為神經(jīng)功能障礙的多種癥狀?？筛鶕?jù)本發(fā)明的教導(dǎo)治療任何類(lèi)型的多發(fā)性硬化(MS)，包括具有非標(biāo)準(zhǔn)行為的復(fù)發(fā)緩解型MS、繼發(fā)進(jìn)展型MS、原發(fā)進(jìn)展型MS、進(jìn)展復(fù)發(fā)型MS和特殊情況的MS(還稱(chēng)為邊界形式的MS)，諸如例如但不限于視神經(jīng)脊髓炎(NMO)、巴洛同心圓硬化(Balo concentric sclerosis)、希爾德病(Schilder disease)、馬爾堡多發(fā)性硬化(Marburg multiple sclerosis)、急性播散性腦脊髓炎(ADEM)和外周神經(jīng)病變的自身免疫性變體。可在任何階段治療疾病，包括但不限于當(dāng)受試者正在經(jīng)歷急性發(fā)作時(shí)治療疾病。根據(jù)一些實(shí)施方案，可長(zhǎng)期治療疾病以預(yù)防爆發(fā)和由其引起的損害、在疾病的發(fā)作(flare up)期間治療疾病以用于降低和預(yù)防退化或兩者。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物在疾病爆發(fā)之前被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，在對(duì)常規(guī)治療諸如用類(lèi)固醇治療耐受和/或不敏感的患者中治療疾病。根據(jù)一些實(shí)施方案，疾病的癥狀通過(guò)如本文詳述的綴合物來(lái)治療。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物被口服施用，可能地以片劑、膠囊、粉末、錠劑(troche)、軟明膠膠囊、糖漿、液體懸液或錠劑(lozenge)的形式。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物以腸胃外制劑的形式，諸如用于皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用的形式被施用。根據(jù)另外的實(shí)施方案，綴合物通過(guò)任何合適的經(jīng)鼻施用、肺部施用、局部地或通過(guò)任何合適的皮膚學(xué)施用來(lái)施用。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物連同任何合適的無(wú)毒藥物載體一起被施用。載體可以是氣體、固體或液體。根據(jù)一些實(shí)施方案，載體選自鹽溶液、水、任何合適的乳液或分散體或其任何組合。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物連同適合用于修飾活性綴合物從制劑釋放的任何成分一起被施用?？墒褂醚訒r(shí)劑，諸如腸溶包衣的明膠膠囊。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可連同任何另外的活性成分一起被施用，所述另外的活性成分諸如但不限于干擾素β1a、干擾素β1b、醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)、米托蒽醌、甲基-潑尼松龍、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、促腎上腺皮質(zhì)激素(adreno-corticotrophic hormone)(ACTH)、促腎上腺皮質(zhì)素(corticotrophin)、β干擾素、皮質(zhì)類(lèi)固醇、那他珠單抗芬戈莫德(fingolimod)醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)米托蒽醌、特立氟胺或其任何合適的組合。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約1mg/kg至1000mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約1-10mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約10-50mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約50-100mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約100-200mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約200-300mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約300-400mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約400-500mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約500-600mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約600-700mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約700-800mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約800-900mg/kg的量被施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以以約900-1000mg/kg的量被施用。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物可以每天一次被施用。根據(jù)其他實(shí)施方案，綴合物每天兩次、每天三次或更多被施用。

根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物被長(zhǎng)期施用。根據(jù)一些實(shí)施方案，綴合物持續(xù)約10天或更長(zhǎng)、20天、30天、60天、90天、120天或更長(zhǎng)被施用。

如本文定義的，治療和預(yù)防包括完全治愈狀況、部分治愈狀況使得改善發(fā)生以及預(yù)防或至少部分地預(yù)防狀況的發(fā)生。

術(shù)語(yǔ)“預(yù)防(preventing)”指在受試者中避免發(fā)生疾病、紊亂或狀況。在一些情況下，受試者可能處于發(fā)展疾病的風(fēng)險(xiǎn)中，但尚未被診斷為患有該疾病。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”指防止下一周期的疾病的發(fā)生。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“約”指±10％。

在以下實(shí)施例中更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的多個(gè)方面，這些實(shí)施例代表本發(fā)明的實(shí)施方案，并且決不意味著被解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1

在多發(fā)性硬化模型中測(cè)試綴合物MW-001的療效

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的誘導(dǎo)

在雌性C57BI小鼠(6-8周齡；Harlan)中誘導(dǎo)疾病。將髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)35-55溶解于鹽水(3mg/ml)中并用完全弗氏佐劑(CFA)(gibco；包含5mg滅活的結(jié)核分枝桿菌(MT))乳化(1:1)。將200μl的乳液(包含300μg的MOG)注射到每只小鼠的右脅腹(right flank)中，其中每只小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射接受250ng百日咳毒素(PT，List)的補(bǔ)充物。24小時(shí)后，將另外250ng的PT注射到每只小鼠的右脅腹中。從EAE后第9天每天觀察小鼠，并如下表I中描述的對(duì)臨床征象進(jìn)行評(píng)分：

表I-臨床EAE征象的評(píng)價(jià)

治療范例

將MW-001綴合物溶解于乙醇(60mg/ml)中并以50mg/kg的劑量(在鹽水中的10％儲(chǔ)備液)通過(guò)腹膜內(nèi)注射每天兩次被施用，一次在上午9點(diǎn)且一次在下午14點(diǎn)。每個(gè)劑量以0.2ml/小鼠(～20g)的體積被施用。一組動(dòng)物在第0天(指疾病的誘導(dǎo)開(kāi)始的第一天)開(kāi)始被治療，且另一組動(dòng)物在第10天(當(dāng)臨床征象最初出現(xiàn)時(shí))開(kāi)始被治療。實(shí)驗(yàn)持續(xù)一個(gè)月。

結(jié)果的解釋

疾病的發(fā)病率的計(jì)算：將每組中患病動(dòng)物的數(shù)目相加，并計(jì)算每組中患病動(dòng)物的百分比。

平均最大評(píng)分(MMS)的計(jì)算：將組中10只小鼠中的每一只的最大評(píng)分相加，并且將每組的平均最大評(píng)分計(jì)算如下：Σ每只小鼠的最大評(píng)分/該組中小鼠的數(shù)目。

組平均評(píng)分(GMS)的計(jì)算：將組中10只小鼠中每一只的評(píng)分相加，并計(jì)算每天的平均評(píng)分。將組平均評(píng)分計(jì)算如下：Σ每天每只小鼠的總評(píng)分/組中小鼠的數(shù)目。

平均最大評(píng)分(MMS)：定義為疾病嚴(yán)重程度；以0-5的規(guī)格評(píng)分，其中對(duì)于中間臨床征象以0.5的分等級(jí)進(jìn)行評(píng)分。將評(píng)分在表II中描述。

結(jié)果

*9/9(2)-一組9只動(dòng)物中的9只動(dòng)物發(fā)展為MS，其中兩只動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期間死亡。

**1/10-一組10只動(dòng)物中的1只動(dòng)物發(fā)展為MS。

如圖1和以上表II中示出的，經(jīng)治療的組呈現(xiàn)了這樣的結(jié)果：當(dāng)與未治療的組相比時(shí)在所有測(cè)試參數(shù)中顯示了施用的綴合物的效力。此外，在兩個(gè)經(jīng)治療的組之間的比較顯示，在第0天開(kāi)始的治療比在第10天開(kāi)始的治療更有效。因此，所呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了MW-001綴合物顯著地且出人意料地高度有效地預(yù)防和改善小鼠中的EAE，這出人意料地教導(dǎo)了，相同的綴合物將有效治療和/或預(yù)防多發(fā)性硬化。

實(shí)施例2

在腦炎(MS)模型中測(cè)試口服MWL-001的療效

方法

EAE的誘導(dǎo)：在雌性C57BI小鼠(6-8周齡；Harlan)中誘導(dǎo)疾病。將髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG 35-55)(Hadassah ein karem)溶解于鹽水(3mg/ml)中并用完全弗氏佐劑(CFA)(gibco；包含5mg滅活的MT)乳化(1:1)。將200微升的乳液(包含300mg的MOG)注射到右脅腹，并且每只小鼠i.p.接受250ng百日咳毒素(List)的補(bǔ)充物。24小時(shí)后，注射另外250ng的百日咳毒素(PT)。從EAE后第9天起每天觀察小鼠，并如下表III中描述的對(duì)臨床征象進(jìn)行評(píng)分。

表III：EAE臨床征象的評(píng)價(jià)。

治療范例：

將MWL-001溶解于乙醇(60mg/ml)中，其中在一組中MWL-001被ip施用，且在第二組中MWL-001以50mg/kg的劑量(在鹽水中的10％儲(chǔ)備液)通過(guò)灌胃被口服施用。將MWL-001每天一次(從第0天起)在上午9點(diǎn)施用。治療在接種后第15天結(jié)束。每個(gè)劑量以0.2ml/小鼠的體積施用。

將第三組動(dòng)物以25mg/kg的劑量在第7天開(kāi)始并在第15天結(jié)束進(jìn)行ip治療。

將第四組動(dòng)物用甲基潑尼松龍(MP，10mg/kg)在第7天開(kāi)始并在第15天結(jié)束進(jìn)行口服治療。

將第五組動(dòng)物用MP(10mg/kg)和MWL-001(25mg/kg)一起在第7天開(kāi)始并在第15天結(jié)束進(jìn)行治療。

以上五組中的每一組中的動(dòng)物數(shù)目在9和11之間。

結(jié)果的解釋?zhuān)?/p>

疾病發(fā)病率的計(jì)算：將每組中患病動(dòng)物的數(shù)目相加，并計(jì)算每組中患病動(dòng)物的百分比。

平均最大評(píng)分(MMS)的計(jì)算：將組中10只小鼠中的每一只的最大評(píng)分相加，并且將每組的平均最大評(píng)分計(jì)算如下：Σ每只小鼠的最大評(píng)分/該組中小鼠的數(shù)目。

組平均評(píng)分(GMS)的計(jì)算：將組中10只小鼠中每一只的評(píng)分相加，并計(jì)算每天的平均評(píng)分。將組平均評(píng)分計(jì)算如下：Σ每天每只小鼠的總評(píng)分/組中小鼠的數(shù)目。

結(jié)果：

發(fā)現(xiàn)每天一次口服或ip給予的50mg/kg的劑量有效抑制疾病的臨床征象。在藥物停止幾天之后，輕微的疾病征象出現(xiàn)持續(xù)一段短的時(shí)間段，如圖2中示出的。

在接種后7天給予的25mg/kg的劑量的MWL-001抑制疾病的嚴(yán)重程度(為3對(duì)比對(duì)照組中的5)，但不抑制在接種后第10-11天的疾病的出現(xiàn)，正如對(duì)照未治療的組。MP的劑量(10mg/kg)未有效抑制疾病，但兩種藥物的組合與單獨(dú)的每一種相比更有效，如圖3中示出的。

將組織病理學(xué)照片示出為圖5、6和7。圖5A-C示出對(duì)照EAE未治療的動(dòng)物的脊髓中的大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)。相比之下，如可觀察到的，與未治療的相比，在第0天以i.p.施用的MWL-001治療的動(dòng)物中可觀察到非常少的腦膜浸潤(rùn)(圖6A和B)，參見(jiàn)實(shí)施例2中的細(xì)節(jié)。

此外，在DHA-脯氨酸(MWL-001)治療的EAE動(dòng)物中(在第10天開(kāi)始的i.p.治療)，可觀察到非常少的腦膜浸潤(rùn)。此外，不存在實(shí)質(zhì)或擴(kuò)散浸潤(rùn)(圖7A和B)。

MWL-001對(duì)人類(lèi)淋巴細(xì)胞的活化的體外作用

進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)以闡明MWL-001在多發(fā)性硬化(MS)中的作用機(jī)制。認(rèn)為活化的淋巴細(xì)胞在發(fā)展MS中具有關(guān)鍵作用。

以phicoll-hypaque細(xì)胞的梯度(每孔10⁵個(gè))將單核細(xì)胞從全血分離，并在滋養(yǎng)培養(yǎng)基(包含抗生素、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、巰基乙醇和10％FCS的RPMI)中在96孔板(nunclon)中孵育，并在為T(mén)細(xì)胞的非特異性有絲分裂原的植物凝集素(PHA)的不存在或存在下孵育。將MWL-001溶解于細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中，并立即添加至細(xì)胞中。對(duì)照細(xì)胞添加了MWL-001的媒介物。

將細(xì)胞在37℃的溫度下在加濕培養(yǎng)箱中孵育4天。在第3天添加³H-胸苷，并然后收獲細(xì)胞并在β閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。結(jié)果示于圖4中。

盡管本文已闡述和描述了本發(fā)明的某些特征，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員現(xiàn)在將想到許多修改形式、替換形式、變化形式和等同物。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入本發(fā)明的真實(shí)精神內(nèi)的所有此類(lèi)修改形式和變化形式。